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문제 정의
- 미생물유래의 효소를 이용하여 상기의 기질에 대한 특이성이 규명되고 있으나 galactose의 유리가 불가능함이 입증되어[18], 결국 고중합도의 다양한 구조의 galactosyl mannooligosaccharides를 조제하기 위해서는 galactosyl mannooligosaccharides에 대한 α-galactosidase의 특이성 해명이 필수불가결하다고 볼 수 있으며, galactosyl mannooligosaccharides 및 galactomannan으로부터 α-galactosidase로 galactose를 절단하는 것이 절대 필수적이나 galactomannan의 완전가수분해에 관여하는 β-mannanase, β-mannosidase 및 α-galactosidase의 작용양식에 대한 메카니즘이 규명되지 않고 있다. 이와 같은 배경으로부터 생화학적 수법에 의한 galactomannan의 유효이용과 고도이용법을 지향하는 연구의 필요성으로 본 연구를 수행하게 되었다.
제안 방법
- Melibiose, raffinose, stachyose와 Bacillus sp., Trichoderma harzianum, Xylogone sphaerospora 유래 효소에 의한 gum galactomannan 가수분해 올리고당 시료를 각각 0.5% 당용액 0.2 mL에 sodium acetate buffer(pH 4.0) 0.2 mL, 정제 효소액 0.1 mL를 가하여 60℃에서 24시간 가수분해 반응을 진행하고, 10분간 비등에 의해 반응을 정지시킨 후 양이온 수지(amberlite IR-120, Sigma Chemical Co.)와 음이온 수지(IRA-400, Sigma Chemical Co.)에 침지하여 냉장 상에서 12시간 방치 후 TLC법에 의해 분석하였다.
- Activated carbon powder 를 100℃, 1시간 가열한 후 coulmn(3×120 cm)에 충진시키고, 증류수를 이용하여 24시간 동안 평형화 시킨 후 당 용액을 주입하고, 100 mL/hr 유속으로 tube 당 20 mL씩 ethanol 0~50%의 linear gradient하여 당을 분리 조제하였다.
- 0)으로 평형화 된 Sephadex G-100 column에 효소액 45 mL을 투여하여 16 mL/hr 유속으로 tube당 2 mL 씩 용출하였다. Fraction No. 11~16에서 specific activity가 높은 main peak가 나타나 12 mL을 회수하였으며(Fig. 1B), 본 효소액을 전기영동법에 의해 순도를 확인 후 정제효소로 기질특이성 규명에 사용하였다. 정제효소는 SDS-PAGE에 의해 단일밴드를 나타내었으며(Fig.
- activated carbon powder를 100℃, 1시간 활성화를 위하여 가열 후 방냉하여 column (3×120 cm)에 충진시키고, 증류수를 이용하여 24시간 동안 평형화 시킨 후 당용액을 주입하고, 150 mL/hr 유속으로 tube당 50 mL씩 ethanol 0~30%의 linear gradient하여 당을분리하였다. 당용액 0.2 mL와 5% phenol 0.2 mL를 혼합한후 농축 H2SO4 1 mL를 가하여 20분간 방치 후 490 nm로 흡광도를 측정하여 TLC법으로 중합도를 비교하였다. 완전히 분리되지 않은 중합도 5와 7의 mixture는 다시 회수하여 sephadex G-25를 이용해 중합도별로 분리 조제하였다.
- 유래 α-galactosidase의 효율적 정제법과 정제효소의 효소화학적 성질을 규명하고 비환원말단에 galactose를 함유하는 melibiose, raffinose 및 stachyose를 대상으로 galactose에 대한 분해능을 비교하였다.
- Mortierella sp. 유래 효소 정제는 CM-sephadex C-50 column chromatography와 Sephadex G-100 column에 의해 수행하여 SDS-전기영동에서 단일밴드를 확인하였고 분자량은 57kDa로 결정되었다. melibiose, raffinose 및 stachyose 의 세 종류의 기질에 대한 특이성에서는 Mortierella sp.
대상 데이터
- 0)로 평형화 시킨 Sephadex G-100에서 용출시켰다. Fraction collector에 모아진 활성획분은 전기영동에 의한 순도를 확인 후 정제 효소액으로 사용하였다. 정제효소는 Laemmli의 방법[7]에 의해 SDS-PAGE를 수행하였다.
- [3], Trichoderma harzianum[14] 및 Xylogone sphaerospora[12] 유래의 정제 β-mannanase에 의해 조제 및 동정 되어진 Gal3Man4(63-mono-O-α-D-galactopyranosyl-4-O-β-D-mannotetraose), Gal2,3Man5(62,3-di-O-α-D-galactopyranosyl-4-O-β-D-manno-pentaose), Gal2Man3(62-mono-O-α-D-gactopyranosyl-4-O-β-D-mannotriose), Gal2Man6(62-mono-O-α-D-galactopyranosyl-4-O-β-D-mannohexaose), Gal2Man5(62-mono-O-α-D-galactopyranosyl-4-O-β-D-mannopentaose)을 주요 기질로 사용하였다.
- 와 Bacillus sp.는 일본 쓰꾸바대학 환경생명 연구과에서, Trichoderma harzianum ATCC 32086, Xylogone sphaerospora KCCM 60478은 한국미생물보존센터에서 분양을 받아 실험에 사용하였다. 효소 활성 측정시약으로 ρ-nitrophenyl-α-galactopyranoside(Sigma Chemical Co.
- 유래정제 β-mannanase에 의해, Gal2Man3(62-mono-O-α-D-galactopyranosyl-4-O-β-D-mannotriose), Gal2Man6(62-mono-O-α-D-galactopyranosyl-4-O-β-D-manno-hexaose)은 Trichoderma harzianum 유래 정제 β-mannanase에 의해, Gal2Man3(62-mono-O-α-D-galactopyranosyl-4-O-β-D-mannotriose), Gal2Man5(62-mono-O-αD-galactopyranosyl-4-O-β-D-mannopentaose)은 Xylogone sphaerospora 유래 정제 β-mannanase에 의해 galactomannan 가수분해 올리고당을 조제하여 기질로 사용하였다.
- 효소 활성 측정시약으로 ρ-nitrophenyl-α-galactopyranoside(Sigma Chemical Co.)를, 전기영동용 주요 시약으로 acrylamide(Sigma Chemical Co.), sodium dodecyl sulfate(SDS, Bio Rad Laboraties), Tris (Hydroxymethyl aminomethane, Bio Rad Laboraties), glycine (Bio Rad Laboraties)를 사용하였다.
이론/모형
- α-Galactosidase의 활성측정은 Kaneko의 방법[5]에 따라 수행하였다.
- TLC는 McCleary법[9]에 따라 다음과 같은 조건 하에서 전개 후 spray reagent로 분무하여 140℃에서 5분간 가열하여 당을 분석하였다. TLC plate; 25 TLC plate 20×20 cm silica gel 60 F254(Merck, Germany), Developing Solvent; n-propanol : nitromethane : water = 5 : 2 : 3(v/v/v), Spray Reagent;30% sulfuric acid-ethanol.
- Trichoderma harzianum 유래 β-mannanase에 의한 gum galactomannan 가수분해 올리고당 조제는 Park[14]의 방법에 따라 효소액 300 mL에 대해 0.5%(w/ v) gum galactomannan을 60℃, 24시간 가수분해해 TLC로 pattern을 검토한 후 activated carbon column chromatography를 이용해 당을 분리하였다.
- Xylogone spharospora 유래 β-mannanase에 의한 gum galactomannan 가수분해 올리고당의 조제는 Park[12]의 방법에 따라 상기 Trichoderma harzianum 유래 β-mannanase에 의한 gum galactomannan 가수분해 올리고당 조제법과 동일하게 수행하였으며, 상기 모든 기질의 구조는 methylation method[14]에 의하여 동정하였다.
- 단백질함량은 단백질량(280 nm)과 핵산량(260 nm)의 흡광도를 UV-spectrophotometer(Shimadzu Model 1201)에서 측정하여 1.5×A280-0.75×A260의 식 및 Lowry의 방법[8]을 사용하여 단백질 농도를 확인하였다.
- 0) 으로 평형을 유지시켰다. 여기에 투석한 조효소를 0~0.3 M NaCl linear gradient법으로 용출시켰다. Fraction collector에 모아진 용출액은 단백질 양과 효소의 활성을 측정하여 비활성이 높게 나오는 Fraction별 효소액은 동일한 sodium acetate buffer(pH 5.
- 유래 β-mannanase에 의한 gum galactomannan 가수분해 올리고당 조제는 Choi[3]의 방법에 따라 효소액 300 mL에 대해 0.5%(w/v) gum galactomannan을 50℃ , 24시간 가수분해해 TLC로 pattern 을 검토한 후 activated carbon column chromatography를 이용하여 당을 분리하였다.
- Fraction collector에 모아진 활성획분은 전기영동에 의한 순도를 확인 후 정제 효소액으로 사용하였다. 정제효소는 Laemmli의 방법[7]에 의해 SDS-PAGE를 수행하였다.
성능/효과
- CM-sephadex C-50 column chromatography는 10 mM sodium acetate buffer(pH 5.0)으로 평형화 된 column에 효소액 30 mL를 투여해 45 mL/hr 유속으로 tube당 5 mL씩 용출하였으며 10 mM sodium acetate buffer(pH 5.0)에 녹인 0~0.5 M NaCl linear gradient로 농도구배법에 의한 정제를 진행한 결과 fraction No. 4~12에서 void volume의 peak가 나타났고, fraction No. 35~43에서 specific activity가 높은 main peak가 나타나 45 mL을 회수하였다(Fig. 1A). 상기 chromatogaphy에서 회수한 활성 획분을 sodium acetate buffer(pH 5.
- 5B). Xylogone sphaerospora 유래의 중합도 4의 Gal2 Man3는 Trichoderma harzianum 유래의 중합도 4와 동일한 구조로서 가수분해 시간 경과에 따른 반응말기에서 역시 galactose, mannotriose 및 잔존하는 Gal2Man3 spot이 출현하고 있어 mannotriose의 말단에서 두번째 mannose에 결합하고 있는 galactose는 유리되어지는 특이성을 확인 할 수있었다(Fig. 6A). 반면, 중합도 6인 Gal2Man5에 대해서는 mannopentaose의 환원말단부터 2번 mannose에 결합하고 있는 galactose에 대해서는 역시 특이성을 나타내지 않아 반응초기부터 말기까지 가수분해 pattern에 대한 변화를 거의 보이지 않고 있다(Fig.
- 유래 α-galactosidase는 24시간 반응후 Gal3Man3를 완전 가수분해 하여 galactose와 mannotriose 로 분해되었으며, Gal3Man4에 대해서는 12시간 반응시켜도 기질로부터 galactose 유리가 불가능함이 보고되어 있다[10]. 따라서 본 곰팡이유래 효소와 효모유래 효소의 특이성의 차이점이 있음을 확인할 수 있었으며, Penicillium. guilliermondii 및 Schwanniomyces sp.
- 유래 정제 α-galactosidase는 세 종류 기질의 비환원말단에 위치하고 있는 galactose를 모두 유리하는 특이성이 있음을 확인하였다.
- 유래 정제 α-galactosidase는 세종류 기질의 비환원말단에 위치하고 있는 galactose를 모두 유리하는 특이성이 있음을 확인할 수 있었다.
- Mortierella sp.유래 효소생산 배지조성에서 탄소원으로 galactose와 melibiose가 적합한 것으로 사료되었다. Debaryomyces sp.
- Bacillus sp. 유래의 Gal3 Man4에 대해서 반응초기 3시간부터 가수분해가 진행되어 반응말기에서는 galactose, mannotetraose 그리고 분해되지 않고 일부 남아있는 Gal3 Man4의 spot이 출현된 반면, 중합도 7의 Gal2,3Man5에 대해서는 반응초기부터 말기까지 전혀 특이성이 없음을 시사 하였다. Trichoderma harzianum 유래의 Gal2 Man3에 대해서는 반응초기 3시간부터 가수분해가 진행되어 일부 galactose 와 mannotriose spot이 출현되고 있는 반면, 중합도 7의 Gal2 Man6에 대해서는 Bacillus sp.
- 를 포함하여 Penicillium guilliermondii 가 높은 활성을 유도하였다[15]. 효모 균주에서는 galactose 대신에 melibiose를 탄소원으로 하여 효소 유도실험이 시도되고 있으나 melibiose의 단일 탄소원보다는 raffinose, melibiose, galactose 등 복합 탄소원이 효모에 적합한 것으로 시사되었다.
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