[논문]Pseudomonas aeruginosa P-5에 존재하는 polyhydroxyalkanoate synthase PhaC1과 PhaC2의 기질특이성

우상희; 이선희; 이영하

doi:10.7845/kjm.2016.6055

Pseudomonas aeruginosa P-5에 존재하는 polyhydroxyalkanoate synthase PhaC1과 PhaC2의 기질특이성
Substrate chain-length specificities of polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2 from Pseudomonas aeruginosa P-5 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.52 no.4, 2016년, pp.455 - 462

우상희 (충남대학교 미생물.분자생명과학과) , 이선희 (충남대학교 미생물.분자생명과학과) , 이영하 (충남대학교 미생물.분자생명과학과)

초록
AI-Helper

Pseudomonas aeruginosa P-5 균주는 홀수개의 탄소수를 갖는 지방산으로부터 3-hydroxyvalerate (3HV)와 medium-chain-length (MCL) 3-hydroxyalkanoates (3HAs) 단위체로 구성된 popolyhydroxyalkanoate (PHA) 공중합체를 생산하는 특이한 성질을 갖고 있다. 이 균주가 갖고 있는 2개의 MCL-PHA synthases ($PhaC1_{P-5}$와 $PhaC2_{P-5}$)의 탄소길이에 따른 기질특이성을 비교하기 위하여 각각의 유전자를 PHA 생합성능이 결여된 돌연변이주 Pseudomonas putida GPp104에 도입하고 발현시킨 결과, $PhaC2_{P-5}$는 3HV와 MCL 3HAs로 이루어진 공중합체를 생산하지만 $PhaC1_{P-5}$는 단지 MCL 3HAs로 구성된 공중합체를 생산하였다. 이는 $PhaC2_{P-5}$가 $PhaC1_{P-5}$과는 달리 보다 짧은 탄소길이의 3-hydroxyvaleryl Co-A를 기질로 인지하여 합성반응에 이용할 수 있음을 보여주는 것이다. 또한 $PhaC2_{P-5}$의 효소활성 및 기질특이성의 변화를 유도하기 위하여 위치지정 돌연변이생성을 수행하고 P. putida GPp104과 다른 PHA 생합성능 결여 돌연변이주인 Ralstonia eutropha $PHB^-4$에서 발현시킨 결과, $PhaC2_{P-5}$ 내 두 개 아미노산의 치환(Ser326Thr과 Gln482Lys)이 공중합체의 3HV 함량을 크게 증진시키는 효과를 보였다. 두 개 아미노산이 모두 치환된 $PhaC2_{P-5}$ 유전자($phaC2_{P-5}QKST$)를 갖는 P. putida GPp104를 nonanoic acid가 탄소원으로 함유된 배지에서 배양하였을 때, 모균주에 비해 공중합체 함량과 공중합체 내 3HV 함량이 각각 2.5배 및 3.5배 증가하였다. 따라서 $phaC2_{P-5}QKST$를 포함하는 재조합 균주는 개량된 물성의 신규PHAs 생산에 유용할 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Pseudomonas aeruginosa P-5 is an unusual organism capable of synthesizing polyhydroxyalkanoates (PHAs) consisting of 3-hydroxyvalerate (3HV) and medium-chain-length (MCL) 3-hydroxyalkanoate (3HA) monomer units when C-odd alkanoic acids are fed as the sole carbon source. Evaluation of the substrate chain-length specificity of two P. aeruginosa P-5 PHA synthases ($PhaC1_{P-5}$ and $PhaC2_{P-5}$) by heterologous expression of $PhaC1_{P-5}$ and $PhaC2_{P-5}$ genes in Pseudomonas putida GPp104 revealed that $PhaC2_{P-5}$ incorporates both 3HV and MCL 3HAs into PHA, whereas $PhaC1_{P-5}$ favors only MCL 3HAs for polymerization. In order to obtain $PhaC2_{P-5}$ mutants with altered substrate specificity, site-specific mutagenesis for $PhaC2_{P-5}$ was conducted. Amino acid substitutions of $PhaC2_{P-5}$ at two positions (Ser326Thr and Gln482Lys) were very effective for synthesizing copolymers with a higher 3HV fraction. When recombinant P. putida GPp104 harboring double mutated $phaC2_{P-5}$ gene ($phaC2_{P-5}QKST$) was grown on nonanoic acid, 2.5-fold increase of copolymer content with 3.8-fold increase of 3HV fraction was observed. The $phaC2_{P-5}QKST$-containing Ralstonia eutropha PHB-4 supplemented with valeric acid also produced copolymers consisting of 3HV and 3-hydroxyheptanoate with a high 3HV fraction. These results suggest that recombinants containing $phaC2_{P-5}QKST$ could be useful for production of new PHA copolymers with improved material properties.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 2012). 본 연구에서는 PhaC1_P-5과 PhaC2_P-5 효소 중 SCL-MCL-PHA 공중합체 생합성이 어느 MCL-PHA synthase에 기인하는지를 밝히기 위하여, PhaC1_P-5과 PhaC2_P-5유전자를 각각 PHA 생합성능이 결여된 돌연변이 균주(Pseudomonas putida GPp104와 Ralstonia eutropha PHB-4)에서 발현시키고 생성된 PHAs의 조성을 조사함으로써 각 효소의 기질특이성을 비교하였다. 또한 MCL-PHA synthase의 특정 아미노산 치환에 의한 효소활성 및 기질특이성의 변화를 살펴보기 위하여 위치지정 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)을 수행하였다.

제안 방법

하지만 Gln482Arg보다 Gln482Lys으로 치환한 PhaC2_P-5가 PHAs 합성율과 3HV 함량이 더 높았다. Lys482가 짧은 탄소수의 단위체를 인식하여 합성하는데 더 적합하다 판단되어 3HV의 함량을 최대한 증가시키고자 Ser326Thr와 Gln482Lys의 이중 돌연변이(double mutation; pQKST)을 진행하였다. pQKST가 삽입된 P.
GC 분석을 위한 초기 오븐온도는 60°C로 4분 동안 유지한 뒤 분당 8°C씩 280°C까지 증가시켰다. PHA 단위체의 동정은 gas chromatography-mass spectroscopy (GC/MS) 분석에 의하였다.
pGEM-T easy vector에 P. aeruginosa P-5의 phaC1_P-5와 phaC2_P-5 를 각각 클로닝 한 뒤, broad host vector로 알려진 pBBR1MCS-2 (Kovach et al., 1995)에 도입하기 위하여 제한 효소 SacI과 KpnI의 작용염기서열이 각각 전방향과 역방향에 삽입된 프라이머를 제작하였으며 앞서 클로닝된 각각의 phaC1_P-5와 phaC2_P-5의 플라스미드를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이후 증폭된 산물과 pBBR1MCS-2에 SacI과 KpnI를 처리한 뒤 연결하였으며, phaC1P-5이 도입된 plasmid를 pBRC1, phaC2_P-5가 도입된 plasmid를 pBRC2로 명명하였다(Fig.
의 아미노산 326번과 428번의 아미노산 치환을 위한 위치지정 돌연변이생성을 수행하기 위해 염기서열을 바꾼 primers인 S326X, S326rev 그리고 Q482X, Q482rev을 제작하였다(Table 2). 각각의 pBRC1과 pBRC2를 주형으로 하여 위에서 제작한 3세트의 primer를 넣고 PCR을 수행하여 아미노산 326번과 482번의 염기서열이 변경된 PCR 산물을 얻었다. PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 7분 50초 처리를 16회 반복하고 마지막 extension은 생략하였다.
본 연구에서는 PhaC1_P-5과 PhaC2_P-5 효소 중 SCL-MCL-PHA 공중합체 생합성이 어느 MCL-PHA synthase에 기인하는지를 밝히기 위하여, PhaC1_P-5과 PhaC2_P-5유전자를 각각 PHA 생합성능이 결여된 돌연변이 균주(Pseudomonas putida GPp104와 Ralstonia eutropha PHB-4)에서 발현시키고 생성된 PHAs의 조성을 조사함으로써 각 효소의 기질특이성을 비교하였다. 또한 MCL-PHA synthase의 특정 아미노산 치환에 의한 효소활성 및 기질특이성의 변화를 살펴보기 위하여 위치지정 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)을 수행하였다.
본 연구에서는 PhaC1_P-5와 PhaC2_P-5의 기능적 차이를 알아보기 위하여 클로닝 된 phaC1_P-5와 phaC2_P-5을 pBBR1MCS-2 vector에 삽입하여 pBRC1와 pBRC2를 제조하였고, 이들을 각각 PHA 생합성능이 결여된 P. putida GPp104 균주와 R. eutropha PHB-4 균주에 전기천공법을 이용하여 도입하였다. pBRC1 또는 pBRC2가 삽입된 재조합 P.
세포건조중량(dry cell weight)은 배양된 균체를 원심분리하여 수득하고, -20°C에서 얼린 뒤, 동결건조기로 하룻동안 건조시켜서 측정하였다.
Pseudomonas aeruginosa P-5 균주는 홀수개의 탄소수를 갖는 지방산으로부터 3-hydroxyvalerate (3HV)와 mediumchain-length (MCL) 3-hydroxyalkanoates (3HAs) 단위체로 구성된 popolyhydroxyalkanoate (PHA) 공중합체를 생산하는 특이한 성질을 갖고 있다. 이 균주가 갖고 있는 2개의 MCLPHA synthases (PhaC1_P-5와 PhaC2_P-5)의 탄소길이에 따른 기질특이성을 비교하기 위하여 각각의 유전자를 PHA 생합성능이 결여된 돌연변이주 Pseudomonas putida GPp104에 도입하고 발현시킨 결과, PhaC2_P-5는 3HV와 MCL 3HAs로 이루어진 공중합체를 생산하지만 PhaC1_P-5는 단지 MCL 3HAs로 구성된 공중합체를 생산하였다. 이는 PhaC2_P-5가 PhaC1_P-5과는 달리 보다 짧은 탄소길이의 3-hydroxyvaleryl Co-A를 기질로 인지하여 합성반응에 이용할 수 있음을 보여주는 것이다.
이러한 결과들을 바탕으로 P. aeruginosa P-5의 PhaC2P-5 역시 Ser326을 Thr326로, Gln482을 Lys482 또는 Arg482로 치환한 돌연변이 플라스미드를 제작하였다. 아미노산이 치환된 pBRC2는 PHAs 합성을 위해 P.
, 1995)에 도입하기 위하여 제한 효소 SacI과 KpnI의 작용염기서열이 각각 전방향과 역방향에 삽입된 프라이머를 제작하였으며 앞서 클로닝된 각각의 phaC1_P-5와 phaC2_P-5의 플라스미드를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이후 증폭된 산물과 pBBR1MCS-2에 SacI과 KpnI를 처리한 뒤 연결하였으며, phaC1P-5이 도입된 plasmid를 pBRC1, phaC2_P-5가 도입된 plasmid를 pBRC2로 명명하였다(Fig. 1).

대상 데이터

phaC2_P-5의 아미노산 326번과 428번의 아미노산 치환을 위한 위치지정 돌연변이생성을 수행하기 위해 염기서열을 바꾼 primers인 S326X, S326rev 그리고 Q482X, Q482rev을 제작하였다(Table 2). 각각의 pBRC1과 pBRC2를 주형으로 하여 위에서 제작한 3세트의 primer를 넣고 PCR을 수행하여 아미노산 326번과 482번의 염기서열이 변경된 PCR 산물을 얻었다.

이론/모형

생성된 PHAs의 회수 및 정제는 Lee 등(2011)의 방법으로 수행하였다. PHA의 정량 및 정성 분석은 PHB와 polyhydroxyoctanoate를 표준시료로 하여 gas chromatography 방법을 이용하였다. GC 분석을 위한 초기 오븐온도는 60°C로 4분 동안 유지한 뒤 분당 8°C씩 280°C까지 증가시켰다.
세포건조중량(dry cell weight)은 배양된 균체를 원심분리하여 수득하고, -20°C에서 얼린 뒤, 동결건조기로 하룻동안 건조시켜서 측정하였다. 생성된 PHAs의 회수 및 정제는 Lee 등(2011)의 방법으로 수행하였다. PHA의 정량 및 정성 분석은 PHB와 polyhydroxyoctanoate를 표준시료로 하여 gas chromatography 방법을 이용하였다.
aeruginosa P-5의 PhaC2P-5 역시 Ser326을 Thr326로, Gln482을 Lys482 또는 Arg482로 치환한 돌연변이 플라스미드를 제작하였다. 아미노산이 치환된 pBRC2는 PHAs 합성을 위해 P. putida GPp104와 R. eutropha PHB-4에 전기천공법을 통해 삽입하였다. 야생형 PhaC2_P-5와 비교해 보았을 때 단일 돌연변이(single mutation)된 PhaC2_P-5 모두 PHA 합성과 3HV 비율이 증가되는 것을 확인하였다 (Table 4).
PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 7분 50초 처리를 16회 반복하고 마지막 extension은 생략하였다. 위에서 얻어진 pBRC1와 pBRC2, 그리고 phaC2P-5의 아미노산 326번과 428번이 mutation된 plasmids는 PHA 합성 negative 균주인 P. putida GPp104와 R. eutropha PHB-4에 전기천공법(electroporation) 방법(Iwasaki et al., 1994)을 이용하여 삽입하였다.

성능/효과

putida GPp104과 다른 PHA 생합성능 결여 돌연변이주인 Ralstonia eutropha PHB4에서 발현시킨 결과, PhaC2_P-5 내 두 개 아미노산의 치환(Ser326Thr 과 Gln482Lys)이 공중합체의 3HV 함량을 크게 증진시키는 효과를 보였다. 두 개 아미노산이 모두 치환된 PhaC2_P-5 유전자 (phaC2_P-5QKST)를 갖는 P. putida GPp104를 nonanoic acid가 탄소원으로 함유된 배지에서 배양하였을 때, 모균주에 비해 공중합체 함량과 공중합체 내 3HV 함량이 각각 2.5배 및 3.5배 증가하였다. 따라서 phaC2_P-5QKST를 포함하는 재조합 균주는 개량된 물성의 신규PHAs 생산에 유용할 것으로 기대된다.
2배 증가하였다(Table 4). 따라서 PhaC2P-5의 Ser326와 Gln482가 3HV를 인식하고 공중합체로 합성하는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. PhaC2P-5의 위치지정 돌연변이 생성을 통해 같은 배양조건에서 다양한 조성을 가지는 공중합체를 합성할 수 있고 물성이 다른 PHAs를 생산함으로써 PHA의 응용범위를 넓힐 수 있다는 점에서 phaC2P-5QKST를 포함하는 재조합균주는 산업적으로 유용할 것으로 기대된다.
이는 PhaC2_P-5가 PhaC1_P-5과는 달리 보다 짧은 탄소길이의 3-hydroxyvaleryl Co-A를 기질로 인지하여 합성반응에 이용할 수 있음을 보여주는 것이다. 또한 PhaC2_P-5 의 효소활성 및 기질특이성의 변화를 유도하기 위하여 위치지정 돌연변이생성을 수행하고 P. putida GPp104과 다른 PHA 생합성능 결여 돌연변이주인 Ralstonia eutropha PHB4에서 발현시킨 결과, PhaC2_P-5 내 두 개 아미노산의 치환(Ser326Thr 과 Gln482Lys)이 공중합체의 3HV 함량을 크게 증진시키는 효과를 보였다. 두 개 아미노산이 모두 치환된 PhaC2_P-5 유전자 (phaC2_P-5QKST)를 갖는 P.
이러한 결과로 PhaC1P-5와 PhaC2P-5는 상이한 기질특이성을 가지고 있으며, 그 중 PhaC2P-5가 SCL-MCL-PHAs를 생합성 하는데 기여한다는 사실을 알 수 있었다. 또한 PhaC2P-5는 발현되는 균주와 탄소원에 따라서 3HV 비율이 크게 다른 SCLMCL-PHAs을 합성할 수 있는 것으로 나타났는데, 이는 PHA 단위체 조성의 조절을 통하여 서로 다른 물성의 바이오고분자를 생산할 수 있다는 점에서 매우 유용한 특징이라 할 수 있다.
eutropha PHB-4에 전기천공법을 통해 삽입하였다. 야생형 PhaC2_P-5와 비교해 보았을 때 단일 돌연변이(single mutation)된 PhaC2_P-5 모두 PHA 합성과 3HV 비율이 증가되는 것을 확인하였다 (Table 4). 하지만 Gln482Arg보다 Gln482Lys으로 치환한 PhaC2_P-5가 PHAs 합성율과 3HV 함량이 더 높았다.
이 균주로부터 생산되는 공중합체 내 3HV의 함량은 탄소원에 따라 5–10 mol% 수준이나, valeric acid를 보조기질로 첨가 시 26 mol%까지 크게 증진될 수 있었다.
하지만 pBRC1이 도입된 균주에서는 3-hydroxynonanoate (3HN) 와 3-hydroxyundecanoate (3HU)가 주를 이루는 MCL-PHAs 만 합성되었다(Table 3). 이 실험 결과를 통하여 PhaC1P-5는 긴탄소수의 MCL-3HAs 만을 인식하여 합성하는 역할을 하고 PhaC2P-5는 SCL-3HAs인 3HV부터 MCL-3HAs까지 보다 광범위한 기질특이성을 가지고 있는 것으로 판단되었다. 재조합 R.
4l% 함유된 SCL-MCL-PHAs를 합성하였다(Table 3). 이러한 결과로 PhaC1P-5와 PhaC2P-5는 상이한 기질특이성을 가지고 있으며, 그 중 PhaC2P-5가 SCL-MCL-PHAs를 생합성 하는데 기여한다는 사실을 알 수 있었다. 또한 PhaC2P-5는 발현되는 균주와 탄소원에 따라서 3HV 비율이 크게 다른 SCLMCL-PHAs을 합성할 수 있는 것으로 나타났는데, 이는 PHA 단위체 조성의 조절을 통하여 서로 다른 물성의 바이오고분자를 생산할 수 있다는 점에서 매우 유용한 특징이라 할 수 있다.

후속연구

따라서 PhaC2P-5의 Ser326와 Gln482가 3HV를 인식하고 공중합체로 합성하는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. PhaC2P-5의 위치지정 돌연변이 생성을 통해 같은 배양조건에서 다양한 조성을 가지는 공중합체를 합성할 수 있고 물성이 다른 PHAs를 생산함으로써 PHA의 응용범위를 넓힐 수 있다는 점에서 phaC2P-5QKST를 포함하는 재조합균주는 산업적으로 유용할 것으로 기대된다.
5배 증가하였다. 따라서 phaC2_P-5QKST를 포함하는 재조합 균주는 개량된 물성의 신규PHAs 생산에 유용할 것으로 기대된다.
이 균주로부터 생산되는 공중합체 내 3HV의 함량은 탄소원에 따라 5–10 mol% 수준이나, valeric acid를 보조기질로 첨가 시 26 mol%까지 크게 증진될 수 있었다. 이처럼 SCL 단위체와 MCL 단위체가 같이 존재하는 SCL-MCL-PHA 공중합체는 매우 특이한 고분자로서 기존의 SCL-PHAs 및 MCL-PHAs와는 확연히 구분되는 물성을 가짐으로써 미생물고분자의 산업적 응용 범위를 확장시키는데 유용할 것으로 기대된다. 또한 P.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Pseudomonas aeruginosa P-5 균주란 어떤 균주인가?	최근 본 저자들의 연구실에서는 nonanoic acid, heptanoic acid와 같이 홀수개의 탄소수를 갖는 alkanoic acids를 탄소원 으로 공급하였을 때, MCL 3HAs 이외에 3-hydroxyvalerate (3HV)를 단위체로 하는 공중합체를 생합성하는 Pseudomonas aeruginosa P-5 균주를 보고한 바 있다(Woo et al., 2012).
	PHA 생합성 균주들이 서로 다른 탄소사슬길이를 갖는 PHA synthase 의 기질특이성을 가지는데, 그 예시로는 어떤 것이 있는가?	지금까지 발견된 대부분의 PHA 생합성 균주들의 경우 SCL-PHAs와 MCL-PHAs 중 한 가지만을 생합성할 수 있는데, 이러한 특징은 서로 다른 탄소사슬 길이 를 가지는 (R)-hydroxyalkanoyl-CoAs에 대한 PHA synthases 의 기질특이성(substrate specificity)에 기인한다. 즉, SCL-PHAs 생합성 미생물은 탄소수가 5 이하인 (R)-hydroxyalkanoyl-CoAs 에만 선택적 특이성을 보이는 SCL-PHA synthase를 보유하는 데 반하여, MCL-PHAs 생합성 미생물은 탄소수가 6 이상인 (R)-hydroxyalkanoyl-CoAs에 기질특이성을 나타내는 MCL-PHA synthase를 갖고 있다(Kim et al., 2007).
	PHAs는 어떤 고분자인가?	Poly (3-hydroxyalkanoates) (PHAs)는 과량의 탄소원이 존 재하지만 질소, 인, 황과 같은 영양분이결핍되거나 용존산소의 농도가 낮은 불균형 영양조건하에서, 탄소 및 에너지원으로 사용하기 위하여 세균 세포 내에 축적되는 저장성 폴리에스터 고분자이다(Steinbüchel and Lütke-Eversloh, 2003). PHAs 는 합성플라스틱과는 달리 재생자원을 발효기질로 사용하여 생산될 수 있고 생분해성 및 생체친화성이 우수하기 때문에 식품, 정밀화학, 의료용 소재 등의 다양한 분야에서 합성고분자를 대체하여 사용될 수 있는 미생물고분자로 큰 관심을 모으고 있다(Akaraonye et al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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