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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 유산균으로 울금을 발효하여 울금의 유효성분인 비스디메톡시커큐민과 디메톡시커큐민의 함량비를 증가시키고 수용액상으로 커큐민의 추출율을 높여 생체이용률을 증가시킴으로써 다량의 외부 항원에 의해 유발될 수 있는 알레르기성 질환의 예방 및 치료 가능성을 확인하였다.
- 인도산 울금 분말을 bifidobacteria와 lactobacilli를 포함한 프로바이오틱 유산균으로 발효한 시료들의 소염활성 정도를 세포 내 염증성 인자들의 발현양을 관찰함으로써 평가하였다. 그 중 L.
제안 방법
- 5, 125, 250 µg/mL의 농도로 DMSO에 현탁하여 처리하였다. 18시간 배양 후 세포를 회수하여 lysis buffer(50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA)로 세포를 파쇄하였고 세포 파쇄액은 8% SDS-PAGE를 통해 전기영동한 후 PVDF membrane에 transfer하고 COX-2(Cell Signaling Technology), iNOS(Cell Signaling Technology) antibody로 immunoblotting하여 각각의 발현양을 비교 분석했다.
- 단시간 내 과량의 항원에 노출될 경우 나타날 수 있는 급작형 과민반응에 대한 발효 울금 원료의 저해효과를 확인하기 위해 PCA assay를 실시하였다[3, 6, 15]. Anti-DNP IgE를 마우스의 양쪽 귀에 투여 후 미정맥을 통해 과량의 항원을 투여하여 급작형 과민반응을 유발함으로써 혈관 투과성을 증가시켰다. 항원으로 사용한 DNP-HSA과 evans blue 혼합물은 증가된 혈관 투과성으로 인해 조직으로 침투하여 조직에 존재하던 anti-DNP IgE와 결합함으로써 조직이 파란색을 띄게 되고 이를 정량함으로써 급작형 과민반응 정도를 확인하였다(Fig.
- LPS로 활성화된 raw 264.7 세포주에 주정침전법을 이용해서 제조한 울금 2차 분석시료(20 µL/well)를 처리한 뒤 18시간 동안 배양하고 세포를 회수하였다.
- LPS에 의해 활성화된 raw 264.7 세포주에 주정 침전법으로 제조한 발효 울금 시료와 비발효 시료를 각 20 µL씩 처리하여 18시간 동안 배양한 후 전염증성 cytokine인 TNF-α와 IL-6의 mRNA level을 측정하였다(Fig. 3A).
- Mite extract 연고를 이용해서 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스 모델에서 발효 울금 원료의 아토피 피부염 저해효과를 확인하였다. 전체 실험기간 중 총 8회에 걸쳐 아토피 피부염의 증상을 기록하였다(Fig.
- PCR반응은 94oC에서 2분간 pre-denaturation 후 GAPDH와 TNF-α는 94oC에서30초, 60oC에서 45초, 72oC에서 45초 반응을 진행시켰고 IL-6는 94oC에서 30초, 61oC에서 45초, 72oC에서 45초 반응시켜 총 25회 증폭시킨 다음 72oC에서 1분 동안 마지막 extension을 실시하였다. PCR 결과는 GelRed가 포함된 1.5% agarose gel에 전기영동한 뒤 확인하였다.
- PCR반응은 94oC에서 2분간 pre-denaturation 후 GAPDH와 TNF-α는 94oC에서30초, 60oC에서 45초, 72oC에서 45초 반응을 진행시켰고 IL-6는 94oC에서 30초, 61oC에서 45초, 72oC에서 45초 반응시켜 총 25회 증폭시킨 다음 72oC에서 1분 동안 마지막 extension을 실시하였다.
- 실험에 사용한 울금 분말은 인도산 울금을 건조시켜 분쇄한 것으로 서울 제기동 소재의 산들약초에서 구입하였고, 5종의 프로바이오틱 유산균 Bifidobacterium longum IDCC 4101, Lactobacillus gasseri IDCC 9206, Lactobacillus plantarum IDCC 9205, Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201, Lactobacillus johnsonii IDCC 9203를 이용하여 발효를 진행하였다(IDCC, ILDONG Culture Collection). 각 유산균은 de Man-Rogosa-Sharpe(MRS, Difco) 배지를 이용하여 전배양과 중간배양을 실시한 뒤 울금 분말 5%, glucose (Samchun chemical) 1%, bacto peptone(Difco) 0.5%가 함유된 배지 40 mL에 5%(v/v) 접종하여 본배양을 진행하였다.
- 실험동물은 PCA를 유발하지 않은 PCA 음성군, PBS를 경구투여한 vehicle군, 340 mg/kg의 양으로 비발효 울금 원료를 경구투여한 대조 실험군, 340 mg/kg의 발효 울금 원료를 경구투여한 실험군 등 총 4군으로 구성하였다. 계류 후 2주일 동안 시료를 전투여했고, 전투여 종료일에 PCA를 유발시켰다. 유발 1일차에는 유발군 마우스의 양쪽 귀에 10 µg/mL의 anti-dinitrophenyl(DNP)-IgE를 20 µL씩 피내투여하였고, 24시간 후 DNP-human serum albumin(HSA)과 1% evans blue를 동량으로 혼합한 항원용액 200 µL를 마우스의 정맥에 투여하여 PCA를 유발시켰다.
- 7 세포주에 주정침전법을 이용해서 제조한 울금 2차 분석시료(20 µL/well)를 처리한 뒤 18시간 동안 배양하고 세포를 회수하였다. 그 후 TRIsure reagent(Bioline)로 각 세포의 total RNA를 회수한 뒤 oligo-dT primer(Promega)와 MMLV reverse transcriptase(Super-Bio)를 이용해서 역전사 반응을 진행하였다. PCR 분석에 사용한 각 cytokine의 primer는 다음과 같다.
- 5배의 ethyl acetate로 3회 추출하였다. 그 후 감압농축기로 ethyl acetate를 제거한 뒤 methanol에 1,000 ppm의 농도로 용해시켜 HPLC 분석을 진행하였다[10]. 분석기기는 Thermo Separation Product HPLC system을 사용하였으며 HPLC 조건으로 column은 ODS-H80(150×4.
- 7 mM)를 이용해 10배 농축액을 만들어 2차 분석 시료를 제조하였다. 대조군으로 사용한 시료는 울금 분말 5%, glucose 1%, bacto peptone 0.5%가 함유된 본배양 배지를 121oC에서 15분 동안 멸균하여 열수추출 하였고, 이를 원심분리하여 상등액을 회수한 후 위와 동일한 방법으로 감압농축 및 주정 침전을 실시하여 제조하였다.
- 발효 울금 원료와 비발효 울금 원료의 소염활성을 측정하기 위해서 western blot assay를 실시하였다. 두 원료는 DMSO에 현탁한 뒤 LPS를 이용해 활성화된 raw 264.7 세포주에 농도별로 처리하고 염증 매개인자인 COX-2와 iNOS의 발현양을 측정하여 발효 울금 원료의 소염활성을 평가하였다(Fig. 3B). 비발효 울금 원료 처리시에는 음성 대조군과 비슷한 수준으로 COX-2와 iNOS의 발현을 저해하지 못하였다.
- 마우스의 혈청 내에 IgE 변화를 측정하기 위해 아토피 피부염 유발 종료 시점에서 안와채혈을 실시하였다. 회수한 혈액은 원심분리하여 혈청을 분리하고 IgE ELISA kit(Shibayagi)를 이용해서 혈중 IgE의 농도를 정량 하였다.
- 발효 울금 원료에 함유된 커큐민과 그 유도체인 디메톡시커큐민, 비스디메톡시커큐민의 함량을 측정하기 위해 정량 분석을 실시하였다. 커큐민을 추출하기 위해서 발효 및 비발효 울금원료 2g을 10 mL의 DW에 현탁한 후 2.
- 소염활성 측정에 사용한 시료의 제조는 다음과 같다. 배양 종료 후 pH를 7.0으로 보정한 뒤 원심분리를 통해 상등액을 회수하였고 감압 농축기(EYELA, OSB-2100)를 이용해 상등액을 10배 농축하여 1차 분석 시료를 제조하였다. 2차 분석 시료를 제조하기 위해서 1차 분석 시료에 주정을 처리하여 침전물을 제거하였고, 상등액을 다시 회수해 감압농축기로 시료를 농축하였다.
- 배양액을 이용해서 제조한 1, 2차 분석시료는 20 µL씩 처리하였고, 발효 및 비발효 울금 원료는 각각 62.5, 125, 250 µg/mL의 농도로 DMSO에 현탁하여 처리하였다.
- 세포의 배양은 10% fetal bovine serum(FBS)과 0.2% gentamycin(25 mg/mL)을 첨가한 Dulbeco’s modified eagle’s medium(DMEM)을 사용하였으며, 37oC,5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
- 세포주를 활성화 시키기 위해 2 µg/mL의 LPS(lipopolysaccharide, Sigma)를 처리하였으며 여러 가지 농도(62.5, 125, 250 µg/ mL)의 시료와 양성 대조군을 처리한 후 18시간 동안 배양하였다.
- 5주령 자성 NC/Nga 마우스는 1주일 계류 후 각 시료를 1주일 동안 전투여하였다. 실험동물은 비유발군, PBS를 경구투여한 vehicle군, 5 mg/kg의 dexamethasone을 경구투여한 양성 대조군, 340 mg/kg의 발효 울금 원료를 경구투여한 시료 투여군으로 나누어 총 4개의 실험군을 설정하였다. 전투여가 종료된 후 5주 동안 주 5회 시료투여를 지속하면서 마리당 100 mg의 mite extract ointment(AD Biostir)로 아토피 피부염을 유발하였다.
- 아토피 유발 마우스의 혈청 내 IgE의 양을 비교하기 위해 아토피 피부염 유발 종료시점에서 혈액을 채취하여 혈중 IgE 농도를 분석하였다(Fig. 4B). 실험 결과 발효 울금 투여군에서는 mite extract에 의한 IgE의 증가를 비유발군 수준으로 유의적으로 감소시켰다.
- 전투여가 종료된 후 5주 동안 주 5회 시료투여를 지속하면서 마리당 100 mg의 mite extract ointment(AD Biostir)로 아토피 피부염을 유발하였다. 아토피 피부염의 유발은 주 2회로 총 3주 동안 실시하였다. 전투여 기간을 포함해서 총 6주의 실험기간 중 8회에 걸쳐 증상을 기록했는데, 아토피 피부염 유발 전 최초 1회 증상을 기록하였고 4번째 유발 뒤부터 7회에 걸쳐 증상 변화를 기록하였다.
- 세포의 준비 및 활성화는 western blot assay에서와 동일하게 준비하였다. 양성 대조군으로는 8uM dexamethasone(Sigma)을 사용하였고 비발효 울금 시료와 함께 효능을 평가하였다. LPS로 활성화된 raw 264.
- 유산균 발효는 총 3단계 배양을 통해 진행되었다. 우선 MRS broth를 이용해서 전배양과 중간배양을 진행하였고 배양액에 포함되어 있는 유산균이 대수증식기에 이르렀을 때 본배양 배지에 접종하여 최종 발효하였다. 울금 본배양 배지는 유산균이 울금을 최대한 이용하도록 유도하기 위해 1% glucose와 0.
- 울금 발효 종료 후 배양액을 이용해서 발효 울금 원료를 제조하였다. 울금 배양액에서 유효성분만 따로 추출하여 보관 및 사용이 편리한 발효 울금 원료를 제조 후 실험에 사용하였다.
- 울금 발효물의 소염활성 정도를 측정하기 위해 역전사 중합반응을 실시하였다. 세포의 준비 및 활성화는 western blot assay에서와 동일하게 준비하였다.
- 울금 배양액과 울금 열수추출물의 소염활성을 측정하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. LPS에 의해 활성화된 raw 264.
- 우선 MRS broth를 이용해서 전배양과 중간배양을 진행하였고 배양액에 포함되어 있는 유산균이 대수증식기에 이르렀을 때 본배양 배지에 접종하여 최종 발효하였다. 울금 본배양 배지는 유산균이 울금을 최대한 이용하도록 유도하기 위해 1% glucose와 0.5% Bacto peptone이 포함된 최소배지에 울금 분말을 3% 첨가하여 제조하였으며 배양액의 pH는 보정하지 않았다. 대수증식기에 이른 중간배양액을 본배양 배지가 들어있는 5 L jar fermentor에 5% 접종 후 50 rpm의 속도로 교반하면서 21시간 동안 배양하였다.
- 울금의 대표적 유효성분 중 하나인 커큐민을 포함한 그 유도체(디메톡시커큐민, 비스디메톡시커큐민)의 함량과 성분비율이 발효에 의해서 변화되는지를 확인하기 위하여 HPLC를 이용한 정량분석을 실시하였다. 이들 유도체들은 메톡시 그룹의 유무에 따라 커큐민과 구분되며 LC/MS 분석을 통해 커큐민의 유도체인 디메톡시커큐민과 비스디메톡시커큐민이 커큐민 peak 앞쪽에서 분리됨을 확인하였다(Data not shown).
- 유발 1일차에는 유발군 마우스의 양쪽 귀에 10 µg/mL의 anti-dinitrophenyl(DNP)-IgE를 20 µL씩 피내투여하였고, 24시간 후 DNP-human serum albumin(HSA)과 1% evans blue를 동량으로 혼합한 항원용액 200 µL를 마우스의 정맥에 투여하여 PCA를 유발시켰다.
- 유산균을 이용한 울금 발효시 커큐민의 함량 증가와 더불어 커큐민 유도체의 성분비도 변화하였다. 울금을 L.
- johnsonii IDCC 9203으로 발효한 시료의 소염 활성이 가장 뛰어났다. 이를 바탕으로 울금 분말을 포함한 본배양 배지에서 L. johnsonii IDCC 9203으로 21시간 동안 배양 후 얻은 상등액으로 발효 울금 원료를 제조하였고, 제조된 발효 울금 원료에 대한 소염활성 효능을 테스트하기 위해 LPS로 활성화된 raw 264.7 세포주에 처리하고 COX-2와 iNOS의 발현양을 확인하였다. 그 결과 발효 울금 원료 250µg/mL까지 농도 의존적으로 COX-2와 iNOS의 발현을 감소시켰으며, 그 저해 활성은 동일 농도의 비발효 울금 원료보다 강하였다.
- johnsonii IDCC 9203으로 울금 발효시 지용성 커큐민이 수용성으로 전환되기 때문으로 예상된다. 이를 확인하기 위해 울금 배양액과 울금 열수추출물에서 수용성 커큐민의 함량을 측정하였다(Fig. 6B). 발효 울금 원료에서는 총 커큐민 중 30.
- Mite extract 연고를 이용해서 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스 모델에서 발효 울금 원료의 아토피 피부염 저해효과를 확인하였다. 전체 실험기간 중 총 8회에 걸쳐 아토피 피부염의 증상을 기록하였다(Fig. 4A). 실험결과 아토피 피부염 비유발군은 실험기간 중 아토피증상이 심화되지 않은 반면 mite extract를 처리하여 아토피 유발 후 PBS를 투여한 vehicle군은 4차, 6차 유발 종료 후 증상이 심하게 악화되다가 완화되었다.
- 아토피 피부염의 유발은 주 2회로 총 3주 동안 실시하였다. 전투여 기간을 포함해서 총 6주의 실험기간 중 8회에 걸쳐 증상을 기록했는데, 아토피 피부염 유발 전 최초 1회 증상을 기록하였고 4번째 유발 뒤부터 7회에 걸쳐 증상 변화를 기록하였다. 증상의 점수는 홍반/출혈, 건조/상처, 부종, 짓무름/찰과상, 태선화로 구분하여 각 평가항목에 0~3점의 점수를 부과하여 채점하였다[20, 21].
- 실험동물은 비유발군, PBS를 경구투여한 vehicle군, 5 mg/kg의 dexamethasone을 경구투여한 양성 대조군, 340 mg/kg의 발효 울금 원료를 경구투여한 시료 투여군으로 나누어 총 4개의 실험군을 설정하였다. 전투여가 종료된 후 5주 동안 주 5회 시료투여를 지속하면서 마리당 100 mg의 mite extract ointment(AD Biostir)로 아토피 피부염을 유발하였다. 아토피 피부염의 유발은 주 2회로 총 3주 동안 실시하였다.
- 전투여 기간을 포함해서 총 6주의 실험기간 중 8회에 걸쳐 증상을 기록했는데, 아토피 피부염 유발 전 최초 1회 증상을 기록하였고 4번째 유발 뒤부터 7회에 걸쳐 증상 변화를 기록하였다. 증상의 점수는 홍반/출혈, 건조/상처, 부종, 짓무름/찰과상, 태선화로 구분하여 각 평가항목에 0~3점의 점수를 부과하여 채점하였다[20, 21].
- 발효 울금 원료에 함유된 커큐민과 그 유도체인 디메톡시커큐민, 비스디메톡시커큐민의 함량을 측정하기 위해 정량 분석을 실시하였다. 커큐민을 추출하기 위해서 발효 및 비발효 울금원료 2g을 10 mL의 DW에 현탁한 후 2.5배의 ethyl acetate로 3회 추출하였다. 그 후 감압농축기로 ethyl acetate를 제거한 뒤 methanol에 1,000 ppm의 농도로 용해시켜 HPLC 분석을 진행하였다[10].
- 유발 1일차에는 유발군 마우스의 양쪽 귀에 10 µg/mL의 anti-dinitrophenyl(DNP)-IgE를 20 µL씩 피내투여하였고, 24시간 후 DNP-human serum albumin(HSA)과 1% evans blue를 동량으로 혼합한 항원용액 200 µL를 마우스의 정맥에 투여하여 PCA를 유발시켰다. 항원 투입 30분 후 마우스를 치사하여 귀를 적출하고, 1 N KOH를 이용해 적출한 귀 조직으로부터 evans blue를 침출시킨 후 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정량은 evans blue 표준곡선을 이용하였다.
- Anti-DNP IgE를 마우스의 양쪽 귀에 투여 후 미정맥을 통해 과량의 항원을 투여하여 급작형 과민반응을 유발함으로써 혈관 투과성을 증가시켰다. 항원으로 사용한 DNP-HSA과 evans blue 혼합물은 증가된 혈관 투과성으로 인해 조직으로 침투하여 조직에 존재하던 anti-DNP IgE와 결합함으로써 조직이 파란색을 띄게 되고 이를 정량함으로써 급작형 과민반응 정도를 확인하였다(Fig. 5). 발효 울금 원료 투여군에서는 유의적인 evans blue 농도 감소가 관찰된 반면 비발효 울금 원료 투여군에서는 유의적인 감소가 보이지 않았다.
- 마우스의 혈청 내에 IgE 변화를 측정하기 위해 아토피 피부염 유발 종료 시점에서 안와채혈을 실시하였다. 회수한 혈액은 원심분리하여 혈청을 분리하고 IgE ELISA kit(Shibayagi)를 이용해서 혈중 IgE의 농도를 정량 하였다.
대상 데이터
- 발효 울금 원료의 아토피 피부염 저해 및 예방효과를 확인하기 위해서 NC/Nga 마우스(중앙실험동물)를 이용해서 동물실험을 진행하였다. 5주령 자성 NC/Nga 마우스는 1주일 계류 후 각 시료를 1주일 동안 전투여하였다. 실험동물은 비유발군, PBS를 경구투여한 vehicle군, 5 mg/kg의 dexamethasone을 경구투여한 양성 대조군, 340 mg/kg의 발효 울금 원료를 경구투여한 시료 투여군으로 나누어 총 4개의 실험군을 설정하였다.
- 1과 같다. 대조군으로 사용한 비발효 울금은 울금 발효를 위한 본배양 배지를 열수추출 후 Fig. 1과 동일한 공정으로 제조하였다.
- 발효 울금 원료의 아토피 피부염 저해 및 예방효과를 확인하기 위해서 NC/Nga 마우스(중앙실험동물)를 이용해서 동물실험을 진행하였다. 5주령 자성 NC/Nga 마우스는 1주일 계류 후 각 시료를 1주일 동안 전투여하였다.
- 본 실험에서 이용한 Raw 264.7 세포주는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포의 배양은 10% fetal bovine serum(FBS)과 0.
- 실험을 위해 5주령 자성 ICR 마우스를 중앙실험동물로부터 구입하였고 1주일 동안 계류하였다. 실험동물은 PCA를 유발하지 않은 PCA 음성군, PBS를 경구투여한 vehicle군, 340 mg/kg의 양으로 비발효 울금 원료를 경구투여한 대조 실험군, 340 mg/kg의 발효 울금 원료를 경구투여한 실험군 등 총 4군으로 구성하였다. 계류 후 2주일 동안 시료를 전투여했고, 전투여 종료일에 PCA를 유발시켰다.
- 실험에 사용한 울금 분말은 인도산 울금을 건조시켜 분쇄한 것으로 서울 제기동 소재의 산들약초에서 구입하였고, 5종의 프로바이오틱 유산균 Bifidobacterium longum IDCC 4101, Lactobacillus gasseri IDCC 9206, Lactobacillus plantarum IDCC 9205, Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201, Lactobacillus johnsonii IDCC 9203를 이용하여 발효를 진행하였다(IDCC, ILDONG Culture Collection). 각 유산균은 de Man-Rogosa-Sharpe(MRS, Difco) 배지를 이용하여 전배양과 중간배양을 실시한 뒤 울금 분말 5%, glucose (Samchun chemical) 1%, bacto peptone(Difco) 0.
- 발효 울금 원료의 즉각형 과민반응에 대한 억제 및 예방효과를 확인하기 위해서 PCA(Passive cutaneous anaphylaxis) 모델을 확립하였다[3, 6, 15]. 실험을 위해 5주령 자성 ICR 마우스를 중앙실험동물로부터 구입하였고 1주일 동안 계류하였다. 실험동물은 PCA를 유발하지 않은 PCA 음성군, PBS를 경구투여한 vehicle군, 340 mg/kg의 양으로 비발효 울금 원료를 경구투여한 대조 실험군, 340 mg/kg의 발효 울금 원료를 경구투여한 실험군 등 총 4군으로 구성하였다.
- 울금 발효를 위해 유산균 L. johnsonii IDCC 9203을 사용하였다. 유산균 발효는 총 3단계 배양을 통해 진행되었다.
- 울금 발효 종료 후 배양액을 이용해서 발효 울금 원료를 제조하였다. 울금 배양액에서 유효성분만 따로 추출하여 보관 및 사용이 편리한 발효 울금 원료를 제조 후 실험에 사용하였다. 발효 울금 원료 제조공정은 Fig.
- 분석 시료는 10 µL를 injection하였고 UV 450 nm 파장에서 분석하였다. 정량에 사용한 커큐민 표준품은 Sigma에서 구입하였다.
- 항원 투입 30분 후 마우스를 치사하여 귀를 적출하고, 1 N KOH를 이용해 적출한 귀 조직으로부터 evans blue를 침출시킨 후 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정량은 evans blue 표준곡선을 이용하였다.
데이터처리
- 실험으로부터 얻은 모든 결과는 mean ± SEM으로 나타내었고 independent t-test를 이용하여 통계처리 한 후 p<0.05 이하에서 각 시료간의 유의적인 차이를 검증하였다.
이론/모형
- 단시간 내 과량의 항원에 노출될 경우 나타날 수 있는 급작형 과민반응에 대한 발효 울금 원료의 저해효과를 확인하기 위해 PCA assay를 실시하였다[3, 6, 15]. Anti-DNP IgE를 마우스의 양쪽 귀에 투여 후 미정맥을 통해 과량의 항원을 투여하여 급작형 과민반응을 유발함으로써 혈관 투과성을 증가시켰다.
- 발효 울금 원료와 비발효 울금 원료의 소염활성을 측정하기 위해서 western blot assay를 실시하였다. 두 원료는 DMSO에 현탁한 뒤 LPS를 이용해 활성화된 raw 264.
- 발효 울금 원료의 즉각형 과민반응에 대한 억제 및 예방효과를 확인하기 위해서 PCA(Passive cutaneous anaphylaxis) 모델을 확립하였다[3, 6, 15]. 실험을 위해 5주령 자성 ICR 마우스를 중앙실험동물로부터 구입하였고 1주일 동안 계류하였다.
- 발효를 통해 울금 분말이 가지고 있는 소염활성을 가장 극대화시킬 수 있는 유산균주를 선별하기 위해 western blot assay를 실시하였다. pH 7.
- 염증반응에 직접적으로 관여하는 대표적인 단백질인 COX2와 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현에 미치는 발효 울금 배양액 및 원료의 효능을 평가하기 위해서 western blot assay를 실시하였다[14]. Raw 264.
- johnsonii IDCC 9203 균주로 배양한 시료에서 가장 높은 iNOS 및 COX-2 저해능을 확인하였다. 위 분석 결과에서 COX-2 저해능이 비교적 우수했던 4가지 배양액은 주정 침전법을 이용해서 2차 분석 시료를 제조하였고 2차 western blot assay를 진행하였다(Fig. 2B). 주정 침전법을 이용해서 제조한 모든 시료는 대조군과 비교하여 강한 COX-2 저해능을 보였으며 그 중에서 L.
성능/효과
- COX-2의 발현 저해는 발효 울금 원료를 125 µg/mL 농도로 처리했을 때부터 활성화되는 것을 확인할 수 있었고 250 µg/mL의 농도로 처리했을 때에는 COX-2, iNOS 모두를 강력하게 저해하였다.
- NC/Nga 아토피 피부염 동물모델과 PCA 동물모델에서 발효 울금 원료의 효능 확인 결과 대조군에 비해 아토피 피부염의 초기 증상 개선효과와 급작형 과민반응에 대한 예방효과가 뛰어남을 확인하였다. 발효 울금 원료의 유효성분 함량을 분석했을 때 커큐민의 함량은 비발효 울금 원료에 비해 2.
- 발효를 통해 울금 분말이 가지고 있는 소염활성을 가장 극대화시킬 수 있는 유산균주를 선별하기 위해 western blot assay를 실시하였다. pH 7.0으로 보정한 5종의 프로바이오틱 유산균 배양 상등액을 10배 농축하여 LPS로 활성화된 raw 264.7 세포주에 처리하였을 때 B. longum을 제외한 나머지 Lactobacillus속 균주들은 비발효 울금 시료를 처리한 control군에 비해 COX-2발현을 저해함을 확인하였다(Fig. 2A). 그 중 L.
- 2 mg의 커큐민만이 상등액으로 용출되었다. 결과적으로 유산균 발효에 의해 커큐민의 용해도가 증가되며 발효에 의해 증가된 수용성 커큐민은 기존 지용성 커큐민에 비해 생체 이용율이 뛰어나기 때문에 수용성 커큐민의 함량이 높은 발효 울금 원료는 다양한 염증성 cytokine의 발현을 저해함으로써 소염활성이 증가되고 동물실험에서 아토피 피부염의 초기 증상 완화 및 급작형 과민반응에 대한 저해효능도 높은 것으로 판단된다.
- 그 결과 발효 울금 원료 250µg/mL까지 농도 의존적으로 COX-2와 iNOS의 발현을 감소시켰으며, 그 저해 활성은 동일 농도의 비발효 울금 원료보다 강하였다.
- 2A). 그 중 L. johnsonii IDCC 9203 균주로 배양한 시료에서 가장 높은 iNOS 및 COX-2 저해능을 확인하였다. 위 분석 결과에서 COX-2 저해능이 비교적 우수했던 4가지 배양액은 주정 침전법을 이용해서 2차 분석 시료를 제조하였고 2차 western blot assay를 진행하였다(Fig.
- 인도산 울금 분말을 bifidobacteria와 lactobacilli를 포함한 프로바이오틱 유산균으로 발효한 시료들의 소염활성 정도를 세포 내 염증성 인자들의 발현양을 관찰함으로써 평가하였다. 그 중 L. johnsonii IDCC 9203으로 발효한 시료의 소염 활성이 가장 뛰어났다. 이를 바탕으로 울금 분말을 포함한 본배양 배지에서 L.
- 5배 증가했으며, 수용성 커큐민의 함량 역시 증가하였다. 또한 비스디메톡시커큐민이나 디메톡시커큐민의 함량도 증가되었을 뿐 아니라 전체 커큐미노이드 중에서 이들 유도체의 비중이 높아짐을 확인하였다.
- 모든 결과들을 종합하면, 울금 분말을 L. johnsonii IDCC 9203을 이용하여 발효함으로써 유효성분인 커큐미노이드들의 성분비가 변화하고 수용성 커큐미노이드의 증가에 의한 생체 이용율 증가로 울금의 소염 및 항알레르기 활성이 증가된다. 본 연구를 통해 L.
- 5). 발효 울금 원료 투여군에서는 유의적인 evans blue 농도 감소가 관찰된 반면 비발효 울금 원료 투여군에서는 유의적인 감소가 보이지 않았다. 따라서 발효 울금 원료는 비발효 울금 원료와 비교했을 때 외부로부터 유입된 다량의 항원에 대해 유발될 수 있는 즉각형 과민반응을 더 효과적으로 예방하고 치료할 것으로 예상된다.
- 발효 울금 원료를 경구투여한 실험군에서는 아토피 증상이 완만하게 증가되다가 29일째부터 증상이 호전되었으며 양성 대조군으로 사용한 dexamethasone 투여군은 4번의 유발이 끝날 때까지 증상이 악화되다가 16일째부터 증상이 호전되어 실험 종료시 비유발군과 동일한 수준으로 아토피 증상이 개선되었다. 발효 울금 원료 투여군은 vehicle군과는 달리 증상의 기복이 발생하지 않았고 아토피 피부염의 초기 증상을 유의적으로 감소시켰다. 이는 발효 울금 원료 투여 시 다량의 외부 항원에 노출되어 발생되는 급성기 피부염을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있는 가능성을 제공해준다.
- 실험결과 아토피 피부염 비유발군은 실험기간 중 아토피증상이 심화되지 않은 반면 mite extract를 처리하여 아토피 유발 후 PBS를 투여한 vehicle군은 4차, 6차 유발 종료 후 증상이 심하게 악화되다가 완화되었다. 발효 울금 원료를 경구투여한 실험군에서는 아토피 증상이 완만하게 증가되다가 29일째부터 증상이 호전되었으며 양성 대조군으로 사용한 dexamethasone 투여군은 4번의 유발이 끝날 때까지 증상이 악화되다가 16일째부터 증상이 호전되어 실험 종료시 비유발군과 동일한 수준으로 아토피 증상이 개선되었다. 발효 울금 원료 투여군은 vehicle군과는 달리 증상의 기복이 발생하지 않았고 아토피 피부염의 초기 증상을 유의적으로 감소시켰다.
- NC/Nga 아토피 피부염 동물모델과 PCA 동물모델에서 발효 울금 원료의 효능 확인 결과 대조군에 비해 아토피 피부염의 초기 증상 개선효과와 급작형 과민반응에 대한 예방효과가 뛰어남을 확인하였다. 발효 울금 원료의 유효성분 함량을 분석했을 때 커큐민의 함량은 비발효 울금 원료에 비해 2.5배 증가했으며, 수용성 커큐민의 함량 역시 증가하였다. 또한 비스디메톡시커큐민이나 디메톡시커큐민의 함량도 증가되었을 뿐 아니라 전체 커큐미노이드 중에서 이들 유도체의 비중이 높아짐을 확인하였다.
- 4B). 실험 결과 발효 울금 투여군에서는 mite extract에 의한 IgE의 증가를 비유발군 수준으로 유의적으로 감소시켰다. 이에 반해 양성 대조군인 dexamethasnone 투여군은 발효 울금 투여군에 비해 IgE 증가 억제력이 떨어졌다.
- 4A). 실험결과 아토피 피부염 비유발군은 실험기간 중 아토피증상이 심화되지 않은 반면 mite extract를 처리하여 아토피 유발 후 PBS를 투여한 vehicle군은 4차, 6차 유발 종료 후 증상이 심하게 악화되다가 완화되었다. 발효 울금 원료를 경구투여한 실험군에서는 아토피 증상이 완만하게 증가되다가 29일째부터 증상이 호전되었으며 양성 대조군으로 사용한 dexamethasone 투여군은 4번의 유발이 끝날 때까지 증상이 악화되다가 16일째부터 증상이 호전되어 실험 종료시 비유발군과 동일한 수준으로 아토피 증상이 개선되었다.
- 앞선 결과들을 종합하면 울금 분말을 L. johnsonii IDCC 9203으로 발효함으로써 비발효 울금 원료에 비해 소염활성이 증가됨을 알 수 있었다.
- 이들 유도체들은 메톡시 그룹의 유무에 따라 커큐민과 구분되며 LC/MS 분석을 통해 커큐민의 유도체인 디메톡시커큐민과 비스디메톡시커큐민이 커큐민 peak 앞쪽에서 분리됨을 확인하였다(Data not shown). 울금 원료를 L. johnsonii IDCC 9203으로 발효하여 제조한 원료와 울금이 포함된 본배양 배지의 열수추출물을 이용해서 만든 동량의 비발효 원료로부터 ethyl acetate를 이용해서 유효성분을 추출한 뒤 HPLC를 이용한 정량분석 결과 비발효 울금에 비해 발효 울금 원료에 포함되어있는 커큐민 및 그 유도체의 함량이 증가하였다(Fig. 6A). 정량 분석 결과 발효 울금 원료 1g에는 총 2777.
- 유산균을 이용한 울금 발효시 커큐민의 함량 증가와 더불어 커큐민 유도체의 성분비도 변화하였다. 울금을 L. johnsonii IDCC 9203으로 발효했을 때 전체 커큐미노이드 중 커큐민이 차지하는 비율은 유의적으로 줄어든 반면 디메톡시커큐민과 비스디메톡시커큐민의 함량은 상대적으로 증가하였다(Fig. 6C). 이는 발효에 의해 커큐민이 비스디메톡시커큐민과 디메톡시커큐민으로 전환되었음을 의미한다.
- 위 결과들을 종합했을 때 L. johnsonii IDCC 9203을 이용해 발효한 울금 원료는 커큐미노이드의 성분비가 변화하고 수용성 커큐민의 함량 증가로 생체 이용율이 개선되어 동량의 비발효 울금 원료보다 더 뛰어난 약리효과를 발휘할 수 있으므로 염증반응으로 유발되는 여러 질환을 예방하고 치료하기 위한 목적으로 사용 가능하다고 판단된다.
- johnsonii IDCC 9203 배양액으로 제조한 시료는 iNOS 저해능도 높았다. 위 결과를 종합하면 L. johnsonii IDCC 9203을 이용한 울금 발효물의 소염활성이 가장 강하므로 이를 울금 발효를 위한 유산균주로 선정하였다.
- 울금의 대표적 유효성분 중 하나인 커큐민을 포함한 그 유도체(디메톡시커큐민, 비스디메톡시커큐민)의 함량과 성분비율이 발효에 의해서 변화되는지를 확인하기 위하여 HPLC를 이용한 정량분석을 실시하였다. 이들 유도체들은 메톡시 그룹의 유무에 따라 커큐민과 구분되며 LC/MS 분석을 통해 커큐민의 유도체인 디메톡시커큐민과 비스디메톡시커큐민이 커큐민 peak 앞쪽에서 분리됨을 확인하였다(Data not shown). 울금 원료를 L.
- 실험 결과 발효 울금 투여군에서는 mite extract에 의한 IgE의 증가를 비유발군 수준으로 유의적으로 감소시켰다. 이에 반해 양성 대조군인 dexamethasnone 투여군은 발효 울금 투여군에 비해 IgE 증가 억제력이 떨어졌다. 이러한 결과는 울금 발효물의 투여가 급성기 피부염에서 급격하게 늘어나는 IgE를 감소시킴으로써 아토피 피부염의 초기억제에 탁월한 효능을 나타내기 때문일 것으로 생각된다.
- 정량 분석 결과 발효 울금 원료 1g에는 총 2777.4 µg의 커큐민이 포함되어 있고 발효 울금 원료 생산량은 28.02 g/L이므로, 배양여액 1L에 포함된 전체 커큐민은 77.8 mg이었다.
- 2B). 주정 침전법을 이용해서 제조한 모든 시료는 대조군과 비교하여 강한 COX-2 저해능을 보였으며 그 중에서 L. johnsonii IDCC 9203 배양액으로 제조한 시료는 iNOS 저해능도 높았다. 위 결과를 종합하면 L.
후속연구
- 발효 울금 원료 투여군에서는 유의적인 evans blue 농도 감소가 관찰된 반면 비발효 울금 원료 투여군에서는 유의적인 감소가 보이지 않았다. 따라서 발효 울금 원료는 비발효 울금 원료와 비교했을 때 외부로부터 유입된 다량의 항원에 대해 유발될 수 있는 즉각형 과민반응을 더 효과적으로 예방하고 치료할 것으로 예상된다.
- johnsonii IDCC 9203을 이용하여 발효함으로써 유효성분인 커큐미노이드들의 성분비가 변화하고 수용성 커큐미노이드의 증가에 의한 생체 이용율 증가로 울금의 소염 및 항알레르기 활성이 증가된다. 본 연구를 통해 L. johnsonii IDCC 9203으로 발효한 울금 원료는 급성기 피부염에 대한 예방 및 치료 목적으로 사용 가능할 것으로 예상된다.
- 발효 울금 원료 투여군은 vehicle군과는 달리 증상의 기복이 발생하지 않았고 아토피 피부염의 초기 증상을 유의적으로 감소시켰다. 이는 발효 울금 원료 투여 시 다량의 외부 항원에 노출되어 발생되는 급성기 피부염을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있는 가능성을 제공해준다.
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