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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 건강기능성분이 강화된 생식용 포도를 생산하기 위하여 수확 후 세포의 대사조절을 통해 레스베라트롤의 함량을 효과적으로 증폭시키는 방법을 개발하는 데 연구의 목적을 두고 있다. 연구의 구체적인 목적은 포도의 세포 조직에 외부 자극을 가했을 때 레스베라트롤 생합성 유전자의 발현 현상이 나타나는지 확인하고, 수확이후 포도의 레스베라트롤 함량 강화를 위한 자외선 자극의 효과를 구명하는 것이다.
- 따라서, 본 연구는 건강기능성분이 강화된 생식용 포도를 생산하기 위하여 수확 후 세포의 대사조절을 통해 레스베라트롤의 함량을 효과적으로 증폭시키는 방법을 개발하는 데 연구의 목적을 두고 있다. 연구의 구체적인 목적은 포도의 세포 조직에 외부 자극을 가했을 때 레스베라트롤 생합성 유전자의 발현 현상이 나타나는지 확인하고, 수확이후 포도의 레스베라트롤 함량 강화를 위한 자외선 자극의 효과를 구명하는 것이다.
- 특히, 포도에 함유되어 있는 레스베라트롤과 같은 건강기능 성분의 효과가 과학적으로 밝혀지고 있어 포도는 단순한 영양 자원이나 기호 식품의 측면을 넘어서는 관심을 받고 있다. 이에 따라 본 연구에서는 포도의 대표적인 건강기능 성분인 레스베라트롤이 강화된 생식용 포도를 효과적으로 생산하는 방법을 찾고자 포도 수확 후 자외선을 처리하는 방법을 적용하였다. 본 연구를 통해 도출한 연구의 결론은 다음과 같다.
제안 방법
- GUS 활성 분석은 Jefferson et al(1987)의 방법과 유사하게이루어졌다. MS 최소 배지에서 이틀간 배양한 STSY promoterGUS가 들어간 조직을 두 그룹으로 나누어서 한 그룹은 UV를 20분간 처리하였다. UV 처리 및 비처리 조직을 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide(X-gluc)를 포함한 GUS 용액(50 mM phosphate buffer(pH 7.
- 5는 각각 거봉 포도와 MBA 포도에 대해서 자외선 처리를 하였을 때 레스베라트롤의 함량이 강화된 정도를 보여주는 것이다. 본 연구에서는 40 W 및 200 W의 자외선 A(315～400 nm), 그리고 40 W 및 190 W의 자외선 C(100～280 nm)를 사용하여 수확 이후 포도에 처리하였을 때 레스베라트롤의 함량 변화를 분석하였다. 그림에서 보는 바와 같이, 수확 후 거봉 포도의 경우 자외선을 처리하기 전에 레스베라트롤의 함량이 1.
- 본 연구에서는 자외선을 방사할 수 있는 장치를 자체 제작하였으며, 자외선의 출력, 방사 높이, 방사 시간 조절을 통해서 포도에 가해진 에너지량을 조절하였다. 자외선의 출력은 방사계(Radiometer, model: VLX-3W, Cole-Parmer)로 측정하였다.
- 7은 각각 거봉 포도와 MBA 포도에 대해 자외선 처리에 따른 품질 변화를 분석한 것이다. 본 연구에서는 포도의 품질 인자 중 색상과 당도를 선정하여 그 변화를 분석하였다. 특히, 레스베라트롤은 당류로부터 출발하는 시킴산 경로를 거쳐 생성된 p-coumaroyl CoA 한 분자와 malonyl CoA 세 분자로부터 합성되는 물질이기 때문에 자외선 처리 전후의 당도 변화를 분석할 필요가 있기 때문이다.
- 색상의 변화는 Hunter color system에 의한 색상차(기준 백색판 대비)를 산출하여 자외선 처리 전후를 비교하였으며, 당도는 굴절당도계에 의한 측정치를 비교하였다.
- 색상차와 당도는 각각 색차계(model CR-400, Konika Minolta, Japan)와 굴절당도계(model PR-101, Atago, Japan)를 사용하여 측정하였다. 색상차는 다음의 Hunter 색 시스템을 이용하여 산출한 후 비교하였다.
- 자외선 처리전 포도와 처리후 1일 경과된 포도의 품질 변화를 비교하기 위하여 색상차와 당도를 분석하였다. 색상차와 당도는 각각 색차계(model CR-400, Konika Minolta, Japan)와 굴절당도계(model PR-101, Atago, Japan)를 사용하여 측정하였다. 색상차는 다음의 Hunter 색 시스템을 이용하여 산출한 후 비교하였다.
- 입자충격침투기를 사용하여 stsy promoter-GUS 및 대조군으로 pBI 121이 일시 도입(transient)된 조직은 MS 최소 배지에서 이틀간 배양 후 조직화학분석(histochemical analysis)(Lee & Pyee 2004) 을 실시하였다.
- 자외선의 출력은 방사계(Radiometer, model: VLX-3W, Cole-Parmer)로 측정하였다. 자외선 처리를 균일하게 하기 위해 수확 직후 포도알을 송이로부터 분리하여 자외선을 조사하였다. Table 1은 자외선 처리 시 자외선의 세기와 처리 시간을 나타낸 것이다.
- 자외선 처리전 포도와 처리후 1일 경과된 포도의 품질 변화를 비교하기 위하여 색상차와 당도를 분석하였다. 색상차와 당도는 각각 색차계(model CR-400, Konika Minolta, Japan)와 굴절당도계(model PR-101, Atago, Japan)를 사용하여 측정하였다.
- 자외선 처리후 1일 경과된 포도의 레스베라트롤 함량을 HPLC 분석법에 의해 측정하였으며, 자외선 처리전 포도와 비교하였다. 추출된 시료를 0.
- 3에서 보는 바와 같이, 본 연구에서는 발현유전자 확인기술인 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 기법을 통해서 STSY 유전자의 promoter를 도입한 애기장대(arabidopsis) 형질전환체를 분석한 결과를 바탕으로 STSY 유전자가 UV에 의해서 유도된다는 것을 확인하였다. 즉, 앞의 실험에서 사용한 stress 조건을 이용하여 4℃에서 처리하는 경우 포도 과실에서 STSY transcript(STSY 유전자의 전사물)의 합성이 얼마나 유도되는지를 RT-PCR을 통해서 확인하였다. 먼저 가장 크게 STSY transcript의 합성을 유도하는 UV의 경우 5분, 10분, 30분 등 시간대별로 처리한 후 4℃에서 0시간, 24시간, 48시간만큼 incubation하여 STSY transcript 발현 정도를 RT-PCR한 결과, 각 대조구(1, 4, 7, 10번 lane으로 각 STSY/gapdh의 band 진하기 비율을 동일하게 놓음)에 비해 1∼2배(STSY/gapdh의 band 진하기 비율 비교)까지 증가하였다.
- 추출된 시료를 0.1 g당 1 mL의 메틸알코올을 가하여 0.45μm filtering(Millex HN 13 mm)하여 diode-array UV detector를 가진 HPLC(Agilent 1100 Series)에 주입하였다.
- Louis, MO, USA)의 레스베라트롤을 구입하여 사용하였다. 측정은 3반복으로 실시하였다.
- 4), 3 mM potassium ferricyanide, 3 mM potassium ferrocyanide)에 37℃에서 24시간 반응시켰다. 탈수는 50%, 70%, 90% 에탄올에 각각 30분씩 방치한 후, 마지막으로 70% 에탄올에 넣어서 색소를 완전히 제거하고 GUS 발현을 확인하였다.
- 포도에서 유전자 발현을 위해서는 외부 유전자 침투를 위한 입자 충격침투법(particle bombardment assay)(Lee & Pyee 2004)를 시도하였으며, 포도 과피를 직경 1 cm가 되도록 잘라서 식물세포배양용 배지인 MS(Murashige and Skoog) 최소 배지(Du- chefa, MS including vitamin, 30% sucrose, 0.8% agar pH 5.6～5.8)에 침출시켜 입자충격침투기(Bio-Rad Biolistic PDS-1000/HE, Particle Delivery System)에 장착하였다.
- 해당 plasmid DNA 는 Bio-Rad의 방법대로 3 mg microcarrier를, DNA 5μg과 50 μL CaCl2(2.5 M), 20 μL spermidine(0.1 M)을 첨가하여 상온에서 침전시킨 후 각각 70%, 100% 에틸알코올로 세척하고 최종 100% 에틸알코올에 녹여 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에는 경북 영천에서 2004년과 2005년에 수집된 MBA(Muscat Bailey A)와 거봉 포도를 사용하였다.
- 이때 시료 주입량은 20 μL 이었고, 용매의 gradient 조건은 15:85 비율에서 40:60 비율 methanol/water로 하였으며, 레스베라트롤 peak은 23분에서 측정되었다. 한편, 표준물질로는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)의 레스베라트롤을 구입하여 사용하였다. 측정은 3반복으로 실시하였다.
이론/모형
- 스틸벤 생합성효소 유전자(STSY)에 대한 촉진유전자(promoter)의 기능을 확인하기 위한 유전자 일시적 발현 검정법(transient expression assay)은, 해당 유전자구성체(construct)인 stsy promoter에 식물유전용 확인유전자인 GUS(β-gluuro- nidase)를 붙이고 동시에 발현량 비교 오차를 위한 대조군으로, 이들 construct가 없는 식물용 유전자 운반체(plasmid)인 pBI 101 또는 pBI 121을 사용하였다(Lee & Pyee 2004).
- 애기장대(arabidopsis)에서의 일시적 발현을 위해서는 Agrobacterium매개 형질전환 방법을 사용하였다(Clough & Bent 1998).
- 본 연구에서는 자외선을 방사할 수 있는 장치를 자체 제작하였으며, 자외선의 출력, 방사 높이, 방사 시간 조절을 통해서 포도에 가해진 에너지량을 조절하였다. 자외선의 출력은 방사계(Radiometer, model: VLX-3W, Cole-Parmer)로 측정하였다. 자외선 처리를 균일하게 하기 위해 수확 직후 포도알을 송이로부터 분리하여 자외선을 조사하였다.
성능/효과
- 2에서는 STSY promoter 1과 GUS의 유전자 구성체에 의한 거봉 포도에서 발현 정도를 확인하였다. 일시적 발현(transient expression)을 통한 STSY promoter 1의 기능을 알아보기 위하여 대조군으로 사용된 STSY promoter 1이 없는 pBI 121 (CaMV 35S promoter:GUS)은 (a)와 같이 거봉 과피및 과육에서 GUS 발현, 즉 푸른색을 보임으로 transient expre- ssion assay에 사용된 조건이 거봉의 생장에 영향 없이 제대로 기능함을 확인하였다. STSY promoter 1:GUS도 거봉 과피 부위에서 GUS를 발현함으로써 확보한 STSY promoter 1이 in vivo에서도 기능하는 clone임을 확인할 수 있었다.
- 03%(Brix)로 유지되었다. 5% 유의 수준에서 유의성을 분석한 결과, 거봉 포도와 MBA 포도 모두 색상과 당도의 변화는 유의하지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Cho et al(2008)이 딸기에 대해 자외선 처리를 통한 페놀류 강화 연구에서 보고한 바와 유사하게 자외선을 처리하더라도 과실의 품질에는 영향을 거의 주지 않음을 보여주는 것이다.
- 일시적 발현(transient expression)을 통한 STSY promoter 1의 기능을 알아보기 위하여 대조군으로 사용된 STSY promoter 1이 없는 pBI 121 (CaMV 35S promoter:GUS)은 (a)와 같이 거봉 과피및 과육에서 GUS 발현, 즉 푸른색을 보임으로 transient expre- ssion assay에 사용된 조건이 거봉의 생장에 영향 없이 제대로 기능함을 확인하였다. STSY promoter 1:GUS도 거봉 과피 부위에서 GUS를 발현함으로써 확보한 STSY promoter 1이 in vivo에서도 기능하는 clone임을 확인할 수 있었다. 또한 STSY promoter 1: GUS는 거봉의 과피에서 뿐만 아니라 과육 부위에서도 GUS 발현을 보임으로 해당 promoter에 의한 과육에서의 STSY 발현이 가능할 수 있음을 시사해 주었다.
- 그러나, Fig. 3에서 보는 바와 같이, 본 연구에서는 발현유전자 확인기술인 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 기법을 통해서 STSY 유전자의 promoter를 도입한 애기장대(arabidopsis) 형질전환체를 분석한 결과를 바탕으로 STSY 유전자가 UV에 의해서 유도된다는 것을 확인하였다. 즉, 앞의 실험에서 사용한 stress 조건을 이용하여 4℃에서 처리하는 경우 포도 과실에서 STSY transcript(STSY 유전자의 전사물)의 합성이 얼마나 유도되는지를 RT-PCR을 통해서 확인하였다.
- 특히, 포도 수확 후 자외선을 처리하는 방법은 유전자 변형을 유발하지 않으면서도 포도에 오염물질을 전혀 남기지 않는 방법으로 평가되기 때문에 포도 산지에서 직접 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 더구나, 본 연구에서 적용한 처리 시간은 1 min 정도에 불과하여 포도 산지에서 대량처리용 처리기술로서 가치가 매우 큰 것으로 판단된다.
- STSY promoter 1:GUS도 거봉 과피 부위에서 GUS를 발현함으로써 확보한 STSY promoter 1이 in vivo에서도 기능하는 clone임을 확인할 수 있었다. 또한 STSY promoter 1: GUS는 거봉의 과피에서 뿐만 아니라 과육 부위에서도 GUS 발현을 보임으로 해당 promoter에 의한 과육에서의 STSY 발현이 가능할 수 있음을 시사해 주었다. 이러한 일시적 발현 실험 결과는 나아가 영구 형질전환(stable transformation)을 통하여 완전한 개체를 만든다면 환경 stress에 따라 promoter의 activity가 어떻게 달라질 수 있는지를 실험하여 promoter를 최상으로 활성화(activation)시킬 수 있는 인자를 개발할 수 있게 될 것으로 생각된다.
- 먼저 가장 크게 STSY transcript의 합성을 유도하는 UV의 경우 5분, 10분, 30분 등 시간대별로 처리한 후 4℃에서 0시간, 24시간, 48시간만큼 incubation하여 STSY transcript 발현 정도를 RT-PCR한 결과, 각 대조구(1, 4, 7, 10번 lane으로 각 STSY/gapdh의 band 진하기 비율을 동일하게 놓음)에 비해 1∼2배(STSY/gapdh의 band 진하기 비율 비교)까지 증가하였다.
- 특히, 자외선 조사는 간단한 장치와 단순한 처리로 가능한 방법이기 때문에 포도 산지에서 효과적으로 활용할 수 있는 방법으로 판단된다. 실제로, 수확이후 포도에 자외선을 조사하였을 때 품종에 무관하게 약 5배까지 레스베라트롤을 증폭할 수 있는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 제시한 방법은 유전자 조작법이 아니라 세포대사조절에 의한 기법에 해당하므로 현장 활용이 크게 기대된다.
- 22로 산출되었다. 유의성 분석 결과, 거봉 포도와 MBA 포도 모두 5% 유의수준에서 자외선 처리에 따른 증폭 효과가 유의하게 나타났다. 이러한 결과는 자외선 처리 시간이 불과 1 min에 지나지 않음에도 불구하고 Cantos et al (2002, 2003)이 보고한 3∼4배 증폭보다 더 큰 증폭 효과를 보여주는 것이다.
- 포도 세포에 외부에서 적당한 스트레스를 가할 경우, 레스베라트롤 생합성 유전자가 발현되어 레스베라트롤의 함량이 증가하는 현상을 확인하였다. 이 현상은 유전자 조작이 이루어지는 과정이 아니며, 단지 포도 세포의 대사를 조절하는 현상이므로 신선식품의 건강기능성분을 강화하는 효과적인 방법으로 사용될 수 있다.
후속연구
- 실제로, 수확이후 포도에 자외선을 조사하였을 때 품종에 무관하게 약 5배까지 레스베라트롤을 증폭할 수 있는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 제시한 방법은 유전자 조작법이 아니라 세포대사조절에 의한 기법에 해당하므로 현장 활용이 크게 기대된다.
- 또한 STSY promoter 1: GUS는 거봉의 과피에서 뿐만 아니라 과육 부위에서도 GUS 발현을 보임으로 해당 promoter에 의한 과육에서의 STSY 발현이 가능할 수 있음을 시사해 주었다. 이러한 일시적 발현 실험 결과는 나아가 영구 형질전환(stable transformation)을 통하여 완전한 개체를 만든다면 환경 stress에 따라 promoter의 activity가 어떻게 달라질 수 있는지를 실험하여 promoter를 최상으로 활성화(activation)시킬 수 있는 인자를 개발할 수 있게 될 것으로 생각된다. 다만, 애기장대에서와는 달리 transient expression 유도 시 UV에 의한 상대적 발현 증가는 보이지 않았다.
- 특히, 포도 수확 후 자외선을 처리하는 방법은 유전자 변형을 유발하지 않으면서도 포도에 오염물질을 전혀 남기지 않는 방법으로 평가되기 때문에 포도 산지에서 직접 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 더구나, 본 연구에서 적용한 처리 시간은 1 min 정도에 불과하여 포도 산지에서 대량처리용 처리기술로서 가치가 매우 큰 것으로 판단된다.
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