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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 다양한 기능성 및 생리활성 물질을 함유하고 있는 마늘의 활용방안을 제시하고 마늘 생산 농가의 안정적인 소득과 수급조절 및 건강 기능 증진을 위하여 마늘을 첨가한 막걸리를 제조하고 마늘 첨가 막걸리의 품질 특성과 항알레르기 효과를 조사하고자 한다.
제안 방법
- MTT 시약이 살아있는 세포와 반응하여 보라색의 formazan을 형성하는 원리를 이용하여 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리를 최종농도 1 mg/ml이 되도록 HMC-1 세포에 처리한 다음 MTT solution을 첨가하여 37°C에서 overnight 배양한 후 착생된 생존 HMC-1 세포만을 계수하여 세포 생존율을 Fig. 2에 나타내었다.
- 자극 후 MTT solution (50 μl)를 첨가하여 37°C에서 overnight하고 dimethyl sulfoxide (DMSO)을 이용하여 결정을 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. PMA와 A23187만을 처리한 대조구의 흡광도를 100%로 하여 세포 생존율을 환산하였다.
- 22 μm membrane filter (Millipore, USA)로 여과하였다. Sep-pak C18 (Waters, USA)로 여액에서의 색소 및 단백질 성분을 제거한 후 HPLC (Agilent 1100 Series, USA)로 분석하였다. 분석용 column은 C-610H (300 mm×7.
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관능평가
관능검사는 관능평가 법에 대한 사전 교육을 시킨 23~40세 남, 여 20명의 패널을 선정하여 마늘첨가 막걸리의 색, 향, 신맛, 떫은맛, 전체적 기호도를 5점 평점법[9]으로 평가하여 매우 좋다 5, 매우 나쁘다 1의 점수로 표시하였다.
- 5 ml/min, detector는 UV detector를 이용하여 210 nm에서 검출하였다. 또한 색도 측정은 Chromameter (Minolta CT 310, Japan)를 이용하여 L (명도), a (적색도) 및 b (황색도) 값으로 측정하였다.
- 마늘 첨가 막걸리를 제조하기 위하여 개량식 국 0.5 kg을 0.7 l의 물에 잘 혼합하고 효모 1%를 접종하여 주모를 제조하였으며 주모를 확대 배양하기 위하여 국 1.5 kg과 8 l의 물을 첨가하여 24 시간 동안 배양하였다. 쌀 14 kg을 세척하여 3시간 물에 침지한 후 물을 빼고 121°C에서 30 분간 증자한 후 25°C에서 냉각하여 고두밥을 제조하였다.
- 마늘 첨가 막걸리의 histamine 유리억제효과 및 유리량을 정량적으로 확인하기 위하여 histamine EIA (Enzyme Immunoassay) Kit (EA31, Oxford, USA)를 이용하였다. Histamine 유리량을 in vitro 실험으로 확인하기 위하여 HMC-1 세포를 이용하였다.
- 마늘 첨가 막걸리의 항산화 활성을 정량적으로 분석하기 위하여 total polyphenol 함량과 DPPH 자유라디칼(Free radical) 소거활성을 측정하였다. Total polyphenol 함량은 folin-Denis법[2]을 사용하였다.
- 막걸리를 제조하기 위해 Saccharomyces cerevisiae KCCM 12648을 YM (Difico, USA) 배지에 배양한 후 YPD (yeast extract 1%, peptone 1%, glucose 2%, pH 3.8)에 1×109 CFU/ml 접종하여 24 시간 동안 30°C에서 190 rpm으로 진탕배양하였다.
- 발효 과정 중 pH 변화는 pH meter (Orion 420A, USA)로 측정하였으며, 총산함량은 0.1 N NaOH 용액으로 중화 적정하여 succinic acid로 환산하였고, 당도는 hand refractometer (KRÜSS, Germany)를 이용하여 측정하였다.
- 제조된 고두밥에 물 26 l를 첨가하여 본 담금을 실시하고 25°C에서 4 일간 발효 시킨 후 100°C에서 10 분간 블랜칭한 마늘 12% (v/v)를 첨가(효모의 생육을 저해하지 않으며, 최적의 관능적 특징을 가진 마늘 첨가 농도, data not shown)하고 25°C에서 3 일간 배양하였다.
대상 데이터
- 마늘 첨가 막걸리의 histamine 유리억제효과 및 유리량을 정량적으로 확인하기 위하여 histamine EIA (Enzyme Immunoassay) Kit (EA31, Oxford, USA)를 이용하였다. Histamine 유리량을 in vitro 실험으로 확인하기 위하여 HMC-1 세포를 이용하였다. 즉, HMC-1 세포를 1×106 cell/ml 로 조절하여 24 well plate의 각 well에 500 μl씩 분주하여 overnight 배양해서 세포를 안정화 시킨 후 마늘 첨가 막걸리 (final concentrate 1 mg/ml)를 첨가하고 1 시간 반응 후 각 well에 자극제(A23187+PMA)를 처리하여 8 시간 반응시킨 배양액을 5,000 rpm, 5 분간 원심분리 후 상징액을 histamine 측정용 시료로 사용하였다.
- 발효가 끝난 마늘 첨가 막걸리를 60°C에서 15 분간 살균하여 실험에 사용하였다. 대조구로는 마늘을 첨가하지 않은 막걸리를 제조하였다. 제조된 막걸리는 원심분리, 여과, 농축후 동결건조하여 냉장실에 보관하면서 세포실험의 시료로 사용하였다.
- 마늘은 2009년 6월경 경남 남해지역에서 수확한 마늘을 100°C에서 10분간 증자한 후 파쇄하여 사용하였다.
- 막걸리 제조용 쌀은 경남 진주지역에서 생산되는 것을 단위농협에서 구입하여 도정기(Deahwa, Korea)로 15%를 도정하여 원료미로 사용하였고, 쌀국은 경남 진주시 진주공동탁주에서 고두밥에 백국균(Aspergillus niger var. kawachii)을 배양시켜 제조한 것을 사용하였다. 마늘은 2009년 6월경 경남 남해지역에서 수확한 마늘을 100°C에서 10분간 증자한 후 파쇄하여 사용하였다.
- 대조구로는 마늘을 첨가하지 않은 막걸리를 제조하였다. 제조된 막걸리는 원심분리, 여과, 농축후 동결건조하여 냉장실에 보관하면서 세포실험의 시료로 사용하였다.
- 항알레르기 실험에 사용된 세포는 인간유래 비만세포주인 HMC-1 세포(Human mast cell line, a kind gift from Dr. H. M. Kim at Kyeonghee Universiry, Seoul, Korea)를 사용하였고 Isocove's modified Dulbecco's medium (IMDM: GIBCO, USA)에 10% fetal bovine serum과 100 U/ml의 penicillin과 100 μg/ml의 streptomycin (Pen Strep, Gibco, USA)를 첨가한 배지에서 5% CO2 incubator, 37°C로 배양하였다.
데이터처리
- 각 실험은 3회 반복 검정하여 실험 군당 평균(mean)±표준오차(standard)로 표시하였다.
이론/모형
- 즉 25배로 희석한 시료 5 ml에 folin 시약 5 ml를 첨가하여 잘 섞은 후 3 분간 정치한 다음 10% Na2CO3 용액 5 ml을 넣고 1 시간 동안 정치하고 spectrophotometer (UV-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며 표준물질로는 (+)catechin (Sigma, USA)을 사용하였다. DPPH 자유라디칼 소거활성은 Kilani 등[11]의 방법에 준하여 시료 1 ml에 0.2 mM DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazy, Sigma Chemical, USA) 용액을 2 ml 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거 활성은 다음과 같이 계산하였다.
- HMC-1 세포를 사용하여 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리 자체성분이 세포 생육에 미치는 효과를 조사하기 위하여 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) assay로 실험하였다[15]. HMC-1 세포(5×105 cell/ml)에 ethanol을 제거한 마늘 첨가 막걸리 액(1 mg/ml)을 처리한 후 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma, USA)와 calcium ionophore A23187 (Sigma, USA)로 8 시간 동안 자극시켰다.
- 마늘 첨가 막걸리의 항산화 활성을 정량적으로 분석하기 위하여 total polyphenol 함량과 DPPH 자유라디칼(Free radical) 소거활성을 측정하였다. Total polyphenol 함량은 folin-Denis법[2]을 사용하였다. 즉 25배로 희석한 시료 5 ml에 folin 시약 5 ml를 첨가하여 잘 섞은 후 3 분간 정치한 다음 10% Na2CO3 용액 5 ml을 넣고 1 시간 동안 정치하고 spectrophotometer (UV-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며 표준물질로는 (+)catechin (Sigma, USA)을 사용하였다.
- 알코올 함량은 AOAC법[1]에 따라 시료 100 ml를 증류한 후 15°C에서 주정계를 이용하여 측정하였으며 총당 함량은 Phenol-H2SO4법[10]에 따라 시료 1 ml에 5% phenol 1 ml와 H2SO4 5 ml를 가한뒤 상온에서 30분간 반응 후 460 nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준물질로 glucose (Merck, Germany)를 사용하였다.
- 환원당은 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)법[2]을 사용하여 시료1 ml에 0.75% DNS 용액 1 ml을 첨가하고 100°C에서 5 분간 반응시킨 다음 증류수 8 ml을 가한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 마늘 첨가 막걸리의 DPPH 자유라디칼 소거 활성 및 total polyphenol 함량은 각각 45%, 34%로 대조구 막걸리의 8%, 12%에 비해 높게 나타났다. 또한 total thiosulfate 함량을 OD 값으로 나타내었을 때 마늘 첨가 막걸리가 0.17 OD/g으로 나타났고 대조구 막걸리가 0.048 OD/g으로 나타나는 것을 확인했다. Ryu 등[24]은 시판전통주의 DPPH 자유라디칼 제거 활성을 분석하였을 때 하나의 실험구에서만 미약한 활성을 나타낸다고 보고하여 일반 막걸리 중 기능성을 가지는 제품은 부족한 것으로 사료되며 막걸리에 마늘을 첨가할 경우 항산화 활성이 증가하기 때문에 마늘 첨가 막걸리의 기능성을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- 3에 나타내었다. 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리를 HMC-1 세포에 최종 농도 1 mg/ml이 되도록 처리한 후 histamine 유리억제량을 측정한 결과, 마늘 첨가 막걸리 처리구는 241 ng/ml 유리량을보였으며, 대조구 막걸리는 227 ng/ml 유리량을 보였다. Histamine 유리량을 정량한 결과를 무처리구에 대한 histamine 유리억제효과로 환산하여 Fig.
- 4에 나타내었다. 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리의 histamine 유리억제율을 환산한 결과, 대조구 B (자극제 PMA + A23187)와 비교해 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리는 각각 27%와 22%의 억제율을 나타내어 마늘 첨가 막걸리의 histamine 유리억제효과가 다소 높음을 확인할 수 있었다. 마늘을 첨가하여 제조한 막걸리가 대조구 막걸리에 비해 뛰어난 항염증 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
- 1에 나타내었다. 마늘 첨가 막걸리의 DPPH 자유라디칼 소거 활성 및 total polyphenol 함량은 각각 45%, 34%로 대조구 막걸리의 8%, 12%에 비해 높게 나타났다. 또한 total thiosulfate 함량을 OD 값으로 나타내었을 때 마늘 첨가 막걸리가 0.
- 발효가 끝난 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리의 색도변화를 측정하여 Table 3에 나타내었다. 마늘 첨가 막걸리의 명도 L값은 89.52로 대조구 막걸리의 L값 27.51 보다 높게 나타나 대조구 막걸리에 비해 백색을 가지는 것으로 나타났으며 적색도 a값과 황색도 b값은 각각 0.25, 0.33와 4.12, 6.40으로 유사하게 나타났다. Kim 등[12]은 감초를 탁주에 첨가할 경우 첨가량에 따른 L값과 적색도의 차이는 보이지 않았고 감초 첨가량이 증가 할수록 황색도가 높게 나타났으며, 황색도의 증가는 첨가 원료인 감초의 황색도가 높기 때문이라 보고하였다.
- 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리의 유기산 함량은 Table 2에 나타내었다. 마늘 첨가 막걸리의 주요 유기산은 lactic, citric, malic, oxalic 및 succinic acid 순으로 나타났으며 각각 203.2, 82.0, 62.7, 46.5 및 2.2 mg%로 나타났으나 대조구 막걸리의 주요 유기산은 citric, lactic, oxalic, lactic 및 succinic acid 순으로 나타났다. Joung 등[9]은 일반미로 만든 막걸리에서는 succinic, citric, acetic 및 lactic acid 등이 검출된다고 보고하여본 연구의 결과와는 다소 차이를 보였다.
- 마늘을 첨가한 막걸리와 대조구 막걸리의 품질특성을 비교하여 Table 1에 나타내었다. 마늘 첨가 막걸리의 총당 및 환원당 함량은 각각 9.60, 1.00%로 나타나 대조구 막걸리에 비해 다소 높게 나타났으며, pH는 4.05로 대조구와 유사한 수치를 보여 마늘 첨가가 pH에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. Shin 등[28]은 율무를 첨가한 막걸리의 초기 pH가 3.
- 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리의 histamine 유리억제율을 환산한 결과, 대조구 B (자극제 PMA + A23187)와 비교해 마늘 첨가 막걸리와 대조구 막걸리는 각각 27%와 22%의 억제율을 나타내어 마늘 첨가 막걸리의 histamine 유리억제효과가 다소 높음을 확인할 수 있었다. 마늘을 첨가하여 제조한 막걸리가 대조구 막걸리에 비해 뛰어난 항염증 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
- 8로 증가하고, 첨가량이 많을수록 pH가 높다고 보고하여 본 연구의 결과와 다소 차이가 있었으나 이는 첨가물에 따른 차이로 생각된다. 산도는 대조구인 0.21%보다 2배 높은 0.42%로 나타났고 아미노산도는 약 7배 높은 1.79%였으며, 알코올 함량은 7%로 대조구 막걸리보다 1% 높게 나타났다. Kim 등[12]은 막걸리에 감초를 첨가할 경우 첨가된 감초 성분에 의해 탁주의 산도가 떨어지지만 효모나 젖산균 등의 미생물에 의해 산도가 증가한다고 보고하여 본 실험의 결과와는 다소 차이를 보였다.
- 2에 나타내었다. 자극제만을 처리한 B구, 마늘 첨가 막걸리 처리구 및 대조구 막걸리 처리구가 HMC-1 세포 생존율에 미치는 영향을 자극제를 처리하지 않은 정상세포 즉 대조구 C구를 100%로 환산한 결과 마늘 첨가 막걸리는 80%, 대조구 막걸리는 82%로 나타나 유의적 차이를 보이지 않아 마늘 첨가 막걸리에 의한 세포 독성이 없음을 추정할 수 있었다.
- 첨가된 마늘성분에 의한 색상의 변화가 기호도를 감소시키는 것으로 생각된다. 향, 맛, 전체적 기호도는 각각 4.70, 6.10 및 5.90로 대조구 막걸리 보다 높게 나타났다. 마늘 첨가 막걸리의 기호도가 높은 것은 마늘이 발효 되면서 특유의 강한 향이 사라지고 막걸리의 전체적인 향을 상승시키며 마늘에 첨가된 phenol 계 성분이 용출되어 약간의 쓴맛과 떫은맛을 더하기[4] 때문이라 생각된다.
후속연구
- 마늘 첨가 막걸리의 기호도가 높은 것은 마늘이 발효 되면서 특유의 강한 향이 사라지고 막걸리의 전체적인 향을 상승시키며 마늘에 첨가된 phenol 계 성분이 용출되어 약간의 쓴맛과 떫은맛을 더하기[4] 때문이라 생각된다. 관능평가 결과 색상을 제외한 모든 평가에서 마늘 첨가 막걸리가 대조구 막걸리에 비해 전반적으로 우수한 평가결과를 보여 막걸리 시장에서 경쟁력을 가질 수 있을 것으로 기대된다.
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