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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 복분자 미숙과와 완숙과의 에탄올 농도를 달리한 추출물의 생리활성을 탐색하고 향후 그 활용방안을 모색하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 즉 미숙과와 완숙과를 에탄올 농도별 (0, 25, 50, 75, 100%)로 추출 후 농축한 시료 1 ㎎을 용매 1 ㎖에 용해시켜 Folin-Ciocalteau 시약 2 ㎖를 가하여 혼합하고 3분 후 10% Na2CO3 용액 (w/v) 2 ㎖를 넣어 진탕하고 1시간 실온에서 방치한 후 700 ㎚에서 비색정량 하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 02 ㎖를 가한 다음 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 방치한 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Rutin을 이용하여 표준곡선을 구하여 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 농도별로 조제한 시료 1.0 ㎖에 EtOH 3.0 ㎖을 넣고 2 × 10−4 M DPPH용액 1.0 ㎖을 가한 후 vortex mixer로 교반하였고, 실온에서 30분간 반응시키고 517 ㎚에서 흡광도를 측정하여 추출물의 DPPH radical 소거능 (%)을 측정하였고, 대조구는 시료 대신에 EtOH을 첨가하여 실험 하였으며, positive control은 BHA, αtocopherol을 사용하여 활성을 비교하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
- 대조구는 시료대신 EtOH를 첨가하였으며, positive control은 BHA, α-tocopherol을 사용하여 활성을 비교하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
- 복분자 생과를 믹서기로 마쇄한 후 생과 400 g당 에탄올 0%, 25%, 50%, 75%, 100% 농도별로 넣고 환류냉각장치를 부착한 히팅 맨틀을 이용 2시간 동안 가열 추출하였고, 이것을 2회 반복 하였다. 추출물은 여과지 (ADVANTEC No.
- 복분자 추출물을 농도별로 희석하여 50 ㎕를 넣고, 0.75 unit/㎖ 의 α-glucosidase 효소액 25 ㎕를 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) 200 ㎕에 넣고 혼합한 후 2 mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG) 225 ㎕를 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 0.5 M Na2CO3 용액 500 ㎕가하여 반응을 정지시킨 후 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 효소 반응으로 생성된 nitrophenyl의 함량을 정량하여 각 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 효소활성을 계산하였다(Kim et al., 1991).
- , 1987) 등의 항산화제가 첨가되면 산화가 억제된다. 본 실험에서는 복분자 미숙과와 완숙과 75% 에탄올 추출물이 LDL 산화에 미치는 영향을 알아보고자 최종 농도를 0.5, 1, 2, 4, 8 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과는 Fig. 3과 같다. 미숙과와 완숙과의 에탄올 추출물은 모두 농도 의존적으로 LDL 산화 억제 효과가 높아지는 경향을 나타냈다.
- 0 ㎖)을 첨가하여 40℃의 암소에 5일간 방치하였다. 이 반응액을 0.1 ㎖을 취해 75% EtOH (4.7 ㎖), 30% ammonium thiocyanate (0.1 ㎖), 3.5% HCl에 녹인 0.02 M ferrous chloride (0.1 ㎖)와 혼합하여 3분이 지난 후에 500 ㎚에서 흡광도를 측정하여 산화양상을 관찰하였다. 대조구는 시료대신 EtOH를 첨가하였으며, positive control은 BHA, α-tocopherol을 사용하여 활성을 비교하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
- 25 mM CuSO4 40 ㎕를 가해 37℃에서 4시간 동안 반응시키고 냉각한 후 20% TCA 1 ㎖ 를 가해 반응을 중단시켰다. 이 반응액을 vortex 한 후 0.05 N NaOH에 녹인 0.67% TBA (thiobarbituric acid) 1.0 ㎖을 가해 혼합하여 95℃에서 15분간 가열하고 냉각한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 분리된 상등액 1 ㎖을 semi-micro cuvette에 분주하여 540 ㎚에서 생성된 MDA (malondialdehyde)의 흡광도를 측정하였다 (Miller et al., 1996).
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법 (Amerine and Ough, 1980)을 응용하여 측정하였다. 즉 미숙과와 완숙과를 에탄올 농도별 (0, 25, 50, 75, 100%)로 추출 후 농축한 시료 1 ㎎을 용매 1 ㎖에 용해시켜 Folin-Ciocalteau 시약 2 ㎖를 가하여 혼합하고 3분 후 10% Na2CO3 용액 (w/v) 2 ㎖를 넣어 진탕하고 1시간 실온에서 방치한 후 700 ㎚에서 비색정량 하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 복분자 생과를 믹서기로 마쇄한 후 생과 400 g당 에탄올 0%, 25%, 50%, 75%, 100% 농도별로 넣고 환류냉각장치를 부착한 히팅 맨틀을 이용 2시간 동안 가열 추출하였고, 이것을 2회 반복 하였다. 추출물은 여과지 (ADVANTEC No.2)를 이용 여과하여 감압농축 후 동결 건조 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 복분자는 전북 고창군에서 재배된 것으로 2010년 6월부터 과실의 색이 녹색인 것을 미숙과, 검붉은 색을 완숙과로 구분하여 수확한 것을 −20℃ 냉동 보관하여 사용하였다.
- , 1991). 양성대조구로는 acarbose를 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 3회 반복실험 한 값을 SAS Package (release 9.1.3)를 이용하여 평균± 표준편차로 표시하였고, 평균값의 p< 0.05의 수준에서 Duncan's multiple range test에 의하여 검정하였다.
이론/모형
- 에탄올 농도별로 복분자 미숙과, 완숙과의 linoleic acid의 지질과산화에 대한 억제활성 검정은 Inatani (Inatani et al., 1983) 등의 방법에 따라 실시하였다. 각 시료 농도별로 용매 1.
- 에탄올 농도별로 복분자 미숙과, 완숙과의 항산화 활성을 조사하기 위하여 자유라디칼인 DPPH를 사용한 항산화활성 측정법 (Choi et al., 1993)을 이용하였다. 각 시료를 농도별로 용매 1.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법 (Amerine and Ough, 1980)을 응용하여 측정하였다. 즉 미숙과와 완숙과를 에탄올 농도별 (0, 25, 50, 75, 100%)로 추출 후 농축한 시료 1 ㎎을 용매 1 ㎖에 용해시켜 Folin-Ciocalteau 시약 2 ㎖를 가하여 혼합하고 3분 후 10% Na2CO3 용액 (w/v) 2 ㎖를 넣어 진탕하고 1시간 실온에서 방치한 후 700 ㎚에서 비색정량 하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Davis 방법 (Chang et al., 2002) 을 이용하여 측정하였는데, 시료 1 ㎎을 용매 1 ㎖에 용해시키고 diethylene glycol 2 ㎖, 1 N-NaOH 0.02 ㎖를 가한 다음 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 방치한 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Rutin을 이용하여 표준곡선을 구하여 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
성능/효과
- LDL 산화 억제 효과 역시 미숙과 75% 에탄올 추출물의 LDL 산화 억제 효과가 가장 좋았는데, 0.5, 1, 2, 4, 8㎍/㎖ 농도별로 각각 11.14 ± 1.44%, 65.17 ± 1.22%, 73.78 ±0.90%, 76.97 ± 0.74%, 84.55 ± 1.01%를 나타내었다.
- 미숙과 75% 에탄올 추출물의 αglucosidase 억제 활성 효과가 높았는데, 25 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 70.0% 이상의 억제 활성 효과를 보인 반면 완숙과 추출물의 경우는 100 ㎍/㎖에서 50.0% 이상의 억제 활성 효과를 나타내었다.
- 미숙과 75% 에탄올 추출물의 IC50 값이 1.04 ± 0.04 ㎍/㎖로 가장 낮은 값을 보였으며, 미숙과 0%, 25%, 50%, 100% 에탄올 추출물은 각각 1.31 ± 0.02, 1.20 ±0.03, 1.10 ± 0.03, 1.34 ± 0.03 ㎍/㎖의 IC50 값을 보여 0% 에탄올 추출물에서 75% 에탄올 추출물 까지는 IC50 값이 감소되다가 100% 에탄올 추출물에서는 증가되는 경향을 나타내었다.
- 미숙과와 완숙과 모두 75% 에탄올 추출물에서 IC50 값이 가장 낮았으며, 미숙과 75% 에탄올 추출물이 23.85 ± 0.10 ㎍/㎖로 BHA, α-tocopherol의 IC50값 13.19 ± 0.21, 18.16 ± 0.23 ㎍/㎖보다는 높았지만 추출물 중에서는 가장 낮은 값을 보였다.
- 미숙과와 완숙과 모두 농도 의존적으로 α-glucosidase 억제 활성 효과가 높아지는 경향을 나타내었다.
- 2와 같다. 미숙과와 완숙과 모두 농도 의존적으로 지질과산화 억제 활성이 높아지는 경향을 나타내었다. 특히 75% 에탄올 추출물의 지질과산화 억제 활성이 높았는데, 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 90.
- 64 ㎎/g이었다. 미숙과와 완숙과를 비교하면 총 폴리페놀과 같이 미숙과에서 총 플라보노이드 함량이 높았다 (Table 1). Park 등 (2007)은 블랙 라스베리의 성숙 단계에 따른 총 페놀 함량을 분석한 결과 과실이 형성된 지 5일 지난 열매에서 총 페놀 함량이 가장 높았고, 성숙함에 따라 점차 총 페놀 함량이 줄어 완숙과에서 총 페놀 함량이 가장 적게 함유되어 있었다고 보고하였다.
- 3과 같다. 미숙과와 완숙과의 에탄올 추출물은 모두 농도 의존적으로 LDL 산화 억제 효과가 높아지는 경향을 나타냈다. LDL 산화 억제 효과 역시 미숙과 75% 에탄올 추출물의 LDL 산화 억제 효과가 가장 좋았는데, 0.
- 1과 같다. 미숙과와 완숙과의 에탄올 추출물의 DPPH free radical 소거활성은 모두 농도 의존적으로 활성이 높아지는 경향을 나타냈다. 특히 미숙과 75% 에탄올 추출물의 활성이 가장 좋았는데, 5, 25, 50, 100, 300 ㎍/㎖ 농도별로 각각 15.
- 28 ㎎/g으로 가장 함량이 낮았다. 미숙과와 완숙과의 총 폴리페놀 함량을 비교하면 미숙과가 완숙과 보다 2배 이상 함량이 높게 나타났다.
- 에탄올 농도별 추출물에 대한 IC50 값은 Table 3과 같은데 미숙과의 경우 75% 에탄올 추출물의 IC50 값이 7.34 ± 0.07 ㎍/㎖로 가장 낮은 값을 보였으며, 0, 25, 50, 100% 에탄올 추출물의 IC50 값은 각각 12.61 ± 0.31, 9.70 ± 0.30, 7.45 ± 0.14, 11.60 ± 0.25 ㎍/㎖ 으로 0% 에탄올 추출물에서 75% 에탄올 추출물 까지는 IC50 값이 감소되다가 100% 에탄올 추출물에서는 증가되는 경향을 나타내었다.
- 에탄올 농도별 추출물에 대한 IC50 값은 Table 5와 같이 미숙과의 경우 75% 에탄올 추출물의 값이 7.21 ± 0.13 ㎍/㎖로 가장 낮은 값을 보였으며, 0%, 25%, 50%, 100% 에탄올 추출물의 값은 각각 15.83 ± 0.26, 11.28 ± 0.05, 7.73 ± 0.08, 17.35 ± 0.13㎍/㎖ 값으로 0%에서 75% 에탄올 추출물 까지는 낮아졌으나 100% 에탄올 추출물에서 높아지는 경향이었다.
- 완숙과 75% 에탄올 추출물의 경우 농도별로 각각 9.78 ± 1.06%, 34.50 ± 1.15%, 36.25 ± 1.39%, 55.79 ± 0.83%, 63.22 ± 1.24%를 보여 미숙과의 추출물이 완숙과의 추출물보다 억제활성이컸다.
- 완숙과의 경우는 에탄올 농도가 증가할수록 총 폴리페놀 함량이 증가하였는데 100% 에탄올 추출물이 67.07 ± 0.43 ㎎/g으로 가장 함량이 높았으며, 0% 에탄올 추출물이 48.75 ± 0.28 ㎎/g으로 가장 함량이 낮았다.
- 총 폴리페놀 함량은 미숙과의 경우 75% 에탄올 추출물이 180.04 ± 0.41 ㎎/g으로 가장 많이 함유되어 있었으며, 50% 에탄올 추출물은 167.56 ± 0.09 ㎎/g, 100% 에탄올 추출물이 126.48 ± 0.37 ㎎/g로 가장 함량이 낮게 나타났다.
- 총 플라보노이드 함량은 미숙과나 완숙과에서 75% 에탄올 추출물 까지는 함량이 증가되었으나 100% 에탄올 추출물에서는 오히려 함량이 감소되었다. 미숙과의 경우 75% 에탄올 추출물이 50.
- 추출 수율은 미숙과, 완숙과 모두 25%~75% 에탄올 추출물까지는 비슷한 수율을 나타냈으나, 25% 에탄올 추출물 수율이 각각 6.96 ±0.35%, 20.62 ± 0.89%로 높았고, 에탄올 농도가 높을수록 수율은 감소되었으며 100% 에탄올 추출물의 수율은 4.50 ± 0.81%, 17.33 ± 0.84%로 0% 에탄올 추출보다도 수율이 오히려 낮았다.
- 특히 75% 에탄올 추출물의 지질과산화 억제 활성이 높았는데, 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 90.48 ± 0.32~95.45 ± 0.35%의 억제 활성을 보여 α-tocopherol 86.24 ± 0.31~88.56 ± 0.25%보다 억제 활성이 더 좋았다.
- 특히 미숙과 75% 에탄올 추출물의 활성이 가장 좋았는데, 5, 25, 50, 100, 300 ㎍/㎖ 농도별로 각각 15.67 ± 0.14, 44.47 ± 0.19, 72.12 ± 0.15, 81.57 ±0.37, 91.24 ± 0.12%를 나타내었다.
후속연구
- 이와 같은 결과는 추출용매나 복분자의 수확시기의 차이에 따른 것으로 생각되며, Choi 등 (2009)도 자원식물의 생육 시기별로 항산화 물질의 함량과 항산화 활성에 차이가 있다고 보고하였다. 따라서 약용식물로부터 항산화물질을 추출하기 위해서는 부위별 최적 생육 시기를 파악할 필요가 있을 것으로 판단된다. Park과 Oh (2003)는 거봉포도 에탄올 추출물의 전자공여 작용을 측정한 결과 종자와 과피의 IC50 값이 각각 136.
- 0%의 활성을 보여 추출용매에 따라 차이가 있다고 보고하였다. 복분자의 경우도 추출용매에 따른 차이를 보였으며, 등골나무와 비슷한 억제 활성을 보여 지질과산화를 억제하기 위한 식물소재로도 활용 가치가 높다고 생각된다.
- , 2009) 등의 추출물이 αglucosidase 저해활성이 높았다고 보고하였다. 본 연구에서도 복분자 추출물이 α-glucosidase 저해 활성을 보여 어떤 화합물이 저해 활성을 나타내었는지 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 27 ㎍/㎖로 75% 에탄올 추출물에서 가장 낮았으나 미숙과보다 상당히 높았다. 양성대조구로 사용한 acarbose의 IC50 값을 5 ㎎/㎖로 본다면 이들 추출물은 acarbose 보다 상당히 낮은 값으로 향후 기존 당뇨병 치료제를 대체할 수 있는 천연물 제제로의 개발 가능성이 높다고 본다. 시판되고 있는 acarbose와 같은 α-glucosidase 저해제는 장기간 복용할 경우 일부 환자에 있어서 복부팽만감, 구토, 설사 등 부작용을 나타낼 수 있어 그 사용이 제한될 수 있다.
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