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문제 정의
- 일반적으로 약재의 경우 동일한 품종이라 하더라도 산 지나 수확시기 등에 의해 그 약효 성분이나 활성이 달라지는 것을 감안하면 민들레 역시 품종에 따른 활성의 차이가 존재할 것으로 판단할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 우리나라 각지에서 쉽게 구할 수 있는 흰민들레와 서양민들레의 열수 및 에탄올 추출물을 제조하여 tyrosinase 저해활성, 그리고 NO 소 거능 및 생성 억제 활성 등과 함께 세포독성을 비교하여 천연물 유래의 기능성 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- , 2000). 1 ㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0~500 ㎍/㎖ 의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- 10 mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate 50 ㎕와 증류수에 일정농도로 용해시킨 시료액 30 ㎕를 혼합한 후 25℃에서 150분 동안 반 응시켰다. 1% sulfanilamide (in 30% acetic acid) 60 ㎕ 를 혼합하고 5분후 다시 0.1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in 60% acetic acid) 60 ㎕를 혼합하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- 1% naphtylethylendiamine dihydrochloride (in H2O)를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켜 micro-plate reader를 이용하여 540 ㎚에 서 흡광도를 측정하였다. Blank는 시료액 대신 PBS를 가하여 측정하였으며, 표준물질로 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 동일한 방법으로 측정한 흡광도를 바탕으로 작성한 검량선을 이용하여 NO 생성량을 산출하였다 (Ding et al., 1988).
- Nitric oxide 소거능은 Marcocci 등의 방법을 변형하여 다음 과 같이 측정하였다 (Marcocci et al., 1994). 10 mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate 50 ㎕와 증류수에 일정농도로 용해시킨 시료액 30 ㎕를 혼합한 후 25℃에서 150분 동안 반 응시켰다.
- 7과 L929 cell을 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처 리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도 를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- Polyphenol 화합물 중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다 (Moreno et al., 2000). 1 ㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법 에 의해 측정하는 방법을 변형하여 측정하였다 (Jung et al., 1995). 0.
- 이는 일반적으로 세포독성이 없는 수준으로 판단 할 수 있는 생존율이었으며, 선행연구에서 보고된 결과와도 일치 하는 것이었다 (Heo and Wang, 2008). 구체적인 독성의 수준을 파악하기 위해 상대적으로 낮은 세포생존율을 나타낸 L929 cell에 대하여 세포가 사멸할 때 세포막이 파괴되면서 방출되는 물질로 알려져 있는 lactate dehydrogenase (LDH) 방출량을 측정하여 Fig. 3에 나타내었다. LDH 방출량에서도 95.
- PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도 를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 배양된 L929 cell을 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 분주 하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 상등액 100 ㎕ 와 LDH reagent 100 ㎕를 혼합하여 30분간 암조건에서 반응 시킨 다음 stop solution으로 1N HCl 50 ㎕를 가한 후 490㎚에서 흡광도를 측정하여 LDH 방출량을 비교하였다. 11.
- 세포 사멸시 세포막의 손상으로 인해 발생되는 LDH의 양 을 측정하는 LDH cytotoxicity detection kit (TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하여 세포 독성을 확인하였다. 배양된 L929 cell을 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 분주 하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 1 ㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0~500 ㎍/㎖ 의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 Folin-Denis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96-well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 tannic acid 를 0~500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하고 페놀성 화합물의 함량을 ㎎/ g tannic acid로 나타내었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 서양민들레와 흰민들레는 2010년 5월에 채집하였으며, 각 시료는 채집 후 이물질을 제거하고 1차로 자 연 건조한 다음 50℃의 건조기에서 8시간 동안 건조한 후 추출에 사용하였다.
- 세포독성 실험에 사용된 Raw 264.7 및 L929 cell은 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
데이터처리
- 각 군간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 통계분석 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (mean ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분 석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 을 이용하였다.
이론/모형
- Folin-Denis법을 이용하여 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량을 측정하였다. Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 Folin-Denis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96-well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 각 추출물의 세포생존율을 MTT assay 방법에 의해 측정하 였다 (Shin et al., 2003). 배양된 Raw 264.
성능/효과
- 전반적으로 모든 추출물에서 농도의존적인 생성 저해 활성을 나타낸 것을 확인 할 수 있었으며, 특히 흰민들레 에탄올 추출물의 활성이 상대적으로 높게 나타났다. 125 ㎍/㎖ 농도에서는 모든 추출물의 NO 생성 저해 활성은 5.7~11.8%로 의미있는 수준은 아니었으나 250 ㎍/㎖ 농도부터 는 흰민들레 에탄올 추출물이 28.2%로 다른 추출물에 비해 비교적 높은 비율의 활성 증가율을 나타냈다. 500 ㎍/㎖과 1000 ㎍/㎖ 농도에서 흰민들레 에탄올 추출물은 각각 48.
- 2%로 다른 추출물에 비해 비교적 높은 비율의 활성 증가율을 나타냈다. 500 ㎍/㎖과 1000 ㎍/㎖ 농도에서 흰민들레 에탄올 추출물은 각각 48.23%와 54.12%의 NO 생성 억제 활성을 보였다. 추출 용매별로는 흰민들레와 서양민들레가 품종에 관계없이 에탄올 추출의 활 성이 열수 추출보다 높은 것으로 나타났고, 동일한 용매 조건 에서는 흰민들레 추출물이 서양민들레의 추출물보다 상대적으 로 NO 생성 억제 활성이 높게 나타났다.
- 이는 흰민들레의 polyphenol 함량이 서양민들레의 함량보다 현저하게 높은 것 으로 보고한 선행 연구의 결과와는 다르게 나타난 것으로 추출 부위와 방법, 채집 시기 등의 차이에 따른 것으로 판단된다 (Lee and Lee, 2008). Flavonoid 함량의 경우에도 서양민들레 에탄올 추출물과 흰민들레 에탄올 추출물에서 각각 32.46 ㎎/g과 20.90 ㎎/g으로 다른 추출 조건보다 높게 나타나 polyphenol의 함량과 유사한 경향을 확인할 수 있었다. 추출용 매로 열수를 사용한 조건보다 에탄올을 사용한 추출물의 polyphenol과 flavonoid 함량이 모두 높게 나타난 것을 알 수 있었으며, 특히 서양민들레의 경우 추출용매에 따른 함량의 차이가 더 크게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 3에 나타내었다. LDH 방출량에서도 95.62~107.47% 수준으로 나타나 독성을 나타내는 수준은 아닌 것으로 판단되었으나 모든 추출물에서 농도가 증가됨에 따 라 LDH 방출량도 증가되는 경향을 보여 실험에 사용된 농도 이상에서는 일정 수준의 독성을 나타낼 수 있을 것으로 보였다. 이상의 결과를 종합해보면 민들레의 품종에 따른 생리활성 의 차이가 일정 부분 존재함을 알 수 있었으나 품종에 따른 활성의 차이보다는 추출용매에 따른 활성의 차이가 더 크게 작용함을 확인할 수 있었다.
- 78 ㎎/㎖로 다른 추출물보다 높은 활성을 가지는 것으로 나타냈다. Positive control인 arbutin의 IC50은 0.24 ㎎/㎖로 나타났으며, 이를 100%의 활성 으로 하여 산출한 relative activity에서 흰민들레 열수 추출물 은 30.77%에 해당하는 활성인 것으로 확인됨에 따라 흰민들레 열수 추출물에서 일정 수준의 미백 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다. 전반적으로 서양민들레 추출물보다 흰민들레 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 더 우수한 것으로 나타 났다.
- 7과 L929 cell에 대한 흰민들레와 서양민들레 추 출물의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay에 의한 세포생존율을 측정하여 Table 3에 나타내었다. 각 추출물을 250~ 1000 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, Raw 264.7과 L929 cell에 대한 세포생존율은 각각 110.49~149.87%와 91.27~110.87%로 나타났다. 이는 일반적으로 세포독성이 없는 수준으로 판단 할 수 있는 생존율이었으며, 선행연구에서 보고된 결과와도 일치 하는 것이었다 (Heo and Wang, 2008).
- 추출 용매별로는 흰민들레와 서양민들레가 품종에 관계없이 에탄올 추출의 활 성이 열수 추출보다 높은 것으로 나타났고, 동일한 용매 조건 에서는 흰민들레 추출물이 서양민들레의 추출물보다 상대적으 로 NO 생성 억제 활성이 높게 나타났다. 또한 추출물의 세포 독성으로 인해 세포생존율의 저하로 NO 생성이 저해되었는지 여부를 확인하게 위해 실시한 MTT assay에서 Raw 264.7 cell에 대한 세포독성은 없는 것으로 확인되었다 (Table 3). 한 편, 이미 생성된 NO를 소거할 수 있는 활성의 정도를 확인하기 위해 실시한 NO 소거능 측정에서 흰민들레 에탄올 추출물의 소거능이 가장 뛰어난 것으로 나타났다 (Fig.
- 2). 모든 추 출물에서 농도의존적인 소거능을 보였으며, 민들레 품종에 상관없이 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 높은 활성을 나타 냈다.
- 47% 수준으로 나타나 독성을 나타내는 수준은 아닌 것으로 판단되었으나 모든 추출물에서 농도가 증가됨에 따 라 LDH 방출량도 증가되는 경향을 보여 실험에 사용된 농도 이상에서는 일정 수준의 독성을 나타낼 수 있을 것으로 보였다. 이상의 결과를 종합해보면 민들레의 품종에 따른 생리활성 의 차이가 일정 부분 존재함을 알 수 있었으나 품종에 따른 활성의 차이보다는 추출용매에 따른 활성의 차이가 더 크게 작용함을 확인할 수 있었다. 세포독성을 나타내지 않는 농도 조건에서 흰민들레 에탄올 추출물이 NO 생성 억제 및 소거 활성이 뛰어난 것으로 나타나 이를 활용한 항염증 관련 활성 을 가지는 소재로 이용될 수 있을 것으로 판단되었으며, 흰민들레 열수 추출물의 경우 tyrosinase 저해 활성을 바탕으로 한 미백 관련 소재로서의 가능성이 확인되었다.
- 1과 같다. 전반적으로 모든 추출물에서 농도의존적인 생성 저해 활성을 나타낸 것을 확인 할 수 있었으며, 특히 흰민들레 에탄올 추출물의 활성이 상대적으로 높게 나타났다. 125 ㎍/㎖ 농도에서는 모든 추출물의 NO 생성 저해 활성은 5.
- 77%에 해당하는 활성인 것으로 확인됨에 따라 흰민들레 열수 추출물에서 일정 수준의 미백 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다. 전반적으로 서양민들레 추출물보다 흰민들레 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 더 우수한 것으로 나타 났다.
- 12%의 NO 생성 억제 활성을 보였다. 추출 용매별로는 흰민들레와 서양민들레가 품종에 관계없이 에탄올 추출의 활 성이 열수 추출보다 높은 것으로 나타났고, 동일한 용매 조건 에서는 흰민들레 추출물이 서양민들레의 추출물보다 상대적으 로 NO 생성 억제 활성이 높게 나타났다. 또한 추출물의 세포 독성으로 인해 세포생존율의 저하로 NO 생성이 저해되었는지 여부를 확인하게 위해 실시한 MTT assay에서 Raw 264.
- 추출된 시료액은 여과 후, 감압농축기를 이용하여 추출용매를 제거하고 동결 건조하여 분말화한 다음 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 추출수율은 흰 민들레 열수 추출물과 에탄올 추출물의 경우 각각 34.5%와 15.3%, 서양민들레 열수 추출물과 에탄올 추출물의 경우 37.9%와 17.2%로 나타났다.
- 90 ㎎/g으로 다른 추출 조건보다 높게 나타나 polyphenol의 함량과 유사한 경향을 확인할 수 있었다. 추출용 매로 열수를 사용한 조건보다 에탄올을 사용한 추출물의 polyphenol과 flavonoid 함량이 모두 높게 나타난 것을 알 수 있었으며, 특히 서양민들레의 경우 추출용매에 따른 함량의 차이가 더 크게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 7 cell에 대한 세포독성은 없는 것으로 확인되었다 (Table 3). 한 편, 이미 생성된 NO를 소거할 수 있는 활성의 정도를 확인하기 위해 실시한 NO 소거능 측정에서 흰민들레 에탄올 추출물의 소거능이 가장 뛰어난 것으로 나타났다 (Fig. 2). 모든 추 출물에서 농도의존적인 소거능을 보였으며, 민들레 품종에 상관없이 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 높은 활성을 나타 냈다.
- , 1995). 흰민들레와 서양민들레 추출물이 50%의 tyrosinase 활성을 저해하 는데 필요한 농도인 IC50을 측정한 결과를 Table 2에 나타냈 는데, 흰민들레 열수 추출물이 0.78 ㎎/㎖로 다른 추출물보다 높은 활성을 가지는 것으로 나타냈다. Positive control인 arbutin의 IC50은 0.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해보면 민들레의 품종에 따른 생리활성 의 차이가 일정 부분 존재함을 알 수 있었으나 품종에 따른 활성의 차이보다는 추출용매에 따른 활성의 차이가 더 크게 작용함을 확인할 수 있었다. 세포독성을 나타내지 않는 농도 조건에서 흰민들레 에탄올 추출물이 NO 생성 억제 및 소거 활성이 뛰어난 것으로 나타나 이를 활용한 항염증 관련 활성 을 가지는 소재로 이용될 수 있을 것으로 판단되었으며, 흰민들레 열수 추출물의 경우 tyrosinase 저해 활성을 바탕으로 한 미백 관련 소재로서의 가능성이 확인되었다.
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