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문제 정의
- 본 연구는 누에, 상심자, 상엽, 상지, 산약 및 차가버섯을 편리하게 음용할 수 있도록 제품을 개발하기 위하여 혼합 추출물의 성분과 기능성을 분석한 후 음료를 제조하여 음료의 성분 분석, 기능성 평가 및 동물실험을 수행하였다.
- 이에 본 연구에서는 최근까지 우수한 효능이 연구되어온 뽕나무 산물인 누에, 상심자, 상엽, 상지, 산약 및 차가버섯을 편리하게 음용할 수 있도록 음료로 개발하여 이화학적 특성, 성분 분석, 기능성 평가 및 항당뇨 동물실험을 수행하였다.
가설 설정
- 1)Each value represents the mean±S.E. for groups of seven rats.
- 2)Means followed by the same letter in column are not significantly different(p<0.05).
제안 방법
- 5가 되도록 조제하여 사용하였다. TBARS는 Buege와 Aust의 방법(30)을 약간 수정하여 측정하였다. 1 mL 반응 혼합물이 채워진 시험관을 37℃ water bath에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 1 M citrate buffer를 복강에 주사하였다. 당뇨 유발 확인은 streptozotocin주사 3일 후 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 비공복시 혈당 수준이 300 mg/dL 이상일 때 당뇨병이 유발된 것으로 간주하고 실험을 실시하였다. 당뇨유발 후 5주 동안 A군, B군, C군은 물과 식이를 자유롭게 섭취하게 하였으며, D군은 50% 추출물과 식이를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 당뇨 유발 확인은 streptozotocin주사 3일 후 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 비공복시 혈당 수준이 300 mg/dL 이상일 때 당뇨병이 유발된 것으로 간주하고 실험을 실시하였다. 당뇨유발 후 5주 동안 A군, B군, C군은 물과 식이를 자유롭게 섭취하게 하였으며, D군은 50% 추출물과 식이를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 실험군은 기본식이를 공급한 정상군(A), streptozotocin(STZ)으로 당뇨를 유발한 당뇨 대조군(B), 당뇨 유발 후 16 mL/Kg 추출물 경구투여군(C), 당뇨 유발 후 50% 추출물 자유급여군(D)으로 나누었다. 당뇨의 유발은 streptozotocin(Sigma aldrich, S-0130, USA)을 pH 4.5의 신선한 0.1 M citrate buffer에 용해하여 55 mg/kg 농도로 1회 복강 주사하였고 정상군은 당뇨 유발군과 동일한 스트레스를 주기 위하여 0.1 M citrate buffer를 복강에 주사하였다. 당뇨 유발 확인은 streptozotocin주사 3일 후 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 비공복시 혈당 수준이 300 mg/dL 이상일 때 당뇨병이 유발된 것으로 간주하고 실험을 실시하였다.
- 반응액에 0.1% acetic acid 950 μL를 첨가한 후 0.2 μM syringe filter에 통과시킨 후 24℃를 유지하고 있는 HPLC(Spectra System HPLC ThermoQuest, USA)에 autosampler를 이용하여 20 μL씩 주입하여 분석하였다.
- 사육조건은 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%, 명암시간 12시간(light/dark cycle)으로 조절하면서 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하였으며, 사료는 (주)효창사이언스에서 공급받은 멸균된 실험동물용 고형사료를, 물은 여과된 멸균 정제수를 충분히 공급하였다.
- 가열 후 찬물에서 식힌 후 2,000×g의 속도로 15분간 원심분리시켰다. 상등액을 흡광도(Hitachi UV-2001) 531 nm에서 측정하였고, 공시료는 시료대신에 증류수를 가하여 같은 방법으로 측정하였다. TBARS값은 [1-(시료첨가구의 흡광도-시료의 흡광도/시료무첨가구의 흡광도)]×100으로 나타내었다.
- 사육조건은 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%, 명암시간 12시간(light/dark cycle)으로 조절하면서 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하였으며, 사료는 (주)효창사이언스에서 공급받은 멸균된 실험동물용 고형사료를, 물은 여과된 멸균 정제수를 충분히 공급하였다. 실험군은 기본식이를 공급한 정상군(A), streptozotocin(STZ)으로 당뇨를 유발한 당뇨 대조군(B), 당뇨 유발 후 16 mL/Kg 추출물 경구투여군(C), 당뇨 유발 후 50% 추출물 자유급여군(D)으로 나누었다. 당뇨의 유발은 streptozotocin(Sigma aldrich, S-0130, USA)을 pH 4.
- 음료의 관능평가 요원은 대구한의대학교 학생 27명을 선발하여 이들에게 실험 목적 및 평가 항목에 대해 설명하고 충분한 훈련을 실시하여 품질 차이를 식별할 수 있는 능력을 갖춘 전문패널로 구성하였다. 관능평가법은 5점 기호도 검사법(33)(1점 : 아주 나쁘다, 2점: 나쁘다, 3점: 보통이다, 4점: 좋다, 5점 : 아주 좋다)으로 실시하였다.
- 음료의 주원료, 부원료 및 정제수는 배합비율에 따라 혼합하였다. 배합된 음료를 50~60℃에서 교반하여 완전 용해시킨 후 여과기를 통과시켜 1차 여과하였다.
- 전자공여능은 Blois의 방법(29)을 변형하여 측정하였다. 각 시료 2 mL에 2×10-4 M DPPH 1.
- 배합비는 30여명의 학생을 대상으로 3차례 예비 관능평가를 통하여 결정된 것이다. 제품 1000 kcal당 비타민 A, B1, B2, B6, C, D, E, 나이아신, 엽산, 단백질, 칼슘, 철, 아연을 영양소 기준치의 50% 이상이 되도록 원료식품을 조합하고 영양소를 첨가하였다. 당뇨환자용 식품은 당뇨 환자의 식사 전부 또는 일부를 대신하기 위하여 제품 1000 kcal당 비타민 A, B1, B2, B6, C, D, E, 나이아신, 엽산, 단백질, 칼슘, 철, 아연을 영양소 기준치의 50% 이상 되도록 원료식품을 조합하고 영양소를 첨가하여야 한다.
- 체중 측정은 매주 1회 일정시각에 측정하였으며, 혈당 유도 후 시작 체중과 최종 체중을 비교해 증가량을 나타내었다.
- 조단백질은 Kjeldahl법(26)으로 측정하였다. 탄수화물은 시료전체를 100%로 하여 수분, 조단백질, 조지방, 회분 함량 %를 감한 것을 탄수화물(carbohydrates) 함량(%)으로 하였다.
- 혈당 측정은 혈당 측정 전 12시간 동안 절식시킨 후, 꼬리정맥에서 채혈하여 간이혈당계로 측정하였다.
- 혼합 추출물의 α-glucosidase 저해활성은 Haglind와 Tengblad의 방법(31)을 약간 수정하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용한 시료는 동결건조 누에(백옥잠, 영천양잠조합), 상심자(한울 1호, 한울 2호, 수원뽕, 익수뽕, 영천양잠조합), 상엽(청일뽕, YK209, 영천양잠조합), 상지(부강물산), 산약(부강물산), 차가버섯(러시아산)이다. 동결건조 누에와 상심자는 구입하여 1 Kg단위씩 나누어 -75℃ deep freezer에 보관하면서 사용하였다.
- 사용한 column은 Phenomenex Luna C18 column(4.6×250 mm), 측정온도 24℃, 유속은 1.0 mL/min, 형광검출기는 여기파장 254 nm 및 방사파장 322 nm를 사용하였다.
- 실험동물은 4주령 된 ICR 수컷 마우스를 (주)효창사이언스(대구광역시, 한국)에서 구입하여, 1주일간 일반 고형사료로 적응시킨 후 평균체중이 유사하도록 난괴법에 의해군을 나누어 실험에 사용하였다. 사육조건은 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%, 명암시간 12시간(light/dark cycle)으로 조절하면서 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하였으며, 사료는 (주)효창사이언스에서 공급받은 멸균된 실험동물용 고형사료를, 물은 여과된 멸균 정제수를 충분히 공급하였다.
- 0 mL/min, 형광검출기는 여기파장 254 nm 및 방사파장 322 nm를 사용하였다. 이동상으로는 0.1 % AcOH : CH3CN(50:50, v/v)를 사용하였다.
- 각 추출물은 10배의 증류수를 가하여 초음파기(Kodo technical research Co Ltd, Korea)로 40℃에서 1시간 동안 추출한 후 75℃에서 3시간 동안 환류추출기로 추출하는 방법을 2회 반복한 후 농축하지 않고 실험에 사용하였다. 추출에 사용한 6가지의 시료는 혼합하여 추출한 것을 실험에 사용하였다. 누에, 상심자, 상엽, 상지, 산약 및 차가버섯의 혼합비율은 Table 1과 같다.
데이터처리
- Means followed by the same superscript in a row are not significantly different at the 5% level by Duncan's multiple range test.
이론/모형
- 음료의 관능평가 요원은 대구한의대학교 학생 27명을 선발하여 이들에게 실험 목적 및 평가 항목에 대해 설명하고 충분한 훈련을 실시하여 품질 차이를 식별할 수 있는 능력을 갖춘 전문패널로 구성하였다. 관능평가법은 5점 기호도 검사법(33)(1점 : 아주 나쁘다, 2점: 나쁘다, 3점: 보통이다, 4점: 좋다, 5점 : 아주 좋다)으로 실시하였다. 음료 관능평가의 평가 항목은 외관의 색, 향, 단맛, 쓴맛 및 종합적인 기호도이었다.
- 수분함량은 상압건조법(23)에 따라 측정하였다. 조회분은 AOAC(24)에 준하여 실시하였다.
- 유리당 분석은 식품공전(27)(일반시험법 당류시험법)의 방법에 따라 실시하였다. 시료 약 5 g을 50 mL 메스플라스크에 정밀히 달아 증류수 25 mL를 가하여 녹인 후 acetonitrile로 50 mL까지 정용하였다.
- 조지방은 Soxhlet법(25)으로 측정하였다. 조단백질은 Kjeldahl법(26)으로 측정하였다. 탄수화물은 시료전체를 100%로 하여 수분, 조단백질, 조지방, 회분 함량 %를 감한 것을 탄수화물(carbohydrates) 함량(%)으로 하였다.
- 조회분은 AOAC(24)에 준하여 실시하였다. 조지방은 Soxhlet법(25)으로 측정하였다. 조단백질은 Kjeldahl법(26)으로 측정하였다.
- 수분함량은 상압건조법(23)에 따라 측정하였다. 조회분은 AOAC(24)에 준하여 실시하였다. 조지방은 Soxhlet법(25)으로 측정하였다.
- 혈청alanine aminotransferase (ALT) 및 aspartate aminotransferase (AST) 활성도는 Reitman과 Frankel의 방법(34)에 준해 제조된 kit (Eiken Co)를 이용하여 측정하였으며, 효소의 활성도는 혈청 1 mL 당 1분간에 NADH의 흡광도를 0.001 감소시키는 활성능을 1단위로 하는 Karmen unit로 나타내었다.
- 혼합 추출물의 1-deoxynojirimycin(DNJ) 함량은 Stead와 Richards의 방법(28)으로 분석하였다. 시료 0.
성능/효과
- 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료 공급이 당뇨를 유발한 흰쥐의 간지표 효소인 ALT 및 AST 활성에 미치는 영향을 관찰하여 Table 10에 나타내었다. ALT 활성은 정상군(A)에 비해 당뇨 대조군(B)에서 유의적인 증가를 나타내었으며 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료 투여 시 ALT 활성이 감소되었는데 특히 50%로 희석한 음료 공급군(D)에서 정상군(A)과 유사한 수치를 나타내었고, 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료를 경구투여한 군(C)에서도 감소 정도가 큰 것으로 분석되었다.
- AST 활성은 당뇨 대조군(B)에서 유의적으로 증가하였고, 50%로 희석한 음료 공급군(D)에서 유의적인 감소가 나타났으며, 양잠산물을 경구투여한 군(C)에서도 AST 활성이 감소하는 경향을 나타내었다.
- 37%로 나타났다. H2O2와 반응한 경우 32.99%의 억제능을 나타내었고 KO2와 반응한 경우 79.83%의 억제능을 나타나 특히 KO2에 대한 억제능이 높은 것으로 나타났다. 전반적으로 음료 농도에 비례하여 지방 산패를 억제하는 경향을 나타내었다.
- Streptozotocin으로 당뇨를 유발한 후 5주간 음료를 공급하여 혈당의 변화를 측정한 결과 실험 기간 중 정상군(A)은 혈당변화가 거의 없었으며, 당뇨 대조군(B)은 2주째부터 5주차까지 비슷하게 경향의 높은 혈당치를 나타내었다. 음료 경구 투여군(C)에서는 2주차부터 당뇨 대조군(B)에 비해 낮은 혈당치를 나타내었다.
- 이는 본 실험에서 음료를 제조하기 위하여 첨가한 혼합 추출물 속의 다양한 소재들의 상승효과에 따른 결과인 것으로 사료된다. TBARS를 측정한 결과 음료 농도 5%에서 지방산패능은 37.37%로 나타났다. H2O2와 반응한 경우 32.
- 혼합 추출물을 이용하여 음료를 제조한 후 기능성을 평가한 결과는 Table 7과 같다. Total polyphenol 함량을 측정한 결과 음료 농도 5%가 71.93%로 가장 높은 함량을 나타내었고 1%와 3%는 각각 63.37%와 64.24%로 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 전자공여능은 음료 농도 5%에서 60.
- 047%로 분석되었었고 maltose와 sucrose는 분석되지 않았었다. 그러나 음료를 만든 후 유리당 분석 결과와 비교했을 때 fructose와 glucose의 양이 증가하였고 maltose와 sucrose가 나타났다. 이는 음료 제조 시 첨가한 다양한 재료들의 영향인 것으로 사료된다.
- 누에 25%, 상심자 15%, 상엽 15%, 상지 15%, 산약 15% 및 차가버섯 15%의 비율로 혼합한 추출물은 조단백질 0.31%, 유리당 0.114 g/100 mL, DNJ 161.02 mg/gdw을 함유하고 있으며 항산화성을 검토한 결과 모든 항목에서 고르게 우수한 결과를 나타내었다. 또한 α-glucosidase 저해활성도 우수하였다.
- 본 실험에서 α-glucosidase의 저해효과가 김 등(38)이 보고한 강원도산 상엽과 누에의 α-glucosidase 저해효과보다 높았는데 이 역시 본 실험의 추출물의 DNJ 함량이 높게 나타나 이러한 것이 α-glucosidase 저해활성에 영향을 미친 것으로 사료된다.
- Streptozotocin(STZ)으로 당뇨를 유발한 후 5주간 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료를 공급하여 체중변화를 측정한 결과는 Table 9와 같다. 실험 기간 시작과 마지막 체중을 비교한 결과 4군 모두 눈에 띄는 체중 변화를 나타내지 못했으나, 당뇨 대조군인 B군과 경구 투여 실험군인 C군에서는 미묘한 체중 감소 경향을 나타내었다. 이것은 streptozotocin(STZ) 투여 후 실험 시작과 마지막에 체중을 비교한 이 등(40)의 결과와 유사한 경향을 나타낸 것으로 STZ 투여에 의한 insulin 생성 부족으로 당뇨가 유발되면 에너지 대사에 이상이 발생하기 때문인 것으로 해석되고 있다.
- 1에 나타내었다. 실험 기간 중 정상군(A)은 혈당변화가 거의 없었으며, 당뇨 대조군(B)은 당뇨유발 2주까지는 다소 큰 혈당 증가를 나타내다가 2주째부터 5주 차까지 비슷하게 경향의 높은 혈당치를 나타내었다. 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료 경구 투여군인 C군에서는 1주차에서는 당뇨 대조군에 비해 높은 혈당치를 나타내다가 2주차부터 당뇨 대조군(B)에 비해 낮은 혈당치를 나타내었으며, 3주차부터 5주차까지는 비슷한 혈당치를 나타내었다.
- 19%이었다. 유리당은 fructose 0.067 g/100 mL, glucose 0.047 g/100 mL이었고 DNJ는 161.02 mg/gdw을 함유하고 있었으며 항산화성을 검토한 결과 모든 항목에서 우수한 결과를 나타내었다. 또한 α-glucosidase 저해활성도 우수하였다.
- 1 kcal를 나타내었다. 유리당은 fructose 1.109%, glucose 1.600%, maltose 0.332% 및 sucrose 0.179%로 나타났다. 혼합 추출의 유리당 분석 결과에서는 fructose 0.
- 관능평가법은 5점 기호도 검사법(33)(1점 : 아주 나쁘다, 2점: 나쁘다, 3점: 보통이다, 4점: 좋다, 5점 : 아주 좋다)으로 실시하였다. 음료 관능평가의 평가 항목은 외관의 색, 향, 단맛, 쓴맛 및 종합적인 기호도이었다.
- 음료의 유리당 함량 분석 결과 fructose와 glucose 가 증가하였다. 음료의 기능성을 평가한 결과 total polyphenol 함량은 71.93%이었고 전자공여능은 농도 5%에서 가장 높았으며 TBARS를 실험한 결과 특히 KO2에 대한 억제능이 높은 것으로 나타났다.
- 9%로 나타났다. 음료의 유리당 함량 분석 결과 fructose와 glucose 가 증가하였다. 음료의 기능성을 평가한 결과 total polyphenol 함량은 71.
- 또한 α-glucosidase 저해활성도 우수하였다. 이러한 실험 결과를 종합했을 때 음료 제조에 적합한 소재로 판단되었다. 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료의 당도, pH, 색차 및 탁도를 측정한 결과는 Table 5와 같다.
- 누에, 상심자, 상엽, 상지, 산약 및 차가버섯 혼합 추출물의 기능성을 평가한 결과는 Table 4와 같다. 전자공여능과 지방산패 억제능은 전반적으로 높은 기능성을 나타내었으나 시료 간에 유의적 차이가 크지는 않았다. α-Glucosidase 억제능은 추출물 농도 100%에서 79.
- 24%로 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 전자공여능은 음료 농도 5%에서 60.97%로 가장 높았고 음료 농도 1%와 3%는 각각 57.00%, 57.53%로 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 조 등(39)은 청일뽕 품종의 뽕잎이 55.
- 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료 경구 투여군인 C군에서는 1주차에서는 당뇨 대조군에 비해 높은 혈당치를 나타내다가 2주차부터 당뇨 대조군(B)에 비해 낮은 혈당치를 나타내었으며, 3주차부터 5주차까지는 비슷한 혈당치를 나타내었다. 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료 자유급여군인 D군은 처음 1주차까지는 당뇨 대조군(B)에 비해 높은 혈당치를 나타내다가 2주차부터 혈당치가 완만하게 떨어져 최종 5주 차에서는 당뇨 유발 시험물질 투여군 중 가장 낮은 혈당치를 나타내는 경향을 보였다. 최 등(41)은 누에 추출물을 이용한 기능성 항당뇨음료의 개발에 관한 연구에서 뽕잎 추출물은 대조그룹에 비하여 전혀 유의적인 혈당강하효과를 기대할 수 없었다고 하였다.
- 혼합 추출물을 이용하여 제조한 음료의 일반성분을 분석한 결과 조단백질 0.42%, 조지방 0.31 및 탄수화물 9.9%로 나타났다. 음료의 유리당 함량 분석 결과 fructose와 glucose 가 증가하였다.
- 혼합 추출물의 일반성분 분석 결과 조단백질 0.31%, 조지방 0.38%, 탄수화물 0.42% 및 조회분 0.19%이었다. 유리당은 fructose 0.
- 179%로 나타났다. 혼합 추출의 유리당 분석 결과에서는 fructose 0.067%, glucose 0.047%로 분석되었었고 maltose와 sucrose는 분석되지 않았었다. 그러나 음료를 만든 후 유리당 분석 결과와 비교했을 때 fructose와 glucose의 양이 증가하였고 maltose와 sucrose가 나타났다.
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