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문제 정의
- 그러나 약용 식물을 이용하여 혼합 중탕하여 만든 제품은 음료수로 장기간 복용하는데 무리가 있고, 특히 맛에 있어서 기호도가 낮다는 단점이 있으므로 본 연구에서는 기존의 혼합 중탕 방법대신 증류 냉각 추출하여 맑고 투명한 증류 추출물을 만들어 항산화성, 乃0;orz.에 대한 항균성, 흰쥐를 이용한 지질과 과산화물대사에 미치는 효과 및 기호성을 조사하여 약용식물을 이용한 기능성 음료 개발의 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 15종류의 한약재를 기존의 혼합 중탕 방법이 아니고 증류냉각 추출하여 맑고 투명한 음료를 만들어 이들의 기능성과 기호성을 조사하기 위하여 증류 냉각 주줄하여 만든 물주줄물과 발효 숙성시킨 후 증류 냉각 추출하여 발효 추출물을 만들어 항산화성, H. pylorie 대한 항균성 및 흰쥐에게 5주간 경구 투여한 후 혈청과 간장의 지질 조성 및 과산화 지질에 미치는 영향에 대한 결과를 요약하면 아래와 같다.
- pylori를 접종하고 멸균한 10 mm paper disc를 놓은 후 시료를 50 /zL씩 paper disc에 흡수시켰다. 3 7℃의 미 호기성 조건에서 24시간 배양 후 disc 주위에 생긴 clear zone 의 직경 (mm) 을 측정하여 항균 활성을 비교하였다. 대조군으로 WE와 FE 대신에 증류수를 흡수시켰다.
- 이 발색의 정도를 비색 정량하여 지방에 대한 시료의 항산화성을 측정하였다. Buege & Aust(1978)의 수정 방법에 따라 한약재 추출물 1 mL를 콩 식용유((주)오뚜기) 3.0 으에 첨가하여 40”C에서 24 시간 동안 과산화를 유도시킨 후 3M trichloroacetic acid와 2.5N- HC1 의 혼합용액 1 mL와 증〒 수 1 mL를 가하고 3, 000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상징액 1 mL를 취하여 0.67 % TBA 1 mL를 가하여 혼합하고 끓는 물속에서 30분간 가열하여 발색시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정한 후 시료의 thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 값을 대조군의 값과 비교하여 상대적 항산화 효과값(relative antioxidant effectiveness, RAE)으로 항산화 효과를 비교하였다. 이때 활성의 비교를 위하여 합성 항산화제인 butyl hydroxy toluene(BHT) 을 3.
- 준비된 두 약주머니를 가열 탱크에 넣고, 물 100 L를주입한 후 모든 밸브를 잠그고, 100℃가 되도록 4시간~4시간 30분정도 중불에서 가열하였다. 냉각기에 수돗물을 넣어 냉각수를 저장한 후 냉각기에 물이 넘쳐흐르면 모든 밸브를 열고 이때부터 파이프를 통해 나오는 수증기를 응축시켜 음료수를 제조하였다(Fig. 1).
- 준비된 두 약주머니를 가열 탱크에 넣고, 물 100 L를주입한 후 모든 밸브를 잠그고, 100℃가 되도록 4시간~4시간 30분정도 중불에서 가열하였다. 냉각기에 수돗물을 넣어 냉각수를 저장한 후 냉각기에 물이 넘쳐흐르면 모든 밸브를 열고 이때부터 파이프를 통해 나오는 수증기를 응축시켜 음료수를 제조하였다(Fig. 1).
- 발효시킨 후 삼베주머니 1에 넣었다. 식초와 물(3:7)을 끓여 식힌 후 전통옹기에 담아 30일 이상 발효시킨 매실과 동충하초, 다시마, 대추, 국화를 전통 옹기에 넣어 37~38℃에서 12시간 발효시킨 것을 삼베주머니 2에 넣어 준비한 후 가열 탱크에 넣고, 100 L까지 물을 주입한 후 모든 밸브를 잠그고 100℃가 되도록 4시간~4시간 30분 정도 중불에서 가열하였다. 냉각기에 수돗물을 넣어 냉각수를 저장한 후 냉각기에 물이 넘쳐흐르면 모든 밸브를 열고 이때부터 파이프를 통해 나오는 수증기를 응축시켜 음료를 제조하였다(Fig.
- 실험 기간이 종료된 실험 동물은 12시간 절식시킨 후 diethyl ether로 마취시켜 개복한 후 심장으로부터 혈액을 채취하여 혈액의 지질 분석에 사용하였으며, 혈액을 채취한 후 ice bath 위에서 즉시간을 떼어 ice cold saline에 넣어 세척한 다음 여지로 물기를 제거한 후 무게를 측정하고 -70℃ deep freezer에 보관하여 지방과 과산화물 함량 측정에 사용하였다.
- 반응하여 붉은 색소를 형성한다. 이 발색의 정도를 비색 정량하여 지방에 대한 시료의 항산화성을 측정하였다. Buege & Aust(1978)의 수정 방법에 따라 한약재 추출물 1 mL를 콩 식용유((주)오뚜기) 3.
- 이때 활성의 비교를 위하여 합성 항산화제 인 butyl hydroxy toluene(BHT)를 3.5 mg/mL 농도로 첨가하여 활성을 비교하였다.
- 67 % TBA 1 mL를 가하여 혼합하고 끓는 물속에서 30분간 가열하여 발색시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정한 후 시료의 thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 값을 대조군의 값과 비교하여 상대적 항산화 효과값(relative antioxidant effectiveness, RAE)으로 항산화 효과를 비교하였다. 이때 활성의 비교를 위하여 합성 항산화제인 butyl hydroxy toluene(BHT) 을 3.5 mg/mL 농도로 첨가하여 활성을 비교하였다.
- 이때 활성의 비교를 위하여 합성 항산화제 인 butyl hydroxy toluene(BHT)를 3.5 mg/mL 농도로 첨가하여 활성을 비교하였다.
- 표준시액은 TEP(1, 1, 3, 3-tetraethoxy propane)을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- ^.^-(Cnidium) 등의 약용식물로 2005년 4월과 8월에 경상북도 경산시 한국생약협회로부터 구입하여 사용하였다. 사용된 재료의 분량은 물 100 L에 해당된다(Table 1.
- 실험동물은 Sprague-Dawley(SD)계 웅성 rat로서 생후 5주 된 흰쥐 30마리를 구입하여 1 주간 적응시킨 후 난괴 법 (completely randomized design)을 이용하여, 10마리씩 3군{대조군, 물추출물(WE) 군, 발효추출물(FE) 군}으로 분류하여 사육하였으며, 사육기 간 중 온도는 23±3℃, 습도는 40-70%, lighting cyclee 12시간을 유지하였고 5주간의 실험기간 동안 사료와 물 추출물, 발효 추출물과 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였으며, 이때 물은 2차 이온 교환수를 사용하였다.
- 실험에 사용한 균주는 H. pylori로서 표준균주인 KCTC 2948 을 유전자 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 배양은 10% (v/v) 의 calf serum을 함유하는 brucella broth(Difco, USA) 를사용하여 10% CO』incubator 에서 microaerobic condition을유지시켜 주며 배양하였다.
- 음료에 대한 관능검사요원은 대구대학교 식품영양학과 4 학년 학생 20명을 선정하여 사전 교육을 시킨 후 검사에 응하도록 하였다. 음료는 흰색 컵(지름 7 cm)에 50 mL씩 담아 제공하였다.
데이터처리
- SPSS 10.0을 사용하여, 평균과 표준오차를 구하였으며, one way ANOVA에 의해 刀<0.05에서 유의차가 있는 항목에 대해서는 Duncan's multiple range test로 군간 유의차를 검증하였다.
이론/모형
- 배양은 10% (v/v) 의 calf serum을 함유하는 brucella broth(Difco, USA) 를사용하여 10% CO』incubator 에서 microaerobic condition을유지시켜 주며 배양하였다. H. pylori를 1.7xlO7(CFU/mL)의농도의 것을 사용하였으며 한약재 추출물과 발효 추출물의 항균 활성은 disc 방법에 의해 확인하였다. Brucella agar 배지 (Difco, USA)에 H.
- Superoxide anion radical 소거활성 측정은 Marklund & Markhmd(1974)의 방법에 따라 각 시료 0.2 mL에 pH 8.5로 보정 한 Tris HC1 buffer 3 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를가하고 25℃에서 10분간 방치 후 1 N HC1 1 mL로 반응 정지시킨 후 420 nm에서 Spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, 아래 공식에 의해 SOD 유사활성을 계산하였다. 이때 활성의 비교를 위하여 합성 항산화제인 butyl hydroxy toluene(BHT)를 3.
- 간 조직 0.1 g에 생리식염수 2 mL를 넣어 균질기로 균질화 한 후 Folch & Lee(1957)의 방법에 의해 지질을 추출하였고, Sale et al (1984)의 방법에 의해 효소 kit(아산제약, 한국) 를 사용하여 간 조직의 총 콜레스테롤과 중성지방을 측정하였다.
- 전자 공여능은 Blois(1958)의 방법에 따라 4.0xl0“3 4 * * M DPPH 용액(99.9% ethanol에 용해) 2.8 mL에 시료 0.2 mL를 넣고 30분 후 516 nm에서 Spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, 아래 공식에 의해 전자공여능을 계산하였다.
- 음료는 흰색 컵(지름 7 cm)에 50 mL씩 담아 제공하였다. 평가 내용은 음료의 향, 색(탁도), 맛, 신선함, 전반적인 기호도이며, 5점 hedonic scale(Moskowitz & Jacobs 1988)에 의하여 평가하였다. 각 검사 항목을 ‘매우 좋다 5점’ ‘보통이다 3점’ ‘매우 나쁘다 1점’으로 평가하여, 기호도가 좋을수록 높은 점수를 주도록 하였다.
- 혈장과 간의 지질 과산화물 함량은 thiobarbituric acid(TBA) 와 반응하여 생성된 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)으로 측정하는 Yagi(1994)의 방법에 따라 측정하였다. 표준시액은 TEP(1, 1, 3, 3-tetraethoxy propane)을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 혈장의 중성 지방 농도와 총 콜레스테롤 및 HEmL-콜레스테롤 농도는 효소법 (Richmond W 1973)을 이용한 분석 kit (아산제약, 한국)을 사용하여 각각 550 패와 500 패에서 비색정 량하였으며, LDLr콜레스테롤 농도는 지질 측정치를 Friedwald(1972) 공식을 이용하여 다음과 같이 계산하였다.
성능/효과
- 1. 항산화성의 전자공여능 활성은 WE이 FE보다 유의적⑦< 0.05)으로 높았으며 인공적인 항산화제 BHT보다 낮게 나타났다. SOD 활성도는 추출물이 합성 항산화제인 BHT 보다 유의적⑦<0.
- 2. FE의 clear zone의 직경은 대조군과 WE의 직경보다 유의적으로 크게 나타나 H. 0/orz'에 대한 높은 항균성을 나타내었다.
- 3. 혈중 총 콜레스테롤, 혈중 중성 지질과 혈중 LDL-콜레스테롤은 대조군에 비하여 따군에서 유의적⑦<0.05) 으로 낮았다. 혈중 HDL-콜레스테롤은 WE군, FE 군과 대조군에서 유의적인 차이는 없었다.
- 4. 간의 중성지 방과 총 콜레스테롤 함량은 대조군과 FE 군에 비해 따군에서 유의적⑦<0.05)으로 낮은 함량을 보였다.
- 5. 혈중 지질 과산화물 함량은 따군이 대조군과 FE 군에 비하여 유의적으로⑦<0.05) 낮은 경향을 보였으며 간의 지질 과산화물 함량은 군 간에 유의적인 차이는 없었다. 6.
- 05) 낮은 경향을 보였으며 간의 지질 과산화물 함량은 군 간에 유의적인 차이는 없었다. 6. 맛과 냄새의 기호도는 WE에 비해 FE가 높았으며, 색 (탁도)의 기호도와. 청 량감의 기호도는 유의적인 차이가 없었다.
- 3, 4와 같다. FE의 clear zone의 직경은 12.84 mm로대조군 10.19 mm보다 통계적으로 유의적인 차이 (p<0.05)를보여 가장 큰 항균 활성을 나타냈으며, WE도 10.90 mm로대조군 10.19 mm에 비해 높은 항균성을 가지는 것으로 나타났으나 유의적인 차이는 없었다. 천연물을 이용한 H.
- 05)으로 높았으며 인공적인 항산화제 BHT보다 낮게 나타났다. SOD 활성도는 추출물이 합성 항산화제인 BHT 보다 유의적⑦<0.05)으로 높은 활성을 보였으며, FE과합성 항산화제인 BHT는 유의적인 차이는 없었다. WE 의 RAE와 FE의 RAE는 인공 항산화제 인 BHT의 RAE 보다 유의하게⑦<0.
- 05)으로 높은 활성을 보였으며, FE과합성 항산화제인 BHT는 유의적인 차이는 없었다. WE 의 RAE와 FE의 RAE는 인공 항산화제 인 BHT의 RAE 보다 유의하게⑦<0.05) 높은 항산화력을 나타내었다.
- 향기와 맛의 기호도는 FE이 따에 비해 높게 평가되었으나, 신선함의 기호도는 FE와 WE 간에 차이가 없었으며, 오히려 색의 기호도에서 WE가 FE보다 높았으나 유의적인 차이는 없었다. WE와 FE의 전반적인 기호도가 hedonic score에서 각각 3.26, 3.43으로 FE가 파보다 높은 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다. 특히 FE는 WE에 비해 맛과 냄새에 대한 기호가 높게 나타났는데, 이는 본 실험에서 한약재를 전통 옹기에서 자연 발효 숙성시켰을 때 맛과 향을향상시킬 수 있는 것으로 사려된다.
- Table 2와 같다. WE의 RAE(1.57)과 FE의 RAE(1.55) 는 인공 항산화제인 BHT의 RAE 값 1.37 보다 유의한 차이를 보여⑦<0.05) 높은 지질 과산화 억제 활성을 나타내었다. 한약재에 대한 실험(Park 2002, Park & Kim 2006)에서 구기자를 제외하고 BHT의 RAE 값 1.
- Superoxide anion 라디칼을 제거하는 SOD의 유사 활성을 측정한 결과는 Table 2에 나타내었다. WE의 SOD는 50.35%로 합성항산화제인 BHT의 SOD 활성도 35.68%에 비해 유의적인 차이를 보였으며⑦<0.05), FE의 SOD는 35.72%로 합성항산화제인 BHT의 SOD 활성도 35.68%와 유사한 효과를 나타내고 있었다. 본 연구에서 제조된 짜는 DPPH 라디칼에 대한 소거 능은 상대적으로 낮았으나 hydroxyl 라디 칼에 대하여 50% 정도의 소거능을 나타내어 실제로 체내에서 생성된 hydroxyl 라디칼에 대해서 매우 유용할 것으로 사료된다.
- 간의 중성 지방 함량은 따군이 45.34±3.98 mg/g liver로 대조군의 58.72± 5.21 mg/g liver 과 FE의 57.98±4.44 mg/g liver 보다 유의하게⑦<0.05) 낮았으며, 대조군과 FE군은 유의적인 차이가 없었다. 고지방 식이와 차전자수액(Cho & Kim 1995) 을 급여한 결과 총 콜레스테롤 과 중성 지방을 감소시켰다고 보고되어 본 연구와 같은 결과를 보였다.
- 나타내었다. 간의 총 콜레스테롤 함량은 WE군이 31.24± 3.21 mg/g liver로 대조군 42.44±4.69 mg/g liver보다 유의적인 감소를 보였으며 (p<0.05), FE군은 40.18±5.21 mg/g liver 로 대조군보다 낮은 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다. Kang et a/(1996)이 횐쥐에 3% 솔잎 추출액을 경구 투여하였을 때 간의 총 콜레스테롤 함량을 유의적으로 감소되었으며, 고 콜레스테롤 혈증 횐쥐에 영지 추출액, 케일녹즙 등을 급여한 Chung et a/(1991)의 연구에서 영지 추출액의 섭취 군이 다른 실험군에 비해 간장 중성지방의 농도가 유의적으로 저하되었으며, 반면 케일 녹즙의 섭취가 총 콜레스테롤의 농도를 현저하게 낮춘다고 보고되어 있다.
- 결론적으로 약용식물의 증류 추출물은 전자공여능, SOD 에서 높은 항산화성을 보였으며, 흰쥐의 동물실험에서 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, LDL-콜레스테롤과 지질 과산화물생성 억제 효과뿐만 아니라 발효 숙성함으로써 우리나라 사람들에게 많은 위염의 인자로 알려진 H. pylori 균의 발육에 대한 저해 효과 및 맛과 냄새(향기)의 개선 효과를 고려해 볼 때 약용 식물의 증류 추출물과 발효 증류 추출물을 이용하여 맑고 투명한 기능성 음료로서의 이용 가능성을 확인하였다.
- 인체를 대상으로 한 연구를 보면 Shin & Lee(2004)이 성인 남자를 대상으로 12주간 오가피 추출물을 1일 3회(30 mL/1 회)씩 공급한 결과, 안정시의 TBARS 값은 오가피 섭취 12주후부터 유의적으로 감소하였고 운동 후 회복기 TBARS 값은 6주 후부터 유의적으로 감소하였다. 본 연구 결과 혈액내의 과산화 지질 함량은 TBARS에 의한 상대적 항산화물 값인 높은 WE을 먹인 군에서 혈액 및 간의 과산화지질의 생성 정도가 낮은 것으로 나타나 in vifro에서 지질 과산화 억제 활성을 나타낸 추출물이 생체 내에서도 지질 과산화물의 생성을 억제시키는 경향으로 나타났다.
- p/orz■에 대한 항균 활성이 강한 것으로 나타났고, 감초, 갈근, 당귀, 차조의 에탄올 추출물에서 강한 항균 활성이 나타났다(Park & Kim 2006). 본 연구에서는 WE의 H. pylori 균에 대한 항균 효과는 FE에 비해 약하게 나타났으나 FE의 H. pylori 균에 대한 항균 효과는 유의적인 차이가 나타났다. 한약재를 발효하였을 때 우리나라 사람에게 위염의 중요 인자로 알려진 H.
- 일으키 게 된다(Markland & Markland 1974). 위의 결과합성 항산화제인 BHT 와 비교하여 볼 때 WE과 FE 의 항산화 효과가 BHT의 항산화 효과보다 더 높은 것으로 나타나 WE 과 FE이 항산화제로 이용 가능성을 보여주었다.
- 기능성 음료로서의 항산화성을 평가하기 위해 전자공여능을 측정한 결과는 Table 2에 나타내었다. 짜에서 24.47%의 전자공여 능을 나타내었으며, FE에서는 12.01%의 전자공여 능을 가지는 것으로 나타났으며, 인공 항산화제인 BHT의 전자공여 능 32.17%보다 유의적으로 낮게 나타났다⑦<0.05). 한약재 추출물의 재료로 사용된 한약재에 대한 전자공여능에 대한 실험(Park 2002, Park & Kim 2006)에서 사용된 한약재 각각은 높은 전자공여능을 갖고 있는 것으로 나타났으며 Kim et a/(1995)의 생 약 추출물의 전자 공여능에 관한 연구에서도 목단, 황금, 작약, 구기자 등의 100 ppm의 농도에서 전자 공여 능이 36.
- 43으로 FE가 파보다 높은 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다. 특히 FE는 WE에 비해 맛과 냄새에 대한 기호가 높게 나타났는데, 이는 본 실험에서 한약재를 전통 옹기에서 자연 발효 숙성시켰을 때 맛과 향을향상시킬 수 있는 것으로 사려된다.
- 5는 WE과 FE에 대하여 기호도를 측정한 결과를 나타내었다. 향기와 맛의 기호도는 FE이 따에 비해 높게 평가되었으나, 신선함의 기호도는 FE와 WE 간에 차이가 없었으며, 오히려 색의 기호도에서 WE가 FE보다 높았으나 유의적인 차이는 없었다. WE와 FE의 전반적인 기호도가 hedonic score에서 각각 3.
- 측정한 결과는 Table 5와 같았다. 혈장의 지질 과산화물 함량은 대조군, WE$, FE군에서 각각 84.56±4.82, 66.72± 6.48, 78.08±8.71(nmol/mL)로 물을 섭취한 대조군에 비해 WE 군의 지질 과산화물 함량이 유의적인 차이를 보였으며(p<0.05), E군은 낮은 경향을 보였으나 유의한 차이는 없었다. 간조직의 과산화물 함량은 대조군, WE군, FE 군에서 각각 3.
- 혈중 총 콜레스테롤 농도는 WE군이 71.3H7.75 mg/100 niL로 대조군 87.58±6.98 mg/100 mL에 비해 통계적으로 유의하게 (p<0.05) 낮게 나타났으며, FE군은 81.60±7.12 mg/100 mL로 대조군에 비해 낮은 경향을 보였으나 통계적으로 유의적인 차이는 없었다. 동물을 대상으로 한 연구를 살펴보면 Cho & Kim(1995)은 수컷 흰쥐에 고지방식이와 차 전자수액 병행 투여시 총 콜레스테롤의 증가가 유의적으로 억제된다고 보고하여 본 연구와 비슷한 결과가 나타났으나, 반면 Kang et a/(1996)은 흰쥐에 솔 잎추출물을 투여한 실험군과 대조군간의 혈중 총 콜레스테롤 농도에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
후속연구
- 68%와 유사한 효과를 나타내고 있었다. 본 연구에서 제조된 짜는 DPPH 라디칼에 대한 소거 능은 상대적으로 낮았으나 hydroxyl 라디 칼에 대하여 50% 정도의 소거능을 나타내어 실제로 체내에서 생성된 hydroxyl 라디칼에 대해서 매우 유용할 것으로 사료된다. Lim et al (2004)의 연구에 따르면 오가피, 구기자, 갈근, 황금의 활성 능이 각각 13.
- pylori 균에 대한 항균 효과는 유의적인 차이가 나타났다. 한약재를 발효하였을 때 우리나라 사람에게 위염의 중요 인자로 알려진 H. pylori 균의 생육을 억제할 수 있는 항균 기능이 활성화되는 것으로 나타나 한약재 및 herb 등을 이 용하여 H. pylori 균에 항균 효과가 있는 물질 개발이 가능할 것으로 생각되며 앞으로 더 많은 연구가 필요하겠다.
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