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문제 정의
- 23) 따라서 본 실험에서는 한약 복합 추출물이 아토피 피부염 개선에 어떤 효과가 있는지를 연구하였다. 아토피 피부염 질환은 지속적인 알레르겐의 차단 없이는 치료 또는 완치되기 힘든 질환 중 하나로 현재 스테로이드성 약물에 의한 치료제가 대부분이며, 그 외에도 보습 및 외부 항원 차단 노력 등으로 치료를 하고 있는 실정이다.
제안 방법
- 본 실험에서 사용한 약재인 약모밀, 복분자, 생지황, 참당귀, 화피는 옴니허브(Korea)에서 구입하여 100g 정량 후 1L의 80% 에탄올에 30분 동안 초음파분해 하였다. 3mm 여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압하여 여과한 후, 여과된 에탄올 추출물을 감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 농축한 후, 동결건조(Freezedryer, Matsushita, Japan)하였다. 얻은 분말은 CP001(약모밀, 복분자, 생지황, 화피), CP002(약모밀, 복분자, 생지황, 참당귀)로 나누어 각각 1:1:1:1의 비율로 배합하여 3차 증류수에 200mg/ml 농도로 녹인 후 사용하였다.
- 8주령의 암컷 BALB/c 동물에 오발부민 20㎍과 4㎎의 수산화알루미늄 수화물을 식염수에 혼합하여 일주일에 한 번씩 3주간 복강에 투여하여 아토피 감작을 유도하였다. 오발부민 복강투여 3주 후 100㎍의 오발부민과 20㎎ 수산화알루미늄 수화물 혼합물을 제모한 등 피부에 1×1㎝ 패치에 3주간 감작시켜 동물 등 피부 국소부위에 피부염을 유도하였으며 2일에 한 번씩 반복하였다.
- 본 실험에서는 현대 산업사회에서 점점 증가 하는 질병 중 하나인 아토피 피부염 치료에 효과가 있을 것으로 기대되는 복합 한약 추출물을 아토피 피부염이 유도한 동물의 등 피부에 도포하여 피부염 개선 효과를 확인하였다. BALB/c 마우스에 아토피 피부염을 유발하기 위해 오발부민 아토피 피부염 유도 모델을 사용하였으며, 증강된 피부 감작을 유도하기 위해 일반적인 제산제로 알려진 수산화알루미늄 수화물을 오발부민에 함께 혼합하여 복강 주사 후 재차 피부에 도포하였으며, 복합 한약 추출물 또한 피부에 도포하였다.
- CD3 항체는 제1형, 제2형 전체 T 세포를 인지할 수 있는 항체로 한약 복합 추출물 투여에 의한 전체 T 세포의 감소정도를 확인하기 위해 피부조직에서 CD3 면역염색법을 통해 변화를 살펴보았다. 그 결과 표피 부분에서 CD3 발현정도의 변화를 확인할 수 있었는데, OVA군에서 정상군보다 확연히 CD3의 발현이 증가하는 것을 확인 할 수 있으며, 한약 복합 추출물 도포 시 표피 CD3 발현이 감소하였다.
- 실험이 끝난 후 동물 마취제인 럼푼(rompun)과 졸레틸(zoletil)을 과량 투여하여 마취시킨다음 개복한 후 1㎖ 주사기를 이용하여 심장에서 채혈하였다. EDTA가 처리된 튜브(Becton Dickinson Vacutainer system, USA)에 모은 후 자동혈액분석기(HEMAVET 950, Drew Scientific, LTD, UK)를 이용하여 백혈구, 호중구, 호산구, 단핵구 등의 수치 변화를 검사하였다.
- ELISA로 IgE 수준을 확인하기 위한 플라즈마를 분리하는 방법으로, 먼저 심장에서 채혈한 혈액은 EDTA 튜브(Becton Dickinson Vacutainer system, USA)에 보관 후, 2000rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 원심 분리 후 상층액만 새 튜브에 담아 실험 전까지는 -20℃에 보관해 두었다.
- 5㎕, 증류수 7㎕로 모두 20㎕의 부피가 되도록 준비하였다. PCR의 반응은 총 45회 주기를 돌며, 결과는 house keeping gene인 GAPDH로 target gene(IL-13, IL-17)을 보정한 비율을 수치화하였다. 각 프라이머의 sequence는 Table 1에 나타내었다.
- Real-time PCR은 이중DNA에 특이적으로 결합하는 SYBR green(Roche, USA) 형광 염료를 사용하여 Lightcycle-96(Roche, USA)기계를 이용하여 실험을 수행하였다. 실험에 사용한 시료의 조건은 cDNA 2㎕, SYBR green 10㎕, 프라이머 sense 0.
- 경희대 한의과대학 동물실의 사육환경은 온도 24 ± 2℃, 습도 40∼60%, 주야 12시간 교대로 150∼300Lux의 환경이었으며 마우스용 케이지에 4마리씩 수용하여 사육하면서 멸균 증류수와 고형 사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 실험이 끝난 후 심장의 혈액을 채혈하고, 등 피부를 적출하였다(Fig 1). 동물군은 아토피를 유도하지 않는 정상군(Normal) 그룹(N=4), 아토피를 유발한 OVA(N=4), 한약 복합 추출물 투여군(CP001 : N=4, CP002 : N=4)으로 나누어 실험하였다.
- 등 피부 조직에서 CD3 항체를 이용하여 총 T 세포의 발현 변화를 면역염색법을 통해 확인하였다. 먼저 피부조직은 동결절편을 만든 후 염색 전 상온에서 30분간 건조시킨 후 4% 파라 포름알데하이드(PFA)에 조직을 고정시킨 후, 5% bovine serum albumin (BSA)로 blocking 한 후 CD3 1차 항체를 반응시킨 후, CD3를 인지하는 2차 항체를 반응한 후 DAB 시약(Vector Lab, USA)을 사용하여 발색시켰다.
- 등 피부 조직에서 CD3 항체를 이용하여 총 T 세포의 발현 변화를 면역염색법을 통해 확인하였다. 먼저 피부조직은 동결절편을 만든 후 염색 전 상온에서 30분간 건조시킨 후 4% 파라 포름알데하이드(PFA)에 조직을 고정시킨 후, 5% bovine serum albumin (BSA)로 blocking 한 후 CD3 1차 항체를 반응시킨 후, CD3를 인지하는 2차 항체를 반응한 후 DAB 시약(Vector Lab, USA)을 사용하여 발색시켰다.
- 본 실험에서는 단일 한약재가 아니라 염증반응 억제 효과를 가지는 약재들의 복합물을 사용하여 동물 등 피부에 도포하였고, 차후 단일 한약재 및 조합에 따른 효과 차이를 알아보기 위하여 각 추출물을 같은 비율로 혼합하였다. CP001에는 화피, CP002에는 당귀가 포함된 것으로 실험결과 화피가 포함된 CP001 도포군에서 효과가 더 좋았으며, 이는 화피의 효과일 것으로 생각되어진다.
- 본 실험에서는 현대 산업사회에서 점점 증가 하는 질병 중 하나인 아토피 피부염 치료에 효과가 있을 것으로 기대되는 복합 한약 추출물을 아토피 피부염이 유도한 동물의 등 피부에 도포하여 피부염 개선 효과를 확인하였다. BALB/c 마우스에 아토피 피부염을 유발하기 위해 오발부민 아토피 피부염 유도 모델을 사용하였으며, 증강된 피부 감작을 유도하기 위해 일반적인 제산제로 알려진 수산화알루미늄 수화물을 오발부민에 함께 혼합하여 복강 주사 후 재차 피부에 도포하였으며, 복합 한약 추출물 또한 피부에 도포하였다.
- 실험 종료 후 자동혈액분석기를 통해 혈액 내의 호산구, 호중구, 림프구, 단핵구, 백혈구의 수치를 분석하였다. 호산구는 염증반응이 일어나면 제일 먼저 뚜렷하게 증가하는 염증세포로, 아토피 피부염 환자의 혈액 내에서 많이 발현된다.
- 실험이 끝난 후 동물 마취제인 럼푼(rompun)과 졸레틸(zoletil)을 과량 투여하여 마취시킨다음 개복한 후 1㎖ 주사기를 이용하여 심장에서 채혈하였다. EDTA가 처리된 튜브(Becton Dickinson Vacutainer system, USA)에 모은 후 자동혈액분석기(HEMAVET 950, Drew Scientific, LTD, UK)를 이용하여 백혈구, 호중구, 호산구, 단핵구 등의 수치 변화를 검사하였다.
- 아토피 피부염 유도 후 CP001 또는 CP002 복합 한약 추출물은 패치 감작시 오발부민과 함께 등 피부에 처리하였으며, 2일에 한번씩 200㎎/㎖의 농도 100㎕로 14일 동안 처리하였다. 실험이 끝난 후 심장의 혈액을 채혈하고, 등 피부를 적출하였다(Fig 1). 동물군은 아토피를 유도하지 않는 정상군(Normal) 그룹(N=4), 아토피를 유발한 OVA(N=4), 한약 복합 추출물 투여군(CP001 : N=4, CP002 : N=4)으로 나누어 실험하였다.
- 오발부민 복강투여 3주 후 100㎍의 오발부민과 20㎎ 수산화알루미늄 수화물 혼합물을 제모한 등 피부에 1×1㎝ 패치에 3주간 감작시켜 동물 등 피부 국소부위에 피부염을 유도하였으며 2일에 한 번씩 반복하였다. 아토피 피부염 유도 후 CP001 또는 CP002 복합 한약 추출물은 패치 감작시 오발부민과 함께 등 피부에 처리하였으며, 2일에 한번씩 200㎎/㎖의 농도 100㎕로 14일 동안 처리하였다. 실험이 끝난 후 심장의 혈액을 채혈하고, 등 피부를 적출하였다(Fig 1).
- 아토피환자에서 증가하는 것으로 보고된 제 2형 T 세포 조절 사이토카인인 IL-13과 IL-17의 변화를 피부조직으로부터 RNA를 분리한 후 real-time PCR을 통해 각 mRNA의 발현 차이를 확인하였다. 그 결과 아토피 유발 시 증가한 사이토카인의 mRNA 수치가 한약 복합 추출물 도포 시 모두 감소하는 결과를 확인하였다(Fig 7).
- 앞서의 혈액 분석결과 등 피부 국소 부위에 아토피를 유발시키더라도 혈액 내의 염증과 관련된 세포들이 증가하는 것을 확인하였는데, 실제 아토피를 유발시킨 피부조직에 피부염의 특징인 염증세포의 침착이 증가하는지, 또한 복합 한약 추출물을 도포한 그룹에서의 침착정도가 감소하는지를 핵과 세포질 염색법을 통하여 확인하였다. 그 결과 정상군에 비해 아토피 피부염 유발군에서 확연히 염증세포의 침윤정도가 증가하는 것을 확인 할 수 있었고 또한 아토피를 유발한 후 한약 복합 추출물 도포 시(CP001, CP002 처리군) 염증세포 침착이 어느 정도 감소한다는 것을 확인할 수 있었다(Fig 4).
- 3mm 여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압하여 여과한 후, 여과된 에탄올 추출물을 감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 농축한 후, 동결건조(Freezedryer, Matsushita, Japan)하였다. 얻은 분말은 CP001(약모밀, 복분자, 생지황, 화피), CP002(약모밀, 복분자, 생지황, 참당귀)로 나누어 각각 1:1:1:1의 비율로 배합하여 3차 증류수에 200mg/ml 농도로 녹인 후 사용하였다.
- 염색한 조직은 광학현미경의 ×400 배율 하에서 염증세포 침윤 및 비만세포의 증감 정도를 관찰하였다.
- 오발부민 복강투여 3주 후 100㎍의 오발부민과 20㎎ 수산화알루미늄 수화물 혼합물을 제모한 등 피부에 1×1㎝ 패치에 3주간 감작시켜 동물 등 피부 국소부위에 피부염을 유도하였으며 2일에 한 번씩 반복하였다.
- 오발부민 유도 후 한약 복합 추출물 투여기간인 2주 동안 몸무게 변화를 관찰하였다. 한약 복합 추출물 투여 첫날인 day 0의 몸무게를 관찰해 보면, 오발부민 유도에 의해 정상군에 비해 아토피 유발군인 OVA, CP001, CP002 투여군들의 몸무게가 전체적으로 약 1g정도 낮은 것을 확인할 수 있다.
- 다음날, 5% FBS로 상온에서 1시간동안 blocking 과정을 거친 후, 플라즈마 샘플을 20배 희석하여 100㎕의 부피로 2시간동안 실온에 반응시켰다. 이렇게 하면 혈액내의 IgE가 capture 항체에 붙을 것이고 그 후 IgE를 인지하는 2차 항체를 넣은 다음 기질인 100㎕의 TMB 용액을 넣고 15분간 반응시킨 후, 50㎕의 stop 용액(1M H3PO4)을 넣어 반응을 종료 시키고 ELISA reader기의 450nm의 filter에서 값을 측정하였다.
- 이에 본 실험에서는 CP001(약모밀, 복분자, 생지황, 화피)과 CP002(약모밀, 복분자, 생지황, 참당귀)의 두 가지 복합 한약 추출물을 BALB/c 마우스에 오발부민으로 아토피 피부염을 유도한 동물모델의 등 피부에 도포하여, 질환과 관련된 지표의 변화를 확인함으로서 아토피 피부염 개선효과를 확인하였다.
- 적출한 피부조직은 식염수로 수세한 후 OCT compound로 동결조직절편을 만들어 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색 및 비만세포를 염색하는 톨루이딘 블루(TB)염색을 하였다.
- 전체 염증세포의 증감 확인 후, 아토피 유발시 또는 아토피 피부염이 유발된 마우스에 한약 복합 추출물 도포 시 비만세포의 증감 유무를 관찰하였다. 비만세포는 천식 및 아토피성 습진 등의 염증관련 질환 시 즉시형 알레르기 반응에 관련된 염증세포로 알레르기 반응의 연쇄반응을 주도하는 핵심 염증세포이며, 비만세포의 점막에는 IgE와 결합할 수 있는 Fc 수용체를 포함하며 히스타민 등을 포함하고 있는 것이 특징이다.
대상 데이터
- Real-time PCR에 사용한 프라이머는 코스모진텍(Korea)에서 제작하였으며, SYBR green 시약은 Roche(Germany)사의 제품을 사용하였고, 혈액내의 IgE를 측정하기 위한 ELISA kit는 Becton & Dickinson(USA)제품을 구입하여 측정하였다.
- 본 실험에서 사용한 7주령의 BALB/c 암컷 마우스는 오리엔트(Korea)에서 공급 받았으며, 1주일간 동물실 적응과정을 거친 후 실험에 사용하였다. 경희대 한의과대학 동물실의 사육환경은 온도 24 ± 2℃, 습도 40∼60%, 주야 12시간 교대로 150∼300Lux의 환경이었으며 마우스용 케이지에 4마리씩 수용하여 사육하면서 멸균 증류수와 고형 사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 본 실험에서 사용한 약재인 약모밀, 복분자, 생지황, 참당귀, 화피는 옴니허브(Korea)에서 구입하여 100g 정량 후 1L의 80% 에탄올에 30분 동안 초음파분해 하였다. 3mm 여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압하여 여과한 후, 여과된 에탄올 추출물을 감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 농축한 후, 동결건조(Freezedryer, Matsushita, Japan)하였다.
- Real-time PCR은 이중DNA에 특이적으로 결합하는 SYBR green(Roche, USA) 형광 염료를 사용하여 Lightcycle-96(Roche, USA)기계를 이용하여 실험을 수행하였다. 실험에 사용한 시료의 조건은 cDNA 2㎕, SYBR green 10㎕, 프라이머 sense 0.5㎕, 프라이머 antisence 0.5㎕, 증류수 7㎕로 모두 20㎕의 부피가 되도록 준비하였다. PCR의 반응은 총 45회 주기를 돌며, 결과는 house keeping gene인 GAPDH로 target gene(IL-13, IL-17)을 보정한 비율을 수치화하였다.
- 아토피를 유발하기 위한 오발부민과 수산화알루미늄 수화물은 sigma 제품을 사용하였으며, 조직염색을 위한 헤마톡실린과 에오신 그리고 톨루이딘 블루 역시 sigma 제품을 사용하였고, 총 T 세포를 염색하기 위한 CD3 항체는 Thermo scientific(U.S.A)사에서 구입하였다. Real-time PCR에 사용한 프라이머는 코스모진텍(Korea)에서 제작하였으며, SYBR green 시약은 Roche(Germany)사의 제품을 사용하였고, 혈액내의 IgE를 측정하기 위한 ELISA kit는 Becton & Dickinson(USA)제품을 구입하여 측정하였다.
데이터처리
- 실험결과의 모든 분석은 각 그룹의 측정값을 Mean(평균) ± S.E(표준오차)로 요약하였으며, student t-test method로 분석하여 p-value가 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다.
성능/효과
- 이는 아토피 피부염 유도 기간 동안의 스트레스 및 아토피 피부염 유발에 의한 체중 감량으로 보인다. 2주간 한약 복합 추출물을 등 피부에 도포한 결과, 체중의 감소는 두 한약 복합 추출물에서 관찰할 수 없었으며, 이것은 피부조직으로 흡수된 한약 복합 추출물에 의한 체중 감소의 부작용이 없음을 알 수 있다(Fig 2)
- 본 실험에서는 단일 한약재가 아니라 염증반응 억제 효과를 가지는 약재들의 복합물을 사용하여 동물 등 피부에 도포하였고, 차후 단일 한약재 및 조합에 따른 효과 차이를 알아보기 위하여 각 추출물을 같은 비율로 혼합하였다. CP001에는 화피, CP002에는 당귀가 포함된 것으로 실험결과 화피가 포함된 CP001 도포군에서 효과가 더 좋았으며, 이는 화피의 효과일 것으로 생각되어진다. 실험에 사용한 오발부민 아토피 피부염 유발 모델은 화학제품을 사용한 아토피 유발 모델보다 상대적으로 유발 기간이 길어, 만성 아토피 피부염 모델로 적합하고, 한편 아토피 피부염 유도 후 눈으로 확인 가능한 특이한 피부병변은 확인할 수 없었으나, 실험 종료 후 혈액 분석 결과 알레르기 반응 마커인호산구가 유효하게 증가하였으며, 그 외의 조직 병리학적 특징의 변화가 관찰되었으므로 눈으로 확인할 수 있는 피부병변 효과가 없다고 하더라도 아토피 실험에 적합한 동물실험 모델이라 할 수 있다.
- 0에서 염색하여 확인해 보았다. TB로 비만세포 염색 시보라색 점으로 염색되어지는데, 그 결과 아토피 유발 시 정상 마우스 군보다 비만세포의 발현이 확연히 증가하였으며, CP001 및 CP002 한약 복합 추출물 도포군에서 비만세포의 발현이 억제되었다(Fig 5). 이로써, 실험에 사용한 두 한약 복합 추출물이 염증에 관련된 세포들을 억제시킬 뿐 아니라 알레르기 반응의 핵심 세포인 비만세포를 줄이는 것으로 확인되었다.
- 각 약재는 약모밀=11%, 복분자=11.6%, 생지황=16.7%, 화피=7.7%, 참당귀=19.1%의 수율을 보였다.
- 결과 5에서는 피부조직에서 전체 T 세포의 단백질 발현 정도를 확인하였는데, 이러한 T 세포의 발현을 조절하는 사이토카인으로는 제1형 T 세포와 관계된 interferon-gamma(IFN-Ɣ)가 있고, 제2형 T세포와 관련된 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13이 있다.19) 또한 본 실험에서 사용한 IL-17의 경우 CD4 Helper T 세포와 관련된 사이토카인으로, CD4는 당단백질로 helper T 세포, 대식세포, 단핵구 및 수지상세포의 표면에 발현하는 단백질이며 역시 염증반응 과정에서 발현이 증가하는 것으로 알려진 사이토카인이다.
- 아토피환자에서 증가하는 것으로 보고된 제 2형 T 세포 조절 사이토카인인 IL-13과 IL-17의 변화를 피부조직으로부터 RNA를 분리한 후 real-time PCR을 통해 각 mRNA의 발현 차이를 확인하였다. 그 결과 아토피 유발 시 증가한 사이토카인의 mRNA 수치가 한약 복합 추출물 도포 시 모두 감소하는 결과를 확인하였다(Fig 7). 이러한 결과는 등 피부조직에서 아토피로 인해 증가한 T 세포 관련 mRNA 수치를 한약 복합 추출물 도포에 의해 감소시킨다는 사실을 알 수 있다.
- 앞서의 혈액 분석결과 등 피부 국소 부위에 아토피를 유발시키더라도 혈액 내의 염증과 관련된 세포들이 증가하는 것을 확인하였는데, 실제 아토피를 유발시킨 피부조직에 피부염의 특징인 염증세포의 침착이 증가하는지, 또한 복합 한약 추출물을 도포한 그룹에서의 침착정도가 감소하는지를 핵과 세포질 염색법을 통하여 확인하였다. 그 결과 정상군에 비해 아토피 피부염 유발군에서 확연히 염증세포의 침윤정도가 증가하는 것을 확인 할 수 있었고 또한 아토피를 유발한 후 한약 복합 추출물 도포 시(CP001, CP002 처리군) 염증세포 침착이 어느 정도 감소한다는 것을 확인할 수 있었다(Fig 4). 이는 한약 복합 추출물의 도포가 피부조직의 염증세포 억제에 효과가 있음을 시사한다.
- CD3 항체는 제1형, 제2형 전체 T 세포를 인지할 수 있는 항체로 한약 복합 추출물 투여에 의한 전체 T 세포의 감소정도를 확인하기 위해 피부조직에서 CD3 면역염색법을 통해 변화를 살펴보았다. 그 결과 표피 부분에서 CD3 발현정도의 변화를 확인할 수 있었는데, OVA군에서 정상군보다 확연히 CD3의 발현이 증가하는 것을 확인 할 수 있으며, 한약 복합 추출물 도포 시 표피 CD3 발현이 감소하였다. 이것은 혈액분석 결과와 일치하였으며 CP001과 CP002의 도포는 모두 T 세포를 감소시키는데 효과적이라는 것을 알 수 있었다(Fig 6).
- 복합 한약 추출물 도포군 혈액 내 전체 백혈구 및 단핵구, 호중구, 림프구가 아토피 피부염 유발군에 비해 감소하였으며, 피부의 조직병리학적 염색법에서도 등 피부의 염증세포 및 비만세포 그리고 전체 T 세포의 발현이 아토피 피부염 유발군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 또한 T 세포의 발현을 조절하는 것으로 알려진 사이토카인 중 제2형 T 세포의 mRNA 수치 역시 한약 복합 추출물에 의해 유효하게 감소하였으며, 혈액 내의 IgE 수치도아토피 피부염 유발군에 비해 감소하였다.
- B, C, D). 또한 전체 백혈구 수치 역시 정상군보다 아토피 유발군에서 증가하며 CP001, CP002 도포군에서 모두 감소하였다(Fig 3E).
- 먼저 혈액분석을 통해 호산구의 수치가 정상 군에 비해 아토피 피부염 유도군에서 급격히 증가하는 것으로 본 실험에서 사용한 피부염 유도 모델에 의해 아토피 피부염이 잘 유도 되어진 것을 확인하였다. 복합 한약 추출물 도포군 혈액 내 전체 백혈구 및 단핵구, 호중구, 림프구가 아토피 피부염 유발군에 비해 감소하였으며, 피부의 조직병리학적 염색법에서도 등 피부의 염증세포 및 비만세포 그리고 전체 T 세포의 발현이 아토피 피부염 유발군에 비해 감소하는 것을 확인하였다.
- 먼저 혈액분석을 통해 호산구의 수치가 정상 군에 비해 아토피 피부염 유도군에서 급격히 증가하는 것으로 본 실험에서 사용한 피부염 유도 모델에 의해 아토피 피부염이 잘 유도 되어진 것을 확인하였다. 복합 한약 추출물 도포군 혈액 내 전체 백혈구 및 단핵구, 호중구, 림프구가 아토피 피부염 유발군에 비해 감소하였으며, 피부의 조직병리학적 염색법에서도 등 피부의 염증세포 및 비만세포 그리고 전체 T 세포의 발현이 아토피 피부염 유발군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 또한 T 세포의 발현을 조절하는 것으로 알려진 사이토카인 중 제2형 T 세포의 mRNA 수치 역시 한약 복합 추출물에 의해 유효하게 감소하였으며, 혈액 내의 IgE 수치도아토피 피부염 유발군에 비해 감소하였다.
- 본 실험에서는 아토피 피부염에 의해 증가하는 염증세포를 중심으로 그 수치의 증감정도를 중요하게 살펴보았는데, 그 결과 한약 복합 추출물에 의해 염증세포 및 관련 사이토카인뿐만 아니라 IgE의 수치도 감소시키는 결과를 확인하였으며, 복합 한약 추출물이 아토피 피부염 완화 및 치료에 효과가 있을 것으로 기대된다. 하지만 본 실험에서 사용한 복합 한약 추출물이 어떠한 메커니즘으로 아토피 치료에 관계하는지는 앞으로 더 연구해야 할 수행과제이다.
- 호산구는 염증반응이 일어나면 제일 먼저 뚜렷하게 증가하는 염증세포로, 아토피 피부염 환자의 혈액 내에서 많이 발현된다. 실험결과 정상군에 비해 오발부민으로 아토피 유발 시 호산구의 수치가 두 배 이상 증가하는 반면, CP001을 도포한 결과 정상군보다도 더 낮은 호산구 수치를 보였다. 하지만 CP002를 도포한 결과 호산구 수치를 감소시키는데는 영향을 미치진 못했다.
- CP001에는 화피, CP002에는 당귀가 포함된 것으로 실험결과 화피가 포함된 CP001 도포군에서 효과가 더 좋았으며, 이는 화피의 효과일 것으로 생각되어진다. 실험에 사용한 오발부민 아토피 피부염 유발 모델은 화학제품을 사용한 아토피 유발 모델보다 상대적으로 유발 기간이 길어, 만성 아토피 피부염 모델로 적합하고, 한편 아토피 피부염 유도 후 눈으로 확인 가능한 특이한 피부병변은 확인할 수 없었으나, 실험 종료 후 혈액 분석 결과 알레르기 반응 마커인호산구가 유효하게 증가하였으며, 그 외의 조직 병리학적 특징의 변화가 관찰되었으므로 눈으로 확인할 수 있는 피부병변 효과가 없다고 하더라도 아토피 실험에 적합한 동물실험 모델이라 할 수 있다.
- 심장에서 채혈한 혈액을 EDTA가 처리된 튜브에 모으고 2,000rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 혈장에서 Enzyme linked immnosorbent assay(ELISA) 방법을 통해 IgE 수치를 측정한결과 OVA군에서 증가한 혈액 내 IgE 수치가 한약 복합 추출물 도포군에서 감소하였으며, CP002 도포보다 CP001 도포가 IgE 억제에 더 좋은 효과를 보였다(Fig 8).
- 이 결과, OVA군에서 전체 T 세포가 증가한 것은 제2형 T 세포가 급격히 증가한 것에 기인한다는 것을 알 수 있으며, 한약 복합 추출물 도포에 의해 그 수치가 정상과 비슷하게 줄어든다는 것을 알 수 있다.
- 그 결과 표피 부분에서 CD3 발현정도의 변화를 확인할 수 있었는데, OVA군에서 정상군보다 확연히 CD3의 발현이 증가하는 것을 확인 할 수 있으며, 한약 복합 추출물 도포 시 표피 CD3 발현이 감소하였다. 이것은 혈액분석 결과와 일치하였으며 CP001과 CP002의 도포는 모두 T 세포를 감소시키는데 효과적이라는 것을 알 수 있었다(Fig 6).
- TB로 비만세포 염색 시보라색 점으로 염색되어지는데, 그 결과 아토피 유발 시 정상 마우스 군보다 비만세포의 발현이 확연히 증가하였으며, CP001 및 CP002 한약 복합 추출물 도포군에서 비만세포의 발현이 억제되었다(Fig 5). 이로써, 실험에 사용한 두 한약 복합 추출물이 염증에 관련된 세포들을 억제시킬 뿐 아니라 알레르기 반응의 핵심 세포인 비만세포를 줄이는 것으로 확인되었다.
- 오발부민 유도 후 한약 복합 추출물 투여기간인 2주 동안 몸무게 변화를 관찰하였다. 한약 복합 추출물 투여 첫날인 day 0의 몸무게를 관찰해 보면, 오발부민 유도에 의해 정상군에 비해 아토피 유발군인 OVA, CP001, CP002 투여군들의 몸무게가 전체적으로 약 1g정도 낮은 것을 확인할 수 있다. 이는 아토피 피부염 유도 기간 동안의 스트레스 및 아토피 피부염 유발에 의한 체중 감량으로 보인다.
후속연구
- 이에 본 실험에서 사용한 두 복합 한약 추출물은 아토피 피부염에 관련된 여러 면역 세포 들의 수치를 감소시키는 효과가 있으므로 실제 아토피 피부염을 개선하는데 효과가 있을 것으로 기대된다.
- 본 실험에서는 아토피 피부염에 의해 증가하는 염증세포를 중심으로 그 수치의 증감정도를 중요하게 살펴보았는데, 그 결과 한약 복합 추출물에 의해 염증세포 및 관련 사이토카인뿐만 아니라 IgE의 수치도 감소시키는 결과를 확인하였으며, 복합 한약 추출물이 아토피 피부염 완화 및 치료에 효과가 있을 것으로 기대된다. 하지만 본 실험에서 사용한 복합 한약 추출물이 어떠한 메커니즘으로 아토피 치료에 관계하는지는 앞으로 더 연구해야 할 수행과제이다.
- mRNA 수치의 경우 제2형 T 세포를 조절하는 IL-13, IL-17의 두 가지 사이토카인이 한약 추출물에 의해 감소되었고, 뿐만 아니라 IgE의 수치도 한약 추출물에 의해 감소한 것으로 봐서, 결국 한약 추출물이 IgE를 조절하는 제2형 사이토카인을 감소시키는 것으로 여겨진다. 혈액 내의 IgE 수치가 아토피 유발시 유효하게 증가하였으나, 한약 추출물에 의해 감소하는 정도가 많이 크지는 않았는데, 이것은 오발부민을 특이적으로 인지하는 IgE항체를 사용하여 실험을 하였을 경우 더 나은 결과를 가져왔을 것으로 기대된다.
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