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문제 정의
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이에 본 연구에서는 국내산 서양종 꿀벌에서 분리, 정제한 봉독이 P. acne로 유도된 염증성 피부질환 동물모델에 다양한 농도로 처리하였을 때 염증성 피부에 미치는 영향
과 염증관련 각종 cytokine의 활성에 미치는 영향에 대하여 알아보고자 한다. - acne의 효소, cytokines 및 보체와 중성구, 손상된 각질형성 세포에서 분비된 cytokines 등이 염증 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다.19) 본 연구에서는 염증성 피부질환 유도 동물모델을 이용하여 여드름성 피부질환에 봉독의 효능을 살펴보고자 하였다. AB1, AB10, AB100군의 양쪽 귀에 P.
- 그러나 대표적인 염증성 피부질환 중 하나인 여드름 발생에 봉독이 미치는 영향에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 여드름 유발균인 P. acnes에 대한 봉독의 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- Streptoavidin peroxidase (DAKO, CA, USA)로 37°C에서 15 분간 반응시키고 DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 발색한 후 hemotoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- IL-1β와 TNF-α에 대한 1차 항체를 4°C에서 16 시간동안 반응시키고, biotinylated anti-goat IgG 또는 anti-mouse IgG (DAKO, CA, USA)로 37°C에서 15분간 반응시켰다.
- 충분한 고정과정을 거친 귀 조직은 일련의 조직처리과정을 거친 후 파라핀 포매기(Leica EG116)에 포매하여 마이크로톰(Leica 820)으로 4 μm 두께의 절편을 제작한 다음 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- AB1, AB10, AB100군은 마우스의 양쪽 귀에 P. acnes (1×107 CFU/20 μl in PBS)를 피내 주사한 후, 오른쪽 귀에 각각 1, 10, 100 μg의 건조봉독을 0.05 g 바셀린에 섞어 귀에 도포 하였다.
- A 군은 마우스의 왼쪽 귀에 P. acnes (1 × 107 CFU/20 μl in PBS)를 피내 주사하였고 오른쪽 귀에 20 μl의 PBS를 피내 주사하였다.
- 실험동물 및 여드름 유발 − 실험동물은 체중 20 g 내외의 생후 7주 수컷 C57BL/6 마우스를 샘타코 BIO KOREA(오산, 경기도, 대한민국)로 부터 제공 받았고 7일간 적응시켰다. 실험용 마우스는 3마리씩 4군 으로 나누어 군 별로 cage에 분리시키고 각각의 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. A 군은 마우스의 왼쪽 귀에 P.
- 05 g 바셀린에 섞어 귀에 도포 하였다. 각 군의 마우스는 실험시작 24시간 후 경추탈골로 희생시킨 후 귀 조직을 적출하였다.
- 18) 본 연구에서는 여드름균으로 유발된 피부질환 동물 모델을 확립하기 위하여 P. acne를 마우스의 왼쪽 귀에 피내 주사하고 대조군으로 오른쪽 귀에 20 μl의 PBS를 피내 주사하였다.
- acne를 마우스의 왼쪽 귀에 피내 주사하고 대조군으로 오른쪽 귀에 20 μl의 PBS를 피내 주사하였다. P. acne 피내주사 24시간 후, 마우스의 왼쪽 귀가 오른쪽 귀보다 붉게 부풀어 있는 것을 육안적으로 관찰하였다 (그림 1A). H&E 염색을 통해 병리학적 검사를 한 결과 왼쪽 귀의 조직에서는 모낭 내 및 모낭주위에 염증세포의 침윤이 관찰되었고 모낭상피의 괴사, 면포, 모낭개구부의 과각화증, 모낭 내 및 모낭주위의 농양형성, 모낭의 파열이 관찰되었다.
- 19) 본 연구에서는 염증성 피부질환 유도 동물모델을 이용하여 여드름성 피부질환에 봉독의 효능을 살펴보고자 하였다. AB1, AB10, AB100군의 양쪽 귀에 P. acne를 이용해서 염증성 피부 질환을 유도하였고, 오른쪽 귀에 1. 10.
- 2. 염증성 피부질환이 유도된 마우스의 귀의 조직에 봉독을 농도별로 (1, 10, 100 ug)로 처리 하여 여드름의 주원인이 P. acne에 대해 강한 항염증 효과가 있는 것을 육안적 평가로 관찰 하였다.
대상 데이터
- 시험 물질 − 본 실험에 사용한 봉독은 농촌진흥청의 국립농업과학원에서 사육 중인 서양종 꿀벌(Apis mellifera)로부터 봉독채집장치 (청진테크, 안산, 대한민국)를 이용하여 봉독을 분리하였고, 불순물을 제거하여 순수 정제 봉독(purified bee venom)을 취하였다.
- 실험동물 및 여드름 유발 − 실험동물은 체중 20 g 내외의 생후 7주 수컷 C57BL/6 마우스를 샘타코 BIO KOREA(오산, 경기도, 대한민국)로 부터 제공 받았고 7일간 적응시켰다.
- 사용 균주 및 배지 조성 − 본 연구에서 사용한 여드름 원인균인 P. acne (ATCC 6919)는 한국미생물균주은행으로부터 분양 받아 사용하였다.
데이터처리
- CA, USA) 와 반응시키고 TBS-T로 15분간 2회 세척 후 membrane을 2차 항체로 2 시간 반응시켰다. 항체들에 대한 발현 분석은 horseradish peroxidase-linked (HRP) 이차항체에 의해 발현되는 enhanced chemiluminescence (ECL) Western Blot Analysis (Amersham, NJ, USA)시스템을 이용하였으며 X-ray 필름에 현상한 후 Science Lab 2005(Fujifilm, Japan)를 이용하여 비교 분석 하였다.
- 통계처리 − 실험의 분석결과는 각각의 군별로 평균과 표준편차(mean ± S.D.)를 사용하여 표기하였으며, 모든 자료는 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 처리하였고, 반복측정에 의한 ANOVA test를 적용하여 유의도 수준 p < 0.05에서 확인하였다.
성능/효과
- 1,2) 특히, 봉독은 순수 천연물질이면서 강력한 항균, 항염증, 항암효과를 포함한 다양한 생리 및 약리작용을 가지고 있어 1990년대 이후부터 활발한 연구가 진행되고 있다.3) 봉독의 주요 성분은 약 40여 가지가 밝혀져 있고, 성분은 크게 peptide components, non peptide components, enzyme 등으로 구성되어 있다.4) 건조봉독의 약 50%를 차지하는 peptide component는 melittin, apamin, MCD peptide 등이며 이들 성분은 일반적으로 진통, 소염, 뇌하수체 호르몬 분비 촉진과 함께 혈액순환 촉진 등의 작용을 하는 것으로 알려져있다.
- 3) 봉독의 주요 성분은 약 40여 가지가 밝혀져 있고, 성분은 크게 peptide components, non peptide components, enzyme 등으로 구성되어 있다.4) 건조봉독의 약 50%를 차지하는 peptide component는 melittin, apamin, MCD peptide 등이며 이들 성분은 일반적으로 진통, 소염, 뇌하수체 호르몬 분비 촉진과 함께 혈액순환 촉진 등의 작용을 하는 것으로 알려져있다.5) 또한 봉독은 암과 에이즈, 면역관련 질환치료제에 이르기까지 다양한 연구가 이루어지고 있다.
- 피부에는 다양한 균이 상주하며 이로 인해 많은 피부질환들이 발생하는데 그 중 가장 대표적인 질환으로 여드름을 꼽을 수 있다.10) 여드름의 발생은 일반적으로 피지생산의 증가, 피부 상재 세균들의 모낭 증식 및 유전적 소질 등의 주요인자가 복합적으로 작용하여 발생한다. 이에 관여하는 대표적인 여드름 균으로는 Propionibacterium acne (P.
- 9) 따라서 본 연구에서의 봉독은 P. acne로 유도된 염증을 완화시키는데 효과가 있는 것으로 사료되고 특히, 1 μg의 봉독이 다른 농도 보다 더 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 특히, 1 μg의 농도의 봉독 처리군이 10 또는 100 μg의 봉독 처리군보다 염증으로 두꺼워진 조직의 두께가 줄었음을 확인할 수 있었고 염증세포의 침윤, 농양형성, 모낭 파열이 완화됨을 관찰할 수 있었다.
- 육안적 관찰을 통해 왼쪽 귀가 붉게 부풀어 있는 모습을 관찰 할 수 있었고 H&E 염색을 통해 확인해 본 결과 염증성 피부질환의 전형적인 형태를 확인할 수 있었다.
- H&E 염색을 통해 병리학적 검사를 한 결과 왼쪽 귀의 조직에서는 모낭 내 및 모낭주위에 염증세포의 침윤이 관찰되었고 모낭상피의 괴사, 면포, 모낭개구부의 과각화증, 모낭 내 및 모낭주위의 농양형성, 모낭의 파열이 관찰되었다.
- 이에 반해, 대조군인 오른쪽 귀에서는 정상적인 조직의 모습을 관찰할 수 있었다 (그림 1C). 이러한 결과를 미루어 볼 때 본 실험에 사용한 P. acne가 염증성 피부질환을 유도하는 것을 확인하였다.
- 염색을 통해 확인해 본 결과 염증성 피부질환의 전형적인 형태를 확인할 수 있었다. 반면, 봉독을 처리한 오른쪽 귀는 왼쪽 귀 보다 염증이 현저히 완화됨을 확인 할 수 있었다. 특히, 1 μg의 농도의 봉독 처리군이 10 또는 100 μg의 봉독 처리군보다 염증으로 두꺼워진 조직의 두께가 줄었음을 확인할 수 있었고 염증세포의 침윤, 농양형성, 모낭 파열이 완화됨을 관찰할 수 있었다.
- 24,25) 본 연구에서는 Western blot을 통해 P. acne로 염증이 유발된 마우스의 귀 조직에서 TNF-α와 IL-1β의 발현양이 정상 마우스 보다 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 봉독을 처리하였을 때 발현양이 감소하였음을 단백질수준에서 관찰할 수 있었다 (그림 3).
- 본 연구 결과를 바탕으로 1 μg 농도의 봉독은 여드름 유발균인 P. acne의 활성과 염증반응을 억제시킴으로써 염증성 여드름 치료에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다.
- 따라서 1 μg의 봉독은 대표적 염증성 cytokines인 TNF-α와 IL-1β의 발현 양을 억제시킴으로써 염증성 피부질환을 완화시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과는 P. acne를 마우스의 귀 조직에 투여하였을 경우 24시간 후 염증성 피부 질환을 유도하는 것을 관찰할 수 있었고, 1 μg 농도의 봉독은 여드름의 주원인이 P.acne에 대해 강한 항균력이 있는 것을 육안적 평가와 병리학적 검사로 관찰할 수 있었다.
- acne에 대해 강한 항균력이 있는 것을 육안적 평가와 병리학적 검사로 관찰할 수 있었다. 또한, 염증성 cytokines의 발현을 억제함으로써 분자적인 측면에서도 봉독의 항염증 효과를 확인 할 수 있었다. 본 연구 결과를 바탕으로 1 μg 농도의 봉독은 여드름 유발균인 P.
- 1. P. acnes를 마우스의 귀 피내에 투여 하여 24시간 동안 관찰한 결과 염증성 피부 질환이 유도되는 것을 확인 하였다.
- 3. P. acne로 염증이 유발된 마우스의 귀 조직에서 염증성 cytokines의 발현이 정상 마우스 보다 현저히 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 봉독을 처리한 군에서의 발현양 감소를 분자생물학적 실험 기법을 통해 확인하였다.
후속연구
- acne의 활성과 염증반응을 억제시킴으로써 염증성 여드름 치료에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다. 이에 따라 본 연구는 천연물인 봉독을 활용하여 약리효과가 뛰어나고 부작용이 적은 여드름 치료제의 개발에 근거자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 봉독은 여드름 유발균인 P. acne의 활성과 염증반응을 억제시킴으로써 염증성 여드름 치료에 효과가 뛰어난 것으로 사료되고 천연물인 봉독을 활용하여 약리효과가 뛰어나며 부작용이 적은 여드름 치료제의 개발에 근거자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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