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문제 정의
- 항산화능과 관련된 연구로서 제2형 당뇨쥐를 대상으로 동결 건조한 마늘과 흑마늘을 섭취시킨 결과 항산화 효소농도가 증가하였고(9), 흰쥐를 대상으로 5주간 마늘분을 섭취시킨 결과 지질과산화가 억제되고 항산화 효소 활성이 증가하였으며(11), 흑마늘 분말 첨가 급여가 고콜레스테롤 흰쥐의 지질대사에 미치는 영향 등에 대한 연구가 보고된 바 있으나 흑마늘의 생리활성 규명 및 관련물질에 대한 연구를 위해 항산화 작용에 대한 다양한 연구가 보다 분명히 규명되어야 할 필요성이 있다. 따라서 본 연구는 생쥐를 이용한 동물 실험을 통하여 PQ에 의한 산화적 스트레스에 대해서, 흑마늘 추출물의 섭취가 항산화 효소계에 어떠한 영향을 미치는지를 관찰하고 흑마늘 추출물의 항산화 능력을 측정함으로써 흑마늘 추출물의 건강기능식품 소재로써의 가능성을 검토하고자 하였다.
- 본 연구에서는 PQ의 독성으로 유발된 산화적 스트레스에 대한 흑마늘 추출물의 항산화 활성 효과를 검정하여 건강기능식품으로써의 흑마늘 추출물 기능성을 알아보기 위해 흑마늘 추출물의 전자공여능을 측정하였으며 마우스를 이용하여 PQ 투여 전 5일, 투여 후 5일간 흑마늘 추출물을 경구투여한 후, PQ 독성에 의한 체중 변화 관찰과 혈중 간 기능 지표인 AST와 ALT값을 측정 하였다. 또한 간 조직에서 SOD, catalase의 활성과 GSH, MDA 함량 등을 측정하여 비교함으로써 흑마늘 추출물의 황산화 활성 성분이 PQ의 독성에 대한 회복 작용 그리고 지질과산화와의 상호 관련성을 검토하였다.
제안 방법
- 실험에 사용된 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 Sigma Aldrich 제품을 사용하였다. DPPH 라디컬 소거능은 Blois(13)의 방법을 응용하여 DPPH 라디컬에 전자를 공여함으로써 라디컬을 소거하는 효과를 517 nm에서 흡광도를 측정하여 계산한 후 나타내었다. 즉 0.
- SOD 활성은 SOD assay kit(Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan)를 이용하고 catalase 활성도는 Catalase assay kit (Abcam, Cambridge, UK)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 각 그룹당 3번 반복하여 측정하였다.
- 글루타치온(glutathione, GSH) 함량은 GOH assay kit(Biovision, San Francisco, CA, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라서 각 그룹당 3번 반복하여 측정하였으며 1 g 간 조직당 µmol의 함량으로 나타내었다.
- 본 연구에서는 PQ의 독성으로 유발된 산화적 스트레스에 대한 흑마늘 추출물의 항산화 활성 효과를 검정하여 건강기능식품으로써의 흑마늘 추출물 기능성을 알아보기 위해 흑마늘 추출물의 전자공여능을 측정하였으며 마우스를 이용하여 PQ 투여 전 5일, 투여 후 5일간 흑마늘 추출물을 경구투여한 후, PQ 독성에 의한 체중 변화 관찰과 혈중 간 기능 지표인 AST와 ALT값을 측정 하였다. 또한 간 조직에서 SOD, catalase의 활성과 GSH, MDA 함량 등을 측정하여 비교함으로써 흑마늘 추출물의 황산화 활성 성분이 PQ의 독성에 대한 회복 작용 그리고 지질과산화와의 상호 관련성을 검토하였다. 흑마늘 추출물의 투여는 간조직에서 항산화 효소인 SOD, catalase 활성을 유의적으로 증가 시켰다.
- 실험동물군은 각 군당 ICR계 생쥐 8마리씩 무작위로 배정하였으며, 무처리 대조군, PQ 투여군, PQ + 흑마늘 저농도(BGL), PQ + 흑마늘 고농도 처리군(BGH), 양성 대조군인 PQ + vitamin C 처리군 등 5군으로 나누어 실험을 수행하였다. 무처리 대조군에는 생리식염수를 경구투여 하였으며 나머지 실험군에는 PQ(25 mg/kg, single dose)를 복강 주사를 통해 투여하였는데, 흑마늘 저농도군에는 90 mL/kg BW의 흑마늘 추출물, 고농도에서는 180 mL/kg BW의 흑마늘 추출물, vitamin C 투여군은 400 mg/kg BW의 비타민 C를 PQ 투여 전 5일, 투여 후 5일 동안 경구투여하여 실험하였다. 흑마늘 투여양은 65 kg 성인에게 흑마늘추출물 각각 90 mL(2포) 및 180 mL(4포)에 해당하는 양이었다.
- 실험동물군은 각 군당 ICR계 생쥐 8마리씩 무작위로 배정하였으며, 무처리 대조군, PQ 투여군, PQ + 흑마늘 저농도(BGL), PQ + 흑마늘 고농도 처리군(BGH), 양성 대조군인 PQ + vitamin C 처리군 등 5군으로 나누어 실험을 수행하였다. 무처리 대조군에는 생리식염수를 경구투여 하였으며 나머지 실험군에는 PQ(25 mg/kg, single dose)를 복강 주사를 통해 투여하였는데, 흑마늘 저농도군에는 90 mL/kg BW의 흑마늘 추출물, 고농도에서는 180 mL/kg BW의 흑마늘 추출물, vitamin C 투여군은 400 mg/kg BW의 비타민 C를 PQ 투여 전 5일, 투여 후 5일 동안 경구투여하여 실험하였다.
- 양성 대조군으로 항산화제인 vitamin C(100 µg/mL)를, 증류수를 대조군으로 사용하여 동일 한 방법으로 측정하였다.
- DPPH 라디컬 소거능은 Blois(13)의 방법을 응용하여 DPPH 라디컬에 전자를 공여함으로써 라디컬을 소거하는 효과를 517 nm에서 흡광도를 측정하여 계산한 후 나타내었다. 즉 0.15 mM DPPH solution(99.8% methanol)을 제조한 후, 흑마늘 추출물을 0.125, 0.25, 0.5, 1%(v/v)의 농도로 증류수에 희석하여 만든 시료 0.1 mL을 DPPH solution 2.9 mL에 가하여 교 반한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 항산화제인 vitamin C(100 µg/mL)를, 증류수를 대조군으로 사용하여 동일 한 방법으로 측정하였다.
- 혈청 alanine aminotransferase(ALT) 및 aspartate aminotransferase(AST) 활성도는 쥐의 혈액을 채취하여 13,000×g에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리한 다음 Cobas C111(Roche, Basel, Switzerland) 를 사용하여 흡광도를 이용하여 측정하는 방법을 통하여 측정하였다.
- 흑마늘 추출물의 섭취가 PQ의 산화적 스트레스에 의해서 유발된 간 손상에 대한 영향을 검토 하고자 PQ 투여 전 5일, 투여 후 5일 동안 흑마늘 추출물을 투여 후, 혈청 AST, ALT의 활성을 측정하였다(Fig. 2B). PQ 투여군은 무처리 대조군에 비해 AST 농도는 약 2배, ALT 농도는 약 1.
대상 데이터
- 실험동물은 샘타코(BioKorea, Osan, Korea) 에서 6주령의 수컷 ICR 생쥐를 실험동물용 사료로 7일간 사육시킨 후, 실온 20-25℃, 습도 50-60%, 12시간 명암주기의 사육 조건에서 사료와 물을 자유급여 하였으며, 체중이 28-35 g인 생쥐를 사용하였다. 동물실험 프로토콜은 고려대학교 실험동물 윤리위원회의 승인을 받은 방법에 따라 수행하였다(동물 실험 프로토콜 번호: KUIACUC20090421-2).
- 실험에 사용된 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 Sigma Aldrich 제품을 사용하였다. DPPH 라디컬 소거능은 Blois(13)의 방법을 응용하여 DPPH 라디컬에 전자를 공여함으로써 라디컬을 소거하는 효과를 517 nm에서 흡광도를 측정하여 계산한 후 나타내었다.
- 동물실험 프로토콜은 고려대학교 실험동물 윤리위원회의 승인을 받은 방법에 따라 수행하였다(동물 실험 프로토콜 번호: KUIACUC20090421-2). 실험에 사용한 vitamin C와 PQ는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입 하였으며 흑마늘 추출물은 의성 흑마늘영농조합에서 제공 받았다
데이터처리
- 모든 실험은 3반복으로 측정하여 측정치를 mean±SEM으로 나타내었고 실험 결과의 통계적 유의성은 Student’s t-test를 이용하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
- 지질과산화 반응은 여러 가지 독성화합물이나 약물에 의한 간 손상 발생의 가장 중요한 기전으로써 인정되어지고 있고(16), 이러한 기전은 세포 내 산화적 스트레스의 증가, 즉 자유라디컬 생성의 증가 및 항산화적 방어력의 감소에 의해 야기 된다고 볼 수 있다(17). 마우스에 PQ를 투여한 후, 흑마늘 추출물을 경구투여하여 산화적 스트레스에 대한 회복효과를 연구하기 위해 마우스의 혈액과 간 조직에서 지질과산화 반응의 부산물인 MDA 함량을 Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 정량법을 이용하여 측정하였다(Fig. 3). 혈액에서 흑마늘 추출물 저농도와 고농도 처리군은 PQ 처리군에 비해 MDA 함량이 유의적으로 낮게나타났으며, 조직에서는 흑마늘 추출물 고농도 처리군에서 PQ처리군에 비해서 MDA 함량이 60% 정도 낮게 나타났다.
- 혈액과 간 조직내의 지질과산화물의 함량은 Ohkawa 등(14)의 방법에 의한 TBA법을 이용하여 sample의 532 nm에서의 흡광도를 이용하여 생성된 malonedialdehyde(MDA) 양을 측정하였다. 혈액과 간 조직 1 g 당 생성된 MDA를 µM 단위로 나타내었다.
- 흑마늘 추출물과 vitamin C를 5일간 경구투여한 후 24시간 절식시킨 실험 동물은 심장에서 혈액을 채취한 후 혈중 간 기능 지표 효소의 활성 측정과 혈액 내 지질과산화 측정을 위해 사용 하였고, 간 조직은 적출 후 간 조직의 일부분을 취하여 세 번 생리적 식염수로 세척하여 혈액을 제거한 다음 −80℃에 보관하여 간 조직 내 지질과산화 측정과 SOD, catalase, 글루타치온 활성도의 측정에 사용 하였으며 조직의 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 사용하여 Bradford(12) 방법에 따라 측정하였다.
성능/효과
- 2B). PQ 투여군은 무처리 대조군에 비해 AST 농도는 약 2배, ALT 농도는 약 1.5배의 유의적인 증가를 보였으며, 흑마늘 저농도와 저농도 처리군은 대조군과 비슷한 수준의 AST와 ALT의 값을 나타내었다. 이 결과는 PQ의 투여는 산화적 스트레스를 증가시켜 간조직 손상을 일으켜 AST와 ALT를 증가시키지만, 흑마늘을 투여하면 PQ에 의한 산화적 스트레스를 감소시켜 간조직 손상을 억제하고 따라서 혈중 간조직 손상지표인 AST와 ALT 농도를 감소시킨다는 것을 의미한다.
- PQ와 흑마늘 추출물의 투여가 마우스의 체중에 미치는 영향을 측정하기 위하여 PQ 투여 5일 전과 투여 후 5일 동안 vitamin C, 흑마늘 저농도와 고농도를 경구투여한 후 마우스 체중의 변화를 측정한 결과, PQ 투여군은 투여 전과 비교하여 평균 체중이 약 10% 정도 감소 하였으나, PQ를 투여하지 않은 대조군은 유의적으로 체중이 증가 하였으며, 흑마늘 투여군은 유의성을 나타내지는 않았지만 평균 체중이 무처리 대조군과 유사하게 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 2A). 이 실험 결과를 통해, PQ에 의한 급격한 산화적 스트레스가 마우스의 체중 감소를 유발 하였으나, 흑마늘 추출물을 투여하면 PQ의 산화적 스트레스를 감소시켜, 보호효과를 지니면서 체중의 감소를 억제한 것으로 보인다
- 글루타치온 함량은 대조군에서 가장 높게 나타났으며, 흑마늘 추출물 투여군이 PQ군 보다 농도 의존적인 경향으로 높은 글루타치온 함량을 나타내었지만 p<0.05 수준에서의 유의성은 나타나지 않았다.
- 대조군과 PQ군 간에는 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 흑마늘 추출물 투여군은 PQ를 단독 투여한 군과 비교하여 저농도와 고농도 투여군 모두 SOD 활성도가 유의적으로 증가 하였다. Catalase의 활성은 단위 g 단백질당 catalase의 활성도(mU)로 나타내었으며 SOD 측정값과 유사한 경향을 나타내었다(Fig.
- 또한 1%의 농도에서는 양성 대조군으로 사용된 vitamin C(100µg/mL) 보다도 약 2배 정도의 더 높은 전자공여효과를 나타내었다.
- 흑마늘 추출물의 투여는 간조직에서 항산화 효소인 SOD, catalase 활성을 유의적으로 증가 시켰다. 또한, 흑마늘 추출물은 자유라디컬에 의해 생성된 지질과산화의 최종 산물인 MDA의 함량을 혈액과 간 조직에서 유의적으로 감소 시키는 효과를 보였으며, 산화적 스트레스에 의한 방어 작용을 하는 GSH 농도를 유의적으로 증가 시켰다. 이와 같이 흑마늘 추출물은 항산화 관련 효소의 활성도를 증가시키고 생체 내에서 내인성 항산화 물질의 합성능력을 강화 시킴으로써 산화적 스트레스로 인한 생체 손상에 대한 회복 작용을 향상 시킨다고 결론 내릴 수 있으며, 항산화 건강기능식품으로써의 기능성이 기대된다.
- 흑마늘 투여군들은 PQ 투여군에 비하여 유의적으로 catalase 활성이 증가하는 경향을 보였으며 흑마늘 고농도 투여군은 대조군과 비교하여 약 20% 정도의 높은 catalase 활성을 보였다. 위의 결과를 통해서, 흑마늘 추출물이 간조직에서 SOD의 활성을 증가시켜 PQ의 투여로 인해서 생성된 superoxide 라디컬을 소거하고, SOD의 활성결과 생성된 과산화 수소를 catalase의 활성 유도를 통해서 제거 함으로써 PQ에 의해 유발된 산화적 스트레스로부터 간을 보호 한 것으로 사료된다.
- 5배의 유의적인 증가를 보였으며, 흑마늘 저농도와 저농도 처리군은 대조군과 비슷한 수준의 AST와 ALT의 값을 나타내었다. 이 결과는 PQ의 투여는 산화적 스트레스를 증가시켜 간조직 손상을 일으켜 AST와 ALT를 증가시키지만, 흑마늘을 투여하면 PQ에 의한 산화적 스트레스를 감소시켜 간조직 손상을 억제하고 따라서 혈중 간조직 손상지표인 AST와 ALT 농도를 감소시킨다는 것을 의미한다. 즉, 흑마늘 투여는 산화적 스트레스에 의한 간조직 손상을 억제할 수 있음을 보여주며, 저농도 투여로 유의적인 효과를 볼 수 있음을 보여준다.
- 지질과산화는 활성산소 매개체가 세포 자체의 국소적인 방어 작용을 초과함으로써 발생되는 세포손상의 주된 형태이다. 이 결과를 통하여 PQ의 투여가 혈액에서의 지질과산화를 유발하며 흑마늘 액기스의 섭취가 이러한 지질과산화의 생성에 의한 세포나 조직의 손상을 억제함으로써 산화적 스트레스에 대한 방어 작용을 일으킨다고 결론 내릴 수 있다.
- 05 수준에서의 유의성은 나타나지 않았다. 이 실험 결과, 흑마늘 추출물의 투여가 PQ의 체내 유입에 따른 해독작용에 사용된 GSH의 원활한 환원을 촉진한 것으로 추측되며 따라서 흑마늘 추출물 GSH의 함량을 증가시켜 산화적 스트레스에 대해서 간을 보호하는 기능을 지닌다고 추측 할 수 있다.
- 2A). 이 실험 결과를 통해, PQ에 의한 급격한 산화적 스트레스가 마우스의 체중 감소를 유발 하였으나, 흑마늘 추출물을 투여하면 PQ의 산화적 스트레스를 감소시켜, 보호효과를 지니면서 체중의 감소를 억제한 것으로 보인다
- 이 결과는 PQ의 투여는 산화적 스트레스를 증가시켜 간조직 손상을 일으켜 AST와 ALT를 증가시키지만, 흑마늘을 투여하면 PQ에 의한 산화적 스트레스를 감소시켜 간조직 손상을 억제하고 따라서 혈중 간조직 손상지표인 AST와 ALT 농도를 감소시킨다는 것을 의미한다. 즉, 흑마늘 투여는 산화적 스트레스에 의한 간조직 손상을 억제할 수 있음을 보여주며, 저농도 투여로 유의적인 효과를 볼 수 있음을 보여준다.
- 3). 혈액에서 흑마늘 추출물 저농도와 고농도 처리군은 PQ 처리군에 비해 MDA 함량이 유의적으로 낮게나타났으며, 조직에서는 흑마늘 추출물 고농도 처리군에서 PQ처리군에 비해서 MDA 함량이 60% 정도 낮게 나타났다. 지질과산화는 활성산소 매개체가 세포 자체의 국소적인 방어 작용을 초과함으로써 발생되는 세포손상의 주된 형태이다.
- 1과 같다. 흑마늘 추출물은 0.125%(v/v)에서 1%(v/v)까지의 농도에서 대조군인 증류수와 비교하여 유의적인 차이를 나타내었으며 0.125%의 농도에서는, 흑마늘 추출물의 전자 공여능은 대조군에 비해 0.125%에서 10%, 1%(v/v)의 농도에서 50% 높게 농도의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 1%의 농도에서는 양성 대조군으로 사용된 vitamin C(100µg/mL) 보다도 약 2배 정도의 더 높은 전자공여효과를 나타내었다.
- 흑마늘 투여군들은 PQ 투여군에 비하여 유의적으로 catalase 활성이 증가하는 경향을 보였으며 흑마늘 고농도 투여군은 대조군과 비교하여 약 20% 정도의 높은 catalase 활성을 보였다. 위의 결과를 통해서, 흑마늘 추출물이 간조직에서 SOD의 활성을 증가시켜 PQ의 투여로 인해서 생성된 superoxide 라디컬을 소거하고, SOD의 활성결과 생성된 과산화 수소를 catalase의 활성 유도를 통해서 제거 함으로써 PQ에 의해 유발된 산화적 스트레스로부터 간을 보호 한 것으로 사료된다.
후속연구
- 또한, 흑마늘 추출물은 자유라디컬에 의해 생성된 지질과산화의 최종 산물인 MDA의 함량을 혈액과 간 조직에서 유의적으로 감소 시키는 효과를 보였으며, 산화적 스트레스에 의한 방어 작용을 하는 GSH 농도를 유의적으로 증가 시켰다. 이와 같이 흑마늘 추출물은 항산화 관련 효소의 활성도를 증가시키고 생체 내에서 내인성 항산화 물질의 합성능력을 강화 시킴으로써 산화적 스트레스로 인한 생체 손상에 대한 회복 작용을 향상 시킨다고 결론 내릴 수 있으며, 항산화 건강기능식품으로써의 기능성이 기대된다.
- 이러한 건강기능성에 대한 기대감으로 인해 흑마늘 환, 흑마늘 액기스, 흑마늘 파우더 등의 여러 가지 가공제품들이 유통되고 있으며 건강기능에 대한 연구도 시작되어 왔다. 항산화능과 관련된 연구로서 제2형 당뇨쥐를 대상으로 동결 건조한 마늘과 흑마늘을 섭취시킨 결과 항산화 효소농도가 증가하였고(9), 흰쥐를 대상으로 5주간 마늘분을 섭취시킨 결과 지질과산화가 억제되고 항산화 효소 활성이 증가하였으며(11), 흑마늘 분말 첨가 급여가 고콜레스테롤 흰쥐의 지질대사에 미치는 영향 등에 대한 연구가 보고된 바 있으나 흑마늘의 생리활성 규명 및 관련물질에 대한 연구를 위해 항산화 작용에 대한 다양한 연구가 보다 분명히 규명되어야 할 필요성이 있다. 따라서 본 연구는 생쥐를 이용한 동물 실험을 통하여 PQ에 의한 산화적 스트레스에 대해서, 흑마늘 추출물의 섭취가 항산화 효소계에 어떠한 영향을 미치는지를 관찰하고 흑마늘 추출물의 항산화 능력을 측정함으로써 흑마늘 추출물의 건강기능식품 소재로써의 가능성을 검토하고자 하였다.
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