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문제 정의
- 국제적으로는 2009년 유럽연합(EU), 미국 및 일본의 합의하에 제정된 기준에 따르면 경구용 식물성 생약(한약재 및 한약 추출물)에 대한 허용기준은 총 호기성 세균은 104 CFU/g이하이며, 총 효모 및 진균류의 허용한계는 102 CFU/g이며, 또한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella) 및 담즙에 내성이 있는 그람 음성세균은 검출이 허용되지 않는다4,5). 본 연구에서는 한약 전탕액을 제조한 후 동결 건조하여 1년 6개월 동안 냉장 보관하고 있는 한약 파우더 29종의 세균 및 진균의 분포상에 대한 모니터링과 동시에 미생물을 동정함으로써 향후 한약 전탕액의 동결건조 시료의 미생물 오염에 대한 기초 자료를 제공하고자 시행하였다.
제안 방법
- 0% agarose gel에서 전기영동한 후 DNA purification kit를 사용하여 정제한 후, 솔젠트사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA의 염기서열을 BLAST(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST)를이용하여 GenBank에 있는 염기서열과 상동성을 비교 분석하였다. 계통수 작성은 Clustal X(version 1.
- 29종 처방의 동결건조 시료를 대상으로 세균 및 진균의 군집수를 조사하였다. 조사 결과, 진균은 검출이 되지 않았으나, 일반세균의 경우 허용기준인 1.
- PCR 산물을 1.0% agarose gel에서 전기영동한 후 DNA purification kit를 사용하여 정제한 후, 솔젠트사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA의 염기서열을 BLAST(http://www.
- 각 세균 균집을 선택하여 희석 평판도말법을 사용하여 순수 분리한 후 그람염색을 행하여 세균의 형태적 특징과 그람반응을 관찰하였다. 동시에 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 최종 동정을 하였다.
- 1년 6개월 동안 냉장 보관된 시료를 취해 미생물의 계수 및 동정 실험에 사용하였다. 동결건조 시료의 제조 및 분석은 무균적으로 시행하였다.
- 각 세균 균집을 선택하여 희석 평판도말법을 사용하여 순수 분리한 후 그람염색을 행하여 세균의 형태적 특징과 그람반응을 관찰하였다. 동시에 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 최종 동정을 하였다.
- 반응조건은 94℃에서 10분간 pre-heating한 후 94℃에서 1분 30초, 45℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 조건으로 30 cycle 증폭한 후 72℃에서 8분간 최종 extension하였다. 반응액을 1.0% agarose gel에서 전기영동하여 1.5 kb의 크기에 해당하는 DNA band 유무를 확인하였다.
- 배지에서 자란 세균 군집을 연속 희석의 방법으로 순수 분리하고 군집의 형태학적 특징을 관찰하였다. OM 11, 12, 17 및 21의 군집은 부정형(irregular)이었으며 주변부는 물결형(undulate) 또는 열편형(lobate)이었다.
- 본 실험에 사용된 처방의 구성은 동의보감6), 의학심오7), 의학입문8) 및 동의수세보원9)을 기준으로 한의학계에서 다빈도로 사용하거나 기본 처방인 29종을 선정하여 Table 1과 같이 한약재를 배합한 후, 시료의 10배에 해당되는 물을 첨가하여 경서약탕기(COMOS 660, Inchon, Korea)로 100℃에서 120 분간 무압 환류추출법으로 추출하였다. 추출액은 체를 사용하여 거른 후 (주)일신랩의 동결건조기(PVTFD 100R, Yangju, Korea)를 사용하여 건조한 후 멸균된 glass bottle에 넣어 밀봉하여 냉장 보관하였다.
- 순수 분리된 균주를 대상으로 하여 PCR기법을 사용하여 16S rDNA를 증폭하였다. 16S rDNA를 정제한 후 염기서열을 분석하고, blast search한 결과 총 7종이 동정되었으며(Table 3), 이중에서 Division Firmicutes에 속하며 내생포자를 형성하는 Bacillus 속이 B.
- 희석 단계마다 최소 3개의 평판을 준비하고 30℃에서 5일간 배양하여 평판당 300개 이하의 세균 집락이 나타나는 평판을 택해 집락을 세어 총 호기성 세균수를 측정하였다. 진균수는 세균수 시험에 따라 실시하되 배지 1 L당 50 mg의 클로람페니콜이 첨가된 사부로 포도당 한천배지(sabouraud dextrose agar)를 사용하여 배양온도 25℃에서 7-10일간 배양한 후 100개 이하의 진균 집락이 나타나는 평판의 집락을 세어 총 진균수를 측정하였다.
- 진정세균 영역(Eubacteria domain)에 속하는 세균 16S rDNA의 공통적인 서열을 인지하는 프라이머인 27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용하여 PCR 방법으로 증폭하였다.
- 또는 같은 크기의 페트리접시내 미리 굳힌 한천배지 표면에 전처리 검액 1 mL씩을 도말 하였다. 희석 단계마다 최소 3개의 평판을 준비하고 30℃에서 5일간 배양하여 평판당 300개 이하의 세균 집락이 나타나는 평판을 택해 집락을 세어 총 호기성 세균수를 측정하였다. 진균수는 세균수 시험에 따라 실시하되 배지 1 L당 50 mg의 클로람페니콜이 첨가된 사부로 포도당 한천배지(sabouraud dextrose agar)를 사용하여 배양온도 25℃에서 7-10일간 배양한 후 100개 이하의 진균 집락이 나타나는 평판의 집락을 세어 총 진균수를 측정하였다.
대상 데이터
- 추출액은 체를 사용하여 거른 후 (주)일신랩의 동결건조기(PVTFD 100R, Yangju, Korea)를 사용하여 건조한 후 멸균된 glass bottle에 넣어 밀봉하여 냉장 보관하였다. 1년 6개월 동안 냉장 보관된 시료를 취해 미생물의 계수 및 동정 실험에 사용하였다. 동결건조 시료의 제조 및 분석은 무균적으로 시행하였다.
데이터처리
- gov/BLAST)를이용하여 GenBank에 있는 염기서열과 상동성을 비교 분석하였다. 계통수 작성은 Clustal X(version 1.81) 프로그램으로 multiple sequence alignment한 후, neighbor-joining method를 이용하여 계통분류학적 유연관계를 추론하였으며, Bootstrap 값은 1,000회로 하였다.
성능/효과
- 1. 29종의 한약 전탕액 동결건조에서 진균은 검출되지 않았으나 1종에서 일반세균이 허용기준 이상이었다.
- 순수 분리된 균주를 대상으로 하여 PCR기법을 사용하여 16S rDNA를 증폭하였다. 16S rDNA를 정제한 후 염기서열을 분석하고, blast search한 결과 총 7종이 동정되었으며(Table 3), 이중에서 Division Firmicutes에 속하며 내생포자를 형성하는 Bacillus 속이 B. cereus, B. subtilis, B. megaterium, B. licheniformis 4종 이었으며, 유사도는 98-99%였다. 프로테오박테리아문의 감마-프로테오박테리아강, 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 Erwinia속이 E.
- 2. 동정된 세균은 Bacillus속의 B. cereus, B. subtilis, B. megaterium, B. licheniformis 4종과 Erwinia 속의 E. tasmaniensis와 E. amylovora 2종 및 Pantoea agglomerans로 총 7종이었다.
- 29종 처방의 추출물에 대한 평균 수율은 22.3%였다(Table 2).
- 3. E. tasmaniensis는 총 20 종류의 탕액에서 발견되어 가장 출현빈도가 높았으며, P. agglomerans와 B. megaterium은 비교적 낮은 빈도로 나타났다.
- 2). 그람염색을 시행한 결과, OM 11, 12, 17, 21은 양성이었고, OM 1, 8과 16은 음성으로 나타났다.
- 동정된 세균을 기초로 하여 각 처방별 출현빈도를 조사한 결과, E. tasmaniensis가 총 20 종류의 처방에서 발견되어 가장 출현빈도가 높았으며, P. agglomerans와 B. megaterium은 비교적 낮은 빈도로 나타났다(Fig. 4). 실험과정을 무균적으로 수행하였으며, 동일한 조건의 8개 시료에서 일반 세균이 전혀 검출되지 않은 점을 고려할 때, 한약재 탕액의 세균이 제조과정에서 오염된 것이 아니라 기존에 보고된10) 바와 같이 주로 원료 한약재에서 유래된 것임을 추정케 한다.
- 조사 결과, 진균은 검출이 되지 않았으나, 일반세균의 경우 허용기준인 1.0 × 105 CFU/g를 상회하는 시료가 1개 발견되었다.
- licheniformis 4종 이었으며, 유사도는 98-99%였다. 프로테오박테리아문의 감마-프로테오박테리아강, 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 Erwinia속이 E. tasmaniensis와 E. amylovora 2종과 Pantoea agglomerans(Enterobater agglomerans)이 유사도 97-99%로 동정되었다. 기존의 연구에서도 내생포자를 형성하는 세균인 Bacillus속이 한약탕액에 우점종으로 존재함이 보고된 바 있으며1), 이는 탕액 제조시 고온처리에 의한 결과로 생각된다.
후속연구
- 따라서 식물성 한약재의 멸균 및 철저한 관리가 탕액의 품질 유지에 중요할 것으로 판단된다. 특히 열에 약한 Erwinia속과 Pantoea속 세균의 철저한 멸균과 식물성 한약재 원재료의 중요 성분이 변하지 않는 멸균법(가스 멸균, 자외선 조사 멸균 등)을 사용하여 멸균함으로써 한약 탕액 제조 이전시기부터 미생물 오염을 최소화 하여야 할 것으로 생각된다.
- 실험과정을 무균적으로 수행하였으며, 동일한 조건의 8개 시료에서 일반 세균이 전혀 검출되지 않은 점을 고려할 때, 한약재 탕액의 세균이 제조과정에서 오염된 것이 아니라 기존에 보고된10) 바와 같이 주로 원료 한약재에서 유래된 것임을 추정케 한다. 특히, 세균군집이 많이 나타난 처방에 공통적인 구성생약인 감초(Glycyrrhizae Radix)가 주된 오염원일 가능성이 높을 것으로 추정되나 이에 대한 정확한 규명을 위해서는 처방의 구성 생약에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다. 따라서 식물성 한약재의 멸균 및 철저한 관리가 탕액의 품질 유지에 중요할 것으로 판단된다.
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