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문제 정의
- 이와 같은 연구결과를 바탕으로 본 연구진은 길경 추출물로부터 조제한 saponin 분획물을 이용하여 인지기능 개선을 목적으로 하는 건강 기능 식품을 개발하고자 시도하였다.
제안 방법
- 그러나 n-butanol 추출법에 따라 길경 MeOH 추출물에 함유된 saponin 성분들을 추출한 결과 platycodin D, polygalacin D, platyconic acid 등의 saponin 성분들은 쉽게 n-butanol 층으로 이행되었지만, platycodin D2, D3 및 platycoside E 등 극성이 큰 saponin 성분들의 경우 n-butanol 층으로의 이행율이 20% 이하17)에 그쳐 산업적으로 활용하기에는 매우 비경제적인 방법이라는 결론을 얻었으며 차선의 방법으로 여과막 투과 기술을 이용하여 사포닌의 함량을 증가시키는 방법을 고안하였다.18) 본 방법에 따라 조제된 사포닌 고함유 분획(saponin rich fraction; SRF)의 인지기능 개선 효능을 검토하였다.
- 시험약제 및 양성대조약제는 각각 주사용 멸균수에 현탁시켜 조제하였으며 1회 투여액량은 모두 10 ml/kg으로 하였다. Scopolamine (1 mg/kg)은 실험개시 4일차에서 7일차까지 4일간 매일 복강 투여하였으며 시험약제 및 양성대조 약제는 4주간 1일 1회씩 경구투여 하였다. 모든 실험과정은 동물실험 윤리 규정에 따라 수행하였다.
- 기억력 테스트 시험 기간 중에는 scopolamine을 1 mg/kg 씩 1일 1회 4일간 실험약제 투여 60분 후에 복강주사하였으며 scopolamine 투여 30분 후부터 기억력 테스트를 실시하였다. 인지기능 개선 효능은 실험동물이 platform을 찾기까지 소요된 평균 이동시간(sec) 및 platform을 찾기까지 소요된 평균이동 거리(cm)를 측정하여 평가지표로 활용하였다.
- 길경 MeOH 추출물로부터 여과막 분리방법을 활용하여 saponin 함량을 증가시킨 사포닌 고함유 분획(saponin rich fraction; SRF)의 조제방법을 고안하였다. 즉 길경의 MeOH 추출물을 한외여과막(ultra-filtration membrane, Pellicon 2 TFF system, Millipore USA, 5 KDa)과 나노여과막 (Molecular Weight Cut Off, MWCO 500 Da)을 순차적으로 통과시킴으로서 조성 화합물들의 평균분자량이 500 Dalton 이상 5,000 Dalton 이하에 해당되는 사포닌 고함유 분획을 조제하였다.
- 즉 길경의 MeOH 추출물을 한외여과막(ultra-filtration membrane, Pellicon 2 TFF system, Millipore USA, 5 KDa)과 나노여과막 (Molecular Weight Cut Off, MWCO 500 Da)을 순차적으로 통과시킴으로서 조성 화합물들의 평균분자량이 500 Dalton 이상 5,000 Dalton 이하에 해당되는 사포닌 고함유 분획을 조제하였다. 또 이 사포닌 고함유 분획을 4주간 경구 투여한 mouse에 scopolamine을 투여하여 인지기능(기억력) 손상을 유발시킨 후 수중미로 시험(Morris water maze test)을 실시하여 인지기능 개선 효능을 검토하였다. 즉 3일간 학습훈련 (learning trial)을 마친 실험동물이 이후 4일에 걸친 실시한 기억력 테스트(memory acquisition test) 시험에서 platform을 찾는데 소요된 평균이동시간(swimming time)과 평균이동거리(swimming distance)가 각각 감소하는 정도를 지표로 하여 인지기능의 개선효과를 평가하였다(Table I, II).
- 인지기능 개선 효능은 실험동물이 platform을 찾기까지 소요된 평균 이동시간(sec) 및 platform을 찾기까지 소요된 평균이동 거리(cm)를 측정하여 평가지표로 활용하였다. 또, 4일째 기억력 테스트시험 종료 후 1시간 후에 수조에서 platform을 제거한 후 실험동물을 수조에 넣고 120초 동안 자유롭게 수영하도록 하는 probe test를 실시하였으며 이 때 기존 platform이 있었던 위치를 지나간 평균횟수 (crossing number)를 측정하여 평가지표로 활용하였다.
- 실험동물이 platform을 찾은 후에는 약 10초 동안 platform 위에서 쉬도록 하였으며, 60초 이내에 platform을 찾지 못할 경우에는 platform 위에서 20초 동안 쉬게 하였다. 모든 실험동물이 한차례씩 학습훈련 (learning trial)을 마친 후 다시 동일한 방법으로 1일 2회씩 학습훈련(learning trial)을 3일간 반복 실시하였다. 단 release point는 중복되지 않게 무작위로 선택하였다.
- 실험동물은 scopolamine (Sigma Aldrich)을 투여하지 않은 공시험군 (blank)과 scopolamine 투여군으로 나누었으며 scopolamine 투여군은 시험약제 대신 동량의 주사용 멸균수를 투여한 대조군(control), 시험약제 20 mg/kg 투여군(G1), 60 mg/kg 투여군(G2), 180 mg/kg 투여군(G3) 및 aricept (donepezil, 대웅제약) 2 mg/kg을 투여한 양성대조군(P: positive control)으로 나누었으며 각 실험군은 각각 10마리씩으로 구성하였다. 시험약제 및 양성대조약제는 각각 주사용 멸균수에 현탁시켜 조제하였으며 1회 투여액량은 모두 10 ml/kg으로 하였다. Scopolamine (1 mg/kg)은 실험개시 4일차에서 7일차까지 4일간 매일 복강 투여하였으며 시험약제 및 양성대조 약제는 4주간 1일 1회씩 경구투여 하였다.
- 실험동물 및 시험약제의 투여 − 본 실험에서는 체중 36-42 g 수컷 ICR mouse 를 코아텍(경기도 평택시)으로부터 제공받아 사용하였으며, 항온 (23 ± 3℃), 항습 (55 ± 15%)과 12 시간 명암주기(오전 8시 점등, 오후 8시 소등)를 유지한 환경에서 7 일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물은 scopolamine (Sigma Aldrich)을 투여하지 않은 공시험군 (blank)과 scopolamine 투여군으로 나누었으며 scopolamine 투여군은 시험약제 대신 동량의 주사용 멸균수를 투여한 대조군(control), 시험약제 20 mg/kg 투여군(G1), 60 mg/kg 투여군(G2), 180 mg/kg 투여군(G3) 및 aricept (donepezil, 대웅제약) 2 mg/kg을 투여한 양성대조군(P: positive control)으로 나누었으며 각 실험군은 각각 10마리씩으로 구성하였다. 시험약제 및 양성대조약제는 각각 주사용 멸균수에 현탁시켜 조제하였으며 1회 투여액량은 모두 10 ml/kg으로 하였다.
- 수중 미로 시험 (Morris water maze test) − 인지기능 개선 효능은 Morris water maze test 방법으로 평가하였다. 실험약제 투여 마지막 주에 3일간의 학습훈련(learning trial)을 거친 후 기억력시험(memory acquisition test)을 4일간 반복 실시하였다. 학습훈련은 수조(water pool : Ø 200 cm)의 지정된 4개 release point 중 한 곳에서 실험동물을 수조 속으로 넣고 60초 동안 자유 수영을 통하여 platform (Ø 20 cm)을 찾도록 하였다.
- 이를 증류수 5 L에 가하고 6 시간씩 2회 환류 추출한 후 추출액을 모아 원심 분리 (10,000 × g, 30 분)하였다.
- 단 release point는 중복되지 않게 무작위로 선택하였다. 이와 같은 방법으로 3일 동안 총 6회 학습훈련(training)을 실시하였으며, 4일째부터는 학습훈련(learning trial) 방법과 동일한 방법으로 기억력 테스트 시험(memory acquisition test)을 4일간 실시하였다.
- 기억력 테스트 시험 기간 중에는 scopolamine을 1 mg/kg 씩 1일 1회 4일간 실험약제 투여 60분 후에 복강주사하였으며 scopolamine 투여 30분 후부터 기억력 테스트를 실시하였다. 인지기능 개선 효능은 실험동물이 platform을 찾기까지 소요된 평균 이동시간(sec) 및 platform을 찾기까지 소요된 평균이동 거리(cm)를 측정하여 평가지표로 활용하였다. 또, 4일째 기억력 테스트시험 종료 후 1시간 후에 수조에서 platform을 제거한 후 실험동물을 수조에 넣고 120초 동안 자유롭게 수영하도록 하는 probe test를 실시하였으며 이 때 기존 platform이 있었던 위치를 지나간 평균횟수 (crossing number)를 측정하여 평가지표로 활용하였다.
- 또 이 사포닌 고함유 분획을 4주간 경구 투여한 mouse에 scopolamine을 투여하여 인지기능(기억력) 손상을 유발시킨 후 수중미로 시험(Morris water maze test)을 실시하여 인지기능 개선 효능을 검토하였다. 즉 3일간 학습훈련 (learning trial)을 마친 실험동물이 이후 4일에 걸친 실시한 기억력 테스트(memory acquisition test) 시험에서 platform을 찾는데 소요된 평균이동시간(swimming time)과 평균이동거리(swimming distance)가 각각 감소하는 정도를 지표로 하여 인지기능의 개선효과를 평가하였다(Table I, II). 시험기간 중 실험동물에서 사포닌 고함유 분획 투여로 인한 사망사례 및 체중변화의 이상사례는 관찰되지 않았다.
- 길경 MeOH 추출물로부터 여과막 분리방법을 활용하여 saponin 함량을 증가시킨 사포닌 고함유 분획(saponin rich fraction; SRF)의 조제방법을 고안하였다. 즉 길경의 MeOH 추출물을 한외여과막(ultra-filtration membrane, Pellicon 2 TFF system, Millipore USA, 5 KDa)과 나노여과막 (Molecular Weight Cut Off, MWCO 500 Da)을 순차적으로 통과시킴으로서 조성 화합물들의 평균분자량이 500 Dalton 이상 5,000 Dalton 이하에 해당되는 사포닌 고함유 분획을 조제하였다. 또 이 사포닌 고함유 분획을 4주간 경구 투여한 mouse에 scopolamine을 투여하여 인지기능(기억력) 손상을 유발시킨 후 수중미로 시험(Morris water maze test)을 실시하여 인지기능 개선 효능을 검토하였다.
- 학습훈련은 수조(water pool : Ø 200 cm)의 지정된 4개 release point 중 한 곳에서 실험동물을 수조 속으로 넣고 60초 동안 자유 수영을 통하여 platform (Ø 20 cm)을 찾도록 하였다.
- 한외여과막을 투과하지 못한 잔류액(residue)의 용량이 100 ml 이하가 되었을 때 잔류액(residue)을 다시 증류수 500 ml로 희석한 후 최종 잔류액(residue)이 100 ml 이하가 될 때까지 계속하여 한외여과막을 통과시겼다. 한외여과막을 통과한 여액(filtrate)을 모아 다시 잔류물 용량이 100 ml 이하가 될 때까지 분획 분자량(Molecular Weight Cut Off, MWCO) 500 Dalton 인 나노여과막(nano Filtration Process Scale, Low)을 통과시켰다. 나노여과막을 통과하지 못한 잔류액(residue)에 증류수 1 L를 추가한 후 최종 잔류액(residue)의 용량이 100 ml 이하가 될 때까지 계속하여 나노여과막을 통과시켰다.
대상 데이터
- P; positive control (aricept 2 mg/kg) was administered instead of SRF for four weeks before scopolamine intoxication. Each experimental group consist in 10 mice. *p < 0.
- 실험동물 및 시험약제의 투여 − 본 실험에서는 체중 36-42 g 수컷 ICR mouse 를 코아텍(경기도 평택시)으로부터 제공받아 사용하였으며, 항온 (23 ± 3℃), 항습 (55 ± 15%)과 12 시간 명암주기(오전 8시 점등, 오후 8시 소등)를 유지한 환경에서 7 일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험재료 및 실험약제의 조제 − 경동시장에서 구입한 국내산 도라지 10 kg을 동결 건조하여 분말상태의 건조 도라지 2 kg을 얻었다.
데이터처리
- 통계 처리 − 실험결과는 평균값 ± 표준오차로 표시하였으며 모든 통계학적인 분석은 Student's t-test를 이용하였다.
이론/모형
- Scopolamine (1 mg/kg)은 실험개시 4일차에서 7일차까지 4일간 매일 복강 투여하였으며 시험약제 및 양성대조 약제는 4주간 1일 1회씩 경구투여 하였다. 모든 실험과정은 동물실험 윤리 규정에 따라 수행하였다.
- 수중 미로 시험 (Morris water maze test) − 인지기능 개선 효능은 Morris water maze test 방법으로 평가하였다.
성능/효과
- 15) 또, 길경의 MeOH 추출물 및 사포닌 분획을 사료에 첨가하여 생쥐에게 4주간 투여한 결과 scopolamine 투여로 유발된 인지기능 손상 역시 효과적으로 개선되는 것을 확인하였다.16)
- 3일간 학습훈련을 받은 후 4일간에 걸쳐 실시한 기억력 테스트 시험 결과, 시험약제 및 scopolamine을 투여하지 않은 공시험(blank)군의 경우 실험동물들이 platform을 찾는데 소요된 평균이동시간(swimming time) 및 평균 이동거리 (swimming distance)가 모두 현저하게 단축된 반면 scoploamine을 투여한 대조군(control)군의 경우 platform을 찾는 데 소요된 시간(swimming time, Table I) 및 거리 (swimming distance, Table II)가 전혀 단축되지 못하고 오히려 기억력 테스트 2일째의 경우에는 각각 크게 증가함을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 결과는 실험동물로 사용한 생쥐들에게 scopolamine의 투여로 인한 인지기능(기억력) 손상이 잘 유도되고 있음을 시사하고 있다.
- 한편, 식물 추출물로부터 사포닌분획을 얻는 방법으로는 n-butanol 추출법이 잘 알려져 있으며 실제로 실험실에서 가장 널리 활용되고 있다. 그러나 n-butanol 추출법에 따라 길경 MeOH 추출물에 함유된 saponin 성분들을 추출한 결과 platycodin D, polygalacin D, platyconic acid 등의 saponin 성분들은 쉽게 n-butanol 층으로 이행되었지만, platycodin D2, D3 및 platycoside E 등 극성이 큰 saponin 성분들의 경우 n-butanol 층으로의 이행율이 20% 이하17)에 그쳐 산업적으로 활용하기에는 매우 비경제적인 방법이라는 결론을 얻었으며 차선의 방법으로 여과막 투과 기술을 이용하여 사포닌의 함량을 증가시키는 방법을 고안하였다.18) 본 방법에 따라 조제된 사포닌 고함유 분획(saponin rich fraction; SRF)의 인지기능 개선 효능을 검토하였다.
- 도라지(P. grandiflorum) 추출물로부터 막 투과 방법을 이용하여 조제한 사포닌 고함유 분획(saponin rich fraction; SRF)을 한 달간 경구 투여한 생쥐의 인지 능력 개선 효능을 Morris water maze 방법에 따라 평가하여 본 결과, 사포닌 고함유 분획 투여군은 대조군에 비하여 platform을 찾는데 소요된 이동 거리 및 이동 시간이 각각 유의성 있게 감소됨을 관찰하였다.
- 또, platform을 찾는데 까지 걸린 평균이동거리(swimming distance) 역시 기억력 테스트 1일째 시험약제 투여군 G2, G3 및 양성대조시험군의 경우 대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었으나(p<0.05), 기억력 테스트 2일째부터는 모든 시험 물질 투여군 및 양성대조군에서 전반적으로 대조군에 비하여 평균이동거리의 단축이 관찰되었다.
- 이와 같은 연구결과를 종합하여 볼 때 실험동물로 사용한 생쥐의 경우 길경의 사포닌 고함유 분획을 28일간 연속 경구 투여한 결과 scopolamine 투여로 유발된 인지기능(기억력) 손상이 효과적으로 개선되고 있음을 시사하고 있다. 또, 본 연구를 통하여 관찰된 사포닌 고함 유분획의 인지기능 개선효능은 전술한 바 있는 본 연구진의 연구 결과와 잘 일치하고 있음을 알 수 있었다.14-16)
- 여액은 버리고 나노여과막을 투과하지 못한 최종 잔류액(residue)을 감압 농축하여 평균분자량 500 Dalton 이상 5,000 Dalton 이하에 해당되는 사포닌 고함유 분획(saponin rich fraction) 23 g을 얻었으며 이를 주사용 멸균수로 현탁시켜 시험약제로 사용하였다. 사포닌 고함유 분획을 HPLC로 분석한 결과 총 saponin 함량은 10% 이상으로 나타났으며(butanol 추출법의 경우 총 saponin 함량은 2 - 3%), 특히 platycoside E의 경우 butanol 추출법에 비하여 20배 이상 함량이 증가하였다.18)
- 이와 같은 연구결과를 종합하여 볼 때 실험동물로 사용한 생쥐의 경우 길경의 사포닌 고함유 분획을 28일간 연속 경구 투여한 결과 scopolamine 투여로 유발된 인지기능(기억력) 손상이 효과적으로 개선되고 있음을 시사하고 있다. 또, 본 연구를 통하여 관찰된 사포닌 고함 유분획의 인지기능 개선효능은 전술한 바 있는 본 연구진의 연구 결과와 잘 일치하고 있음을 알 수 있었다.
- 즉 시험약제 투여군 G1, G2, G3에서는 대조군과 비교하여 기억력 테스트 기간 동안 각각 platform을 찾는데 까지 걸린 평균이동 시간(swimming time)이 짧게 관찰되었으며, 특히 기억력 테스트 3일차 결과에서, 시험물질 20 mg/kg 투여군(G1; 73.56 sec) 및 180 mg/kg 투여군(G3; 71.74 sec)의 경우 대조군 (98.20 sec)과 비교하여 통계학적으로 유의한 평균이동시간 감소(p<0.01)가 관찰되었다(Table I).
- 특히, 2일차 시험약제 60 mg/kg 투여군(G2; 164.77 cm), 3일차 시험약제 60 mg/kg 투여군(G2; 241.53 cm) 및 180 mg/kg 투여군(G3; 197.36 cm)에서는 대조군(day 2; 173.79 cm, day 3; 225.18 cm) 에 비해 통계학적으로 유의한 평균이동거리 단축(p<0.01)이관찰되었다 (Table II).
- 01)이관찰되었다 (Table II). 한편 4일째 기억력 테스트시험 종료후 1시간 후에 수조에서 platform을 제거한 후 실험동물을 수조에 넣고 120초 동안 자유롭게 수영하도록 한 probe test 를 실시하였으며 이때 각 군의 platform crossing number를 측정하여 본 결과, 시험약제 투여군 G1 (1.10회), G2 (2.00회), G3 (1.10회) 및 양성대조시험군(1.50회)의 경우 각각 대조군(0.09회)과 비교하여 cross number가 증가하는 경향을 보여주었으나 통계학적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (Table III).
- 이와 같은 결과는 실험동물로 사용한 생쥐들에게 scopolamine의 투여로 인한 인지기능(기억력) 손상이 잘 유도되고 있음을 시사하고 있다. 한편 scopolamine 투여 이전에 미리 4 주간 사포닌 고함유 분획을 투여한 시험약제 투여군 G1 (20 mg/kg), G2 (60 mg/kg), G3 (180 mg/ kg) 및 대조약제 aricept를 투여한 양성 대조시험군(P; positive control)의 경우는 시험 약제를 투여하지 않은 대조군(control)군에 비하여 platform을 찾는데 소요된 평균이동 시간(swimming time)과 평균이동거리(swimming distance) 가 점차적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 즉 시험약제 투여군 G1, G2, G3에서는 대조군과 비교하여 기억력 테스트 기간 동안 각각 platform을 찾는데 까지 걸린 평균이동 시간(swimming time)이 짧게 관찰되었으며, 특히 기억력 테스트 3일차 결과에서, 시험물질 20 mg/kg 투여군(G1; 73.
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