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문제 정의
- 대한 탐색연구를 수행하여왔다. 그 결과 생약의 추출물들을 대상으로 하여 mAChR-M1에 대한 친화력8)및 AChE에 대한 저해효과9)를 검색하여 보고한 바 있다.
- 한편 본 연구진은 수년 전부터 생약재 등 각종 천연식물자원으로부터 노인성치매로 유발된 각종 인지기능의 손상을 효과적으로 개선할 수 있는 천연의약품을 개발하고자 인지기능 손상과 관련된 mAChR-Mp AChE, BChE(butyryl-cholinesterase) 등 각종 약리학적 작용점을 조절하는 천연물에 대한 탐색연구를 수행하여왔다. 그 결과 생약의 추출물들을 대상으로 하여 mAChR-M1에 대한 친화력8)및 AChE에 대한 저해효과9)를 검색하여 보고한 바 있다.
제안 방법
- 실험동물을 공시험(blank)군, 대조시험 (control)군, 표준약물(standard)군, 길경추출물 투여군(2군), 사포닌분획 투여군(2군), 비사포닌분획 투여군(1군) 등 8군으로 나누었으며 각 군은 10마리씩으로 하였다. 공시험 (blank)군, 대조시험 (control)군은 약물 대신에 증류수를 체중 g당 0.01 ml의 용량으로 투여하였다. 약물 투여군은 길경추출물 투여군의 경우 길경추출물을 매회 20mg/kg, 100mg/kg씩, 사포닌분획 투여군은 길경사포닌분획을 매회 2mg/kg 10mg/kg씩, 비사포닌분획 투여군은길경 비사포닌분획을 매회 500mg/kg씩 투여하였으며 표준약물(standard)군은 tacrine을 매회 10mg/kg씩 투여하였다.
- 구입하였다. 실험동물은 타 동물과 격리하여 수용하였으며 12시간 명암 주기(6:00부터 18:00 사이는 밝게 18:00부터 익일 6:00까지는 어둡게 함)와 항온(24±1℃), 항습(55±5%) 조건 하에서 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 3-4일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물을 공시험(blank)군, 대조시험 (control)군, 표준약물(standard)군, 길경추출물 투여군(2군), 사포닌분획 투여군(2군), 비사포닌분획 투여군(1군) 등 8군으로 나누었으며 각 군은 10마리씩으로 하였다.
- 실험동물은 타 동물과 격리하여 수용하였으며 12시간 명암 주기(6:00부터 18:00 사이는 밝게 18:00부터 익일 6:00까지는 어둡게 함)와 항온(24±1℃), 항습(55±5%) 조건 하에서 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 3-4일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물을 공시험(blank)군, 대조시험 (control)군, 표준약물(standard)군, 길경추출물 투여군(2군), 사포닌분획 투여군(2군), 비사포닌분획 투여군(1군) 등 8군으로 나누었으며 각 군은 10마리씩으로 하였다. 공시험 (blank)군, 대조시험 (control)군은 약물 대신에 증류수를 체중 g당 0.
- 어두운 쪽 방의 바닥에는 전기 쇽크를 줄 수 있는 grid를 설치하였다. 실험은 동일한 방법으로 learning trial(학습훈련)과 memory acquisition test(기억력 시험)를 24시간 간격으로 진행하였으며 이들 실험은 모두 오후 6시 이후 시간대에 수행하였다. 즉 생쥐를 1시간 동안 암실에서 순응시킨 후 실험장치의 밝은 쪽 방에 넣고 30초가 경과한 뒤 guillotine door가 자동으로 열리도록 하였다.
- 01 ml의 용량으로 투여하였다. 약물 투여군은 길경추출물 투여군의 경우 길경추출물을 매회 20mg/kg, 100mg/kg씩, 사포닌분획 투여군은 길경사포닌분획을 매회 2mg/kg 10mg/kg씩, 비사포닌분획 투여군은길경 비사포닌분획을 매회 500mg/kg씩 투여하였으며 표준약물(standard)군은 tacrine을 매회 10mg/kg씩 투여하였다. 투여약제는 모두 증류수에 녹여 체중 g당 0.
- 2 g). 이와 같은 방법으로 조제된 길경추출물, 사포닌 분획 및 비사포닌분획을 각각 증류수에 현탁하여 투여 약제로 사용하였다.15)
- 실험은 동일한 방법으로 learning trial(학습훈련)과 memory acquisition test(기억력 시험)를 24시간 간격으로 진행하였으며 이들 실험은 모두 오후 6시 이후 시간대에 수행하였다. 즉 생쥐를 1시간 동안 암실에서 순응시킨 후 실험장치의 밝은 쪽 방에 넣고 30초가 경과한 뒤 guillotine door가 자동으로 열리도록 하였다. 생쥐가 반대쪽 어두운 방으로 옮겨가면 guillotine door가 자동으로 닫히면서 생쥐는 바닥으로부터 5초간 0.
- 최종약물투여는 학습훈련 1시간 전에 종료하고 공시험(blank)군을 제외한 모든 시험군의 생쥐에게는 학습훈련 30분전에 3.0 g^g 씩의 에탄올을 경구투여하였으며 공시험 (blank)군은 에탄올 대신 동량의 증류수를 경구 투여하였다. 통계처리 - 실험결과는 평균값± 표준오차로 표시하였다.
- 약물 투여군은 길경추출물 투여군의 경우 길경추출물을 매회 20mg/kg, 100mg/kg씩, 사포닌분획 투여군은 길경사포닌분획을 매회 2mg/kg 10mg/kg씩, 비사포닌분획 투여군은길경 비사포닌분획을 매회 500mg/kg씩 투여하였으며 표준약물(standard)군은 tacrine을 매회 10mg/kg씩 투여하였다. 투여약제는 모두 증류수에 녹여 체중 g당 0.01 ml의 용량으로 1일 1회 4일간 경구 투여하였다.
- 6mA의 전기쇼크를 받게 하였다(학습훈련). 학습훈련 24시간 후 생쥐를 동일한 실험 장치의 밝은 쪽 방에 넣고 반대편 방으로 옮겨가는데 걸리는 시간(latency)을 측정하였다(기억력 시험). 이때 5분이 경과한 경우에도 어두운 쪽 방으로 옮겨가지 않는 경우는 latency를 5분으로 하였으며 학습훈련 시 밝은 쪽 방에서 2 분 이내에 반대편 방으로 옮겨가지 않는 생쥐는 실험에서 제외시켰다.
- 학습훈련(learning trial)과 기억력시험(memory acquisition test)을 통하여 생쥐가 밝은 쪽 방에서 어두운 쪽 방으로 옮겨가는데 걸리는 시간(latency)을 각 시험군 별로 측정하였으며 학습 훈련 시에 비하여 기억력시험 시의 latency가 증가하는 정도를 지표로 하여 인지기능의 개선효과를 평가하였다(Fig. 1). 학습훈련 전 에탄올을 투여하지 않은 공시험(blank)군의 경우 실험동물들은 학습 훈련 시에는 모두 1분 이내의 latency* 보여주었으나 24시간이 경과한 후 실시한 기억력시험 시에는 모두 4-5분대의 latency를 기록하고 있어 학습훈련을 통하여 습득한 전기쇼크의 경험을 24시간이경과한 후에도 잘 기억하고 있음을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 실험동물 및 실험약제의 투여 -실험동물은 ICR계의 체중 19±lg인 수컷의 생쥐를 대한바이오링크(충북 음성)로부터 구입하였다. 실험동물은 타 동물과 격리하여 수용하였으며 12시간 명암 주기(6:00부터 18:00 사이는 밝게 18:00부터 익일 6:00까지는 어둡게 함)와 항온(24±1℃), 항습(55±5%) 조건 하에서 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 3-4일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험약제의 조제 - 경동시장에서 구입한 국산 길경 600g을 MeOH에 6일간 냉침시킨 후 감압 농축하여 MeOH extract 150g을 얻었다길경추출물). 이 MeOH extract를 1L의 증류수에 현탁한 후 Diaion HP-20 column (Φ=5.
- 실험장치로 사용한 팩스-30 셔틀박스 시스템 (PACS-30, Columbus Co., OH, USA)은 동일한 크기의 두 개의 방(15×15×22 cm)으로 구성 되 어 있으며, 방과 방 사이는 guillotine door (4x 3.5 cm)가 설치된 칸막이로 차단되어 있다. 두 개의 방 중 한쪽의 방에는 강도 10W의 조명을 비추어 밝게 하였으며 나머지 한쪽 방은 차광하여 어둡게 하였다.
데이터처리
- 통계처리 - 실험결과는 평균값± 표준오차로 표시하였다. Student's t-test를 이용하여 유의성 여부를 검정하였다.
- 0 g^g 씩의 에탄올을 경구투여하였으며 공시험 (blank)군은 에탄올 대신 동량의 증류수를 경구 투여하였다. 통계처리 - 실험결과는 평균값± 표준오차로 표시하였다. Student's t-test를 이용하여 유의성 여부를 검정하였다.
이론/모형
- 수동회피실험(step-through test) - 인지기능 손상에 대한 개선 효능은 팩스-30 셔틀박스 시스템(gCS-30, Columbus Co., OH, USA)을 사용한 수동회피실험을 통하여 평가하였다.10)
성능/효과
- 이와 같이 약리작용점을 대상으로 한 in vitro 실험과 병행하여 최근 본 연구진은 생쥐(mouse)를 실험동물로 사용한 수동회피실험 (passive avoidance performance) 을 통하여 노인성치매로부터 유발되는 기억력 감소, 학습력 저하 등의 인지기능 장애를 개선시키는 약리효능을 평가하는 동물실험 방법을 확립하였으며 이 방법에 준하여 수종 생약 추출물의 효능을 검색하여 본 결과 산조인(酸棗仁, Zizyphi spinosi Semen), 원지(遠志, Polygalae Radix), 길경(桔梗, Platycodi Radix) 등의 생약재들이 우수한 인지기능장애 개선효능를 보여주고 있음을 알 수 있었다.10)
- 사포닌분획 투여군의 경우에는 학습훈련 시에 비하여 기억력시험 시의 latency가 약물투여량(2 mg/kg, 10 mg/kg)에 따라 투여용량 의존적으로 증가하였다. 특히 고용량(10mg/kg)의 사포닌분획을 투여한 군의 경우에는 기억력 시험시 측정한 latency가 에탄올을 투여하지 않은 공시험 군의 경우와 비슷한 수준(74%)으로 증가하였으며 대조 약물로 사용한 tacrine(Cognex)에 버금가는 우수한 인지기능 개선효능을 보여주었다. 반면 고용량의 비사포닌분획(500 mg/kg)을 투여한 시험군의 경우에는 학습 훈련 시에 비하여 기억력시험 시의 latency가 거의 변동이 없어 인지기능 개선효능이 미미한 것으로 사료된다.
- 특히 길경의 MeOH 추출물 및 MeOH 추출물로부터 부분 정제된 사포닌 분획을 생쥐에 경구 투여한 결과 에탄올투여로 유발된 인지기능 손상이 효과적으로 개선되고 있음을 관찰하였다.
- 1). 학습훈련 전 에탄올을 투여하지 않은 공시험(blank)군의 경우 실험동물들은 학습 훈련 시에는 모두 1분 이내의 latency* 보여주었으나 24시간이 경과한 후 실시한 기억력시험 시에는 모두 4-5분대의 latency를 기록하고 있어 학습훈련을 통하여 습득한 전기쇼크의 경험을 24시간이경과한 후에도 잘 기억하고 있음을 알 수 있었다. 반면 학습훈련 전 에탄올을 투여한 대조시험(control)군의 경우에는 학습훈련 시에는 공시험군의 경우와 같이 모두 1분 이내의 latency를 보여 주고 있으나 기억력 시험 시에도 모두 1분 이내의 latency를 보이고 있어 학습훈련을 통한 전기쇼크의 기억을 24시간 이후에서는 모두 잊어버리고 있음을 알 수 있다.
- 한편 길경추출물 투여군의 경우에는 투여량(20mg/kg, 100mg/kg)에 상관없이 학습훈련 시에 비하여 기억력시험시에 밝은쪽 방으로부터 어두운 쪽 방으로 옮겨가는데 걸리는 시간(latency)이 150초 정도로 대조시험 (control)군의경우에 비하여 약 3배 정도 증가하고 있어 에탄올 투여로 야기된 인지기능 손상이 상당부분 회복되고 있음을 알 수 있었다. 사포닌분획 투여군의 경우에는 학습훈련 시에 비하여 기억력시험 시의 latency가 약물투여량(2 mg/kg, 10 mg/kg)에 따라 투여용량 의존적으로 증가하였다.
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