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문제 정의
- , 2007). 본 연구에서는 애엽 에탄올 및 메탄올 추출물과 그 용매별 분획물의 항산화 활성과 함께 MTT assay를 활용한 세포독성을 조사하여 애엽을 이용한 기능성 소재 개발의 기초 자료로서 활용하고자 하였다.
제안 방법
- Methanol에 농도별로 용해시킨 각 시료액 20 ㎕와 200 µM DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 세포를 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕ 씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO 를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율을 산출하였다.
- PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕ 씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO 를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율을 산출하였다.
- Methanol에 농도별로 용해시킨 각 시료액 20 ㎕와 200 µM DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 methanol을 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 소거능을 산출하였으며, 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 추가적으로 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였다.
- 애엽(艾葉, Artemisiae Argi Folium) 시료 300 g을 각각 15배 용량의 94% 에탄올과 99.6% 메탄올을 추출 용매로 하여 끓는점에서 3시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화된 추출물을 얻었으며, 이 중 일부를 증류수 1 ℓ에 분산시킨 후 동량의 hexane, chloroform, ethylacetate, butanol을 사용하여 순차적으로 3회 반복하여 용매분획을 실시하였다.
- 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다 (Blois, 1958). Methanol에 농도별로 용해시킨 각 시료액 20 ㎕와 200 µM DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 6% 메탄올을 추출 용매로 하여 끓는점에서 3시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화된 추출물을 얻었으며, 이 중 일부를 증류수 1 ℓ에 분산시킨 후 동량의 hexane, chloroform, ethylacetate, butanol을 사용하여 순차적으로 3회 반복하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
- Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 Folin-Denis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96-well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 tannic acid를 0~500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하고 페놀성 화합물의 함량을 ㎎/g tannic acid로 나타내었다.
대상 데이터
- 세포독성 실험에 사용된 Raw 264.7 세포주는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (mean ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Folin-Denis법을 이용하여 추출물 및 분획물의 페놀성 화합물 함량을 측정하였다. Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 Folin-Denis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96-well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출물 및 분획물의 세포독성은 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)를 이용한 방법에 의해 측정하였다 (Shin et al., 2003). 배양된 Raw 264.
성능/효과
- 을 산출하여 Table 3에 나타내었다. Ethanol추출물과 methanol 추출물의 용매별 분획 중 ethyl acetate 분획의 SC50이 각각 32.6 ㎍/㎖와 27.7 ㎍/㎖로 나타나 positive control로 사용된 ascorbic acid의 11.7 ㎍/㎖와 유사한 수준임이 확인되었다. 추출물들의 활성에서는 통계적으로 동일한 수준이기는 하였으나 methanol 추출물이 ethanol 추출물보다 상대적으로 높은 소거능을 가지는 것으로 나타났으며, 모든 용매별 분획에서 methanol 추출물의 분획이 ethanol 추출물의 동일한 용매 분획보다 높은 DPPH radical 소거능을 가지는 것으로 확인되었다.
- , 2010). Table 2에 나타낸 polyphenol 함량 측정 결과, ethanol 추출물보다 methanol 추출물의 polyphenol 함량이 높았으며, 용매별 분획에서는 두 추출물 모두 ethyl acetate 분획에서 각각 430.27 ㎎/g과 427.84 ㎎/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 또한 ethyl acetate 분획의 함량을 제외한 나머지 분획에서 methanol 추출물의 분획이 ethanol 추출물의 동일한 용매 분획보다 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 가지는 것으로 확인되었다.
- 1과 2에 나타내었다. 두 추출물 모두에서 용매별 분획 중 chloroform 분획의 세포생존율이 실험이 실시된 가장 낮은 농도인 63 ㎍/㎖에서 4.01~4.24% 수준으로 나타남으로써 높은 세포독성이 확인되었으며, 추출물과 hexane 분획이 125 ㎍/㎖ 농도에서 3.19~7.08%의 세포생존율을 나타냄으로써 chloroform 분획 다음으로 높은 세포독성을 가지는 것으로 나타났다. 또한 DPPH radical 소거능에서 가장 높은 활성을 보여준 ethyl acetate 분획의 세포생존율도 chloroform과 hexane 분획보다는 높았지만 125 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 상당한 수준의 세포독성이 있는 것으로 확인되었으며, ethanol 추출물보다는 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 상대적으로 높은 세포독성이 나타났다.
- 08%의 세포생존율을 나타냄으로써 chloroform 분획 다음으로 높은 세포독성을 가지는 것으로 나타났다. 또한 DPPH radical 소거능에서 가장 높은 활성을 보여준 ethyl acetate 분획의 세포생존율도 chloroform과 hexane 분획보다는 높았지만 125 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 상당한 수준의 세포독성이 있는 것으로 확인되었으며, ethanol 추출물보다는 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 상대적으로 높은 세포독성이 나타났다. 반면, aqueous 분획은 모든 농도에서 100% 전후의 세포생존율을 나타냄으로써 세포독성이 없는 것으로 확인되었고 butanol 분획 역시 실험이 실된 가장 높은 농도에서 53.
- 84 ㎎/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 또한 ethyl acetate 분획의 함량을 제외한 나머지 분획에서 methanol 추출물의 분획이 ethanol 추출물의 동일한 용매 분획보다 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 가지는 것으로 확인되었다. 이와 같은 애엽 추출물이나 ethyl acetate 분획의 polyphenol 함량은 약용 식물 중 높은 polyphenol 함량을 가진 것으로 알려진 벚나무 수피인 화피나 천궁 등의 함량과 유사하거나 더 높은 수준임을 알 수 있었다 (Im and Lee, 2011; Lee et al.
- , 2010; Im and Lee, 2011). 또한 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50을 100.00%로 하여 환산한 relative activity에서 methanol 추출물과 ethanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 각각 42.13%와 35.75%에 해당하는 항산화 활성을 보이는 것으로 평가할 수 있었다. 그러나 hexane이나 chloroform, aqueous 분획들의 활성은 0.
- 69%로 나타났다. 또한 두 추출물 모두에서 ethyl acetate 분획이 각각 15.38%와 11.95%로 가장 낮은 수율을 나타내었다. 전반적으로 용매별 분획 수율의 순위는 두 추출물 모두 동일하게 나타났으나 일반적으로 활성이 높은 것으로 알려진 ethyl acetate와 butanol 분획의 수율에서 ethanol 추출물이 methanol 추출물보다 높은 수율을 가지는 것으로 나타났다.
- 또한 DPPH radical 소거능에서 가장 높은 활성을 보여준 ethyl acetate 분획의 세포생존율도 chloroform과 hexane 분획보다는 높았지만 125 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 상당한 수준의 세포독성이 있는 것으로 확인되었으며, ethanol 추출물보다는 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 상대적으로 높은 세포독성이 나타났다. 반면, aqueous 분획은 모든 농도에서 100% 전후의 세포생존율을 나타냄으로써 세포독성이 없는 것으로 확인되었고 butanol 분획 역시 실험이 실된 가장 높은 농도에서 53.22~60.45%의 세포생존율을 보임으로써 우려할만한 수준의 세포독성은 가지지 않은 것으로 판단되었다. 이와 같은 세포독성의 결과는 애엽 중에 존재하는 독성 성분들이 hexane이나 chloroform, ethyl acetate 등 상대적으로 극성이 낮은 용매에 용해되기 쉬운 성질을 가졌다고 볼 수 있는데, 이는 인진쑥이나 사철쑥을 대상으로 실시된 세포독성의 연구보고 결과와 유사한 결과이다 (Kim et al.
- 63%로 큰 차이를 나타내지 않았다. 용매별 분획의 수율에서 ethanol과 methanol 추출물의 aquoeus 분획이 각각 32.38%와 38.20%로 가장 높게 나타났고 다음으로 hexane 분획이 각각 17.64%와 18.69%로 나타났다. 또한 두 추출물 모두에서 ethyl acetate 분획이 각각 15.
- 이상의 결과, 애엽의 methanol 추출물과 용매별 분획이 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 바탕으로 ethanol 추출물과 분획보다 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 한편, 세포독성을 확인하기 위해 실시한 MTT assay 결과에서 chloroform과 hexane 분획, 그리고 각 추출물의 세포독성이 높은 수준으로 나타났고 polyphenol 함량과 DPPH radical 소거능에서 활성이 높게 나타난 각 추출물의 ethyl acetate 분획의 세포독성이 125 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 나타나기 시작하는 것을 확인하였다.
- 95%로 가장 낮은 수율을 나타내었다. 전반적으로 용매별 분획 수율의 순위는 두 추출물 모두 동일하게 나타났으나 일반적으로 활성이 높은 것으로 알려진 ethyl acetate와 butanol 분획의 수율에서 ethanol 추출물이 methanol 추출물보다 높은 수율을 가지는 것으로 나타났다.
- 7 ㎍/㎖와 유사한 수준임이 확인되었다. 추출물들의 활성에서는 통계적으로 동일한 수준이기는 하였으나 methanol 추출물이 ethanol 추출물보다 상대적으로 높은 소거능을 가지는 것으로 나타났으며, 모든 용매별 분획에서 methanol 추출물의 분획이 ethanol 추출물의 동일한 용매 분획보다 높은 DPPH radical 소거능을 가지는 것으로 확인되었다. 이러한 DPPH radical 소거능은 일반적으로 polyphenol 함량과 밀접한 관련이 있다는 기존의 연구들에서 제시한 결과와 동일하게 Table 2의 polyphenol 함량과 높은 연관성을 갖는 것으로 나타났다 (Eom et al.
- 이상의 결과, 애엽의 methanol 추출물과 용매별 분획이 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 바탕으로 ethanol 추출물과 분획보다 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 한편, 세포독성을 확인하기 위해 실시한 MTT assay 결과에서 chloroform과 hexane 분획, 그리고 각 추출물의 세포독성이 높은 수준으로 나타났고 polyphenol 함량과 DPPH radical 소거능에서 활성이 높게 나타난 각 추출물의 ethyl acetate 분획의 세포독성이 125 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 나타나기 시작하는 것을 확인하였다. 이와 같은 세포독성을 감안하여 ethyl acetate 분획의 경우 관련 분야에 적용 시 적절한 농도의 설정이 요구 되며, ethyl acetate 분획에 비해 상대적으로 활성은 낮을 수 있지만 추출물보다도 세포독성이 낮은 butanol 분획에 대해 추가적인 활성 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
후속연구
- 한편, 세포독성을 확인하기 위해 실시한 MTT assay 결과에서 chloroform과 hexane 분획, 그리고 각 추출물의 세포독성이 높은 수준으로 나타났고 polyphenol 함량과 DPPH radical 소거능에서 활성이 높게 나타난 각 추출물의 ethyl acetate 분획의 세포독성이 125 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 나타나기 시작하는 것을 확인하였다. 이와 같은 세포독성을 감안하여 ethyl acetate 분획의 경우 관련 분야에 적용 시 적절한 농도의 설정이 요구 되며, ethyl acetate 분획에 비해 상대적으로 활성은 낮을 수 있지만 추출물보다도 세포독성이 낮은 butanol 분획에 대해 추가적인 활성 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
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