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문제 정의
- , 2009; Eo and Kwon, 2009). 본 연구에서는 지금까지 연구되지 않았던 철쭉 가지의 생리활성을 탐색하고자 50% ethanol 추출물과 극성별 용매 분획물을 대상으로 항산화활성과 tyrosinase 저해능을 조사하여 기능성 약용작물 소재 개발의 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- 실험에 사용된 철쭉 (Rhododendron schlippenbachii)가지는 2012년 5월에 전라남도 나주에서 채취한 것으로 잎을 제거하고 40℃에서 건조한 후 실험에 사용하였다. 본 추출에 앞서 에탄올과 메탄올, 증류수 등으로 추출을 실시하여 비교한 결과 수율 및 활성에서 가장 우수한 것으로 확인된 50% 에탄올을 추출 용매로 결정하였다. 건조된 철쭉 가지 시료 1 ㎏을 blender를 사용하여 분쇄한 후 50% ethanol 10 ℓ를 추출용매로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시한 후 여과, 감압농축 및 동결건조 과정을 거쳐 56.
- 본 추출에 앞서 에탄올과 메탄올, 증류수 등으로 추출을 실시하여 비교한 결과 수율 및 활성에서 가장 우수한 것으로 확인된 50% 에탄올을 추출 용매로 결정하였다. 건조된 철쭉 가지 시료 1 ㎏을 blender를 사용하여 분쇄한 후 50% ethanol 10 ℓ를 추출용매로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시한 후 여과, 감압농축 및 동결건조 과정을 거쳐 56.0 g의 추출물을 최종적으로 확보하였다. 이 중 50 g을 증류수에 분산시켜 chloroform, ethyl acetate, butanol 순으로 분획을 실시하여 각각 8.
- 0 g의 추출물을 최종적으로 확보하였다. 이 중 50 g을 증류수에 분산시켜 chloroform, ethyl acetate, butanol 순으로 분획을 실시하여 각각 8.2%, 14.8% 35.2%, 41.8%의 수율로 분획물을 얻었으며, 추출물과 함께 4℃ 이하로 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 페놀성 화합물 중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 1 ㎎/㎖농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 페놀성 화합물 중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 1 ㎎/㎖농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0 ~ 500 ㎍/㎖의 농도로 제조 하여 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- 1 ㎎/㎖농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0 ~ 500 ㎍/㎖의 농도로 제조 하여 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- 추출물 및 분획물 시료의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다 (Blois, 1958). 각 시료를 methanol에 0.
- 0㎎/㎖ 의 다양한 농도로 용해시킨 시료액 20 ㎕와 200 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응 시킨 후 microplate reader (BIO-TEK, USA)를 사용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도 (concentration of sample for scavenging 50% of radical, SC50)를 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid를 사용하였다.
- Nitric oxide (NO) 소거능은 Marcocci 등 (1994)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 10 mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate 50㎕와 증류수에 일정농도로 용해시킨 시료액 30 ㎕를 혼합한 후 25℃에서 150분 동안 반응시켰다.
- 10 mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate 50㎕와 증류수에 일정농도로 용해시킨 시료액 30 ㎕를 혼합한 후 25℃에서 150분 동안 반응시켰다. 1% sulfanilamide (in 30% acetic acid) 60 ㎕를 혼합하고 5분후다시 0.1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in 60% acetic acid) 60 ㎕를 혼합하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- 1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in 60% acetic acid) 60 ㎕를 혼합하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- 7 세포를 96well plate에 1 × 104 cells/well 의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화 시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 철쭉 (Rhododendron schlippenbachii)가지는 2012년 5월에 전라남도 나주에서 채취한 것으로 잎을 제거하고 40℃에서 건조한 후 실험에 사용하였다. 본 추출에 앞서 에탄올과 메탄올, 증류수 등으로 추출을 실시하여 비교한 결과 수율 및 활성에서 가장 우수한 것으로 확인된 50% 에탄올을 추출 용매로 결정하였다.
- 세포독성 시험에 사용된 동물세포주인 Raw 264.7은 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받은 것을 사용하였으며, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, WelGENE, Korea)배지에 10% FBS 와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 배지를 사용하였다.
데이터처리
- Different superscript letters in the same column show significant differences at p < 0.05 by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test.
- **Different superscript letters in the same column show significant differences at p < 0.05 by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test.
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 사후분석으로 Duncan’s multiple range test를 실시하여 p < 0.05 수준에서 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (mean ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Folin-Denis법을 이용하여 추출물 및 분획물 시료의 polyphenol 함량을 측정하였다 (Otto and Denis, 1912). Methanol에 1 ㎎/㎖농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 FolinDenis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법으로 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다 (Jung et al., 1995). 0.
- 추출물 및 분획물 시료의 세포독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다 (Shin et al., 2003). 세포독성 시험에 사용된 동물세포주인 Raw 264.
성능/효과
- 철쭉 가지 추출물 및 분획물의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table 1에 제시하였다. 추출물에서 256.73 ㎎/g으로 존재하였던 polyphenol 함량은 분획과정을 거친 후 ethyl acetate 분획에서 470.62 ㎎/g으로 가장 높은 함량을 보여주었으며, butanol 분획에서도 428.49 ㎎/g의 높은 함량을 나타냈다. 반면 chloroform 분획과 aqueous 분획은 각각 60.
- 70 ㎎/g으로 현저히 낮은 함량을 가지는 것으로 나타났다. Flavonoid 함량의 경우도 ethyl acetate 분획에서 117.85 ㎎/g으로 가장 높게 나타났으며, polyphenol 함량에서 ethyl acetate 분획과 유사한 수준으로 높은 함량을 보였던 butanol 분획은 flavonoid 함량에서는 현저히 낮은 함량을 보임으로써 두 분획간의 성분 조성에 큰 차이가 있음을 알 수 있었다. 식물 중에 존재하는 polyphenol 화합물은 hydroxyl기를 가지는 방향족 화합물로서 항산화 활성이나 항암 활성 등 다양한 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있으며 (Liu, 2004; Manach et al.
- , 2005), flavonoid 역시 대표적인 페놀성 화합물 중 하나로서 superoxide, hydroxy radical과 같은 세포손상을 초래하는 free radical을 없애주는 항산화 활성을 비롯하여 항암, 항균 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다 (Dewick, 2002). 따라서 철쭉 가지 추출물의 ethyl acetate 분획이나 butanol 분획이 높은 polyphenol과 flavonoid 함량을 가지니는 것으로 보아 이와 관련된 생리활성을 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.
- 을 산출하여 Table 2에 나타내었다. Butanol과 ethyl acetate 분획이 각각 0.19 ㎍/㎖와 0.21 ㎍/㎖로 나타나 다른 분획과 추출물에 비해 높은 항산화 활성을 가지고 있음이 확인되었다. 이와 같은 결과는 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50 인 0.
- 21 ㎍/㎖로 나타나 다른 분획과 추출물에 비해 높은 항산화 활성을 가지고 있음이 확인되었다. 이와 같은 결과는 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50 인 0.11 ㎍/㎖를 기준으로 비교한 relative activity에 나타난 바와 같이 butanol과 ethyl acetate 분획이 각각 59.98%와 55.17%로 ascorbic acid의 소거능보다는 낮지만 상당한 수준의 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이와 같은 항산화 활성은 Table 1의 polyphenol 함량과 관련하여 기존의 연구들에서 제시한 것과 마찬가지로 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성이 polyphenol 화합물의 함량과 밀접한 관련이 있음을 나타내는 결과이다 (Oh et al.
- 철쭉 가지 추출물 및 분획물의 NO 소거능을 측정한 결과에서 50%의 NO를 소거하는데 필요한 시료의 농도를 산출한 SC50 값을 Table 3에 제시하였다. Ethyl acetate 분획의 SC50값이 0.56 ㎍/㎖로 가장 높은 소거능을 보였으며, 다음으로 butanol 분획이 0.60 ㎍/㎖ 의 SC50을 나타냈다. Positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50과 비교한 relative activity에서 ethyl acetate와 butanol의 소거능이 각각 141.
- 60 ㎍/㎖ 의 SC50을 나타냈다. Positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50과 비교한 relative activity에서 ethyl acetate와 butanol의 소거능이 각각 141.80%와 131.55%로 ascorbic acid보다도 높은 소거능이 확인하였다. 이와 같은 결과는 철쭉 가지가 항산화 활성이나 항염증 활성 등 관련된 분야에서 활용이 가능한 소재임을 나타낸 것이라고 할 수 있다.
- 철쭉 가지 추출물 및 분획물의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과를 Table 4에 나타내었다. 측정 농도 구간에서 저해 활성을 확인할 수 없었던 chloroform과 aqueous 분획 제외한 ethyl acetate butanol 분획 그리고 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 positive control로 사용된 arbutin보다 높은 것으로 나타났다. 50%의 tyrosinase를 저해할 때 필요한 농도인 IC50에서 ethyl acetate 와 butanol 분획 그리고 추출물이 각각 0.
- 측정 농도 구간에서 저해 활성을 확인할 수 없었던 chloroform과 aqueous 분획 제외한 ethyl acetate butanol 분획 그리고 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 positive control로 사용된 arbutin보다 높은 것으로 나타났다. 50%의 tyrosinase를 저해할 때 필요한 농도인 IC50에서 ethyl acetate 와 butanol 분획 그리고 추출물이 각각 0.76 ㎍/㎖, 0.82 ㎍/㎖, 1.53 ㎍/㎖을 나타냄으로써 positive control로 사용된 arbutin 의 1.87 ㎍/㎖보다도 높은 저해활성을 보였다. 특히 추출물 수준에서도 arbutin 보다 높은 tyrosinase 저해활성을 보임으로써 미백 기능성을 확인하기 위해 활성물질 분리와 작용기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- 1에 나타내었다. 200 ㎍/㎖으로 chloroform 분획을 처리한 경우를 제외한 모든 시료의 세포생존율이 농도별로 89.09 ~ 151.27%의 세포생존율을 나타냄으로써 독성을 나타낼 가능성은 낮은 것으로 확인되었다. 그러나 철쭉의 독성에 대한 연구 보고와 관련하여 독성 물질의 제거나 저감 방안에 대해서도 추가적인 연구가 다양한 방법으로 실시되어야 할 것으로 판단된다 (Jeong et al.
- 이상의 결과에서 철쭉 가지 50% ethanol 추출물과 ethyl acetate 및 butanol 분획물에서 상당한 수준의 항산화 활성이 확인되었으며, arbutin보다도 높은 수준의 tyrosinase 저해 활성을 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 피부미백이나 항산화 활성이 요구되는 분야의 소재로서 철쭉 가지가 활용될 수 있음을 보여주는 것이라 판단된다.
후속연구
- 87 ㎍/㎖보다도 높은 저해활성을 보였다. 특히 추출물 수준에서도 arbutin 보다 높은 tyrosinase 저해활성을 보임으로써 미백 기능성을 확인하기 위해 활성물질 분리와 작용기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- 27%의 세포생존율을 나타냄으로써 독성을 나타낼 가능성은 낮은 것으로 확인되었다. 그러나 철쭉의 독성에 대한 연구 보고와 관련하여 독성 물질의 제거나 저감 방안에 대해서도 추가적인 연구가 다양한 방법으로 실시되어야 할 것으로 판단된다 (Jeong et al., 2009; Eo and Kwon, 2009).
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