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문제 정의
- 그 중 락토바실러스속 균주는 정상적으로 사람을 포함한 동물의 장관에 일정한 균총을 생성하고 유해독소 중화 및 합성차단, 영양분의 소화흡수의 증대 등 여러 유익한 생리활성을 나타내고 안전성도 우수하여 여러 연구 및 발효산업에 사용되고 있으며 동물은 물론 사람에게도 많이 투여되고 있다11-13. 본 연구에서는 한방제제의 효능을 강화시키기 위하여 Lactobacillus fermentum을 이용하여 보중익기탕을 발효하였다. 본 실험에 사용된 보중익기탕 및 발효보중익기탕은 선행연구에서liquiritigenin, isoliquiritigenin 두 성분이 발효 전에 비하여 20배가량 증가하였음을 보고하였다14.
- 하지만 보중익기탕 발효물은 이전에 사용례가 없는 물질로, 효능평가 이전에 안전성에 대한 검증이 반드시 필요하다. 이에 본 연구에서는 보중익기탕 발효전후 물질의 안전성을 규명하기 위하여 단회투여 독성시험을 실시하였다. 단회투여 독성시험은 암·수 ICR 마우스를 대상으로 하였으며, 식품의약품안전청 고시 제 2009-116호 의약품 등의 독성시험방법15에 따라 실시하였다.
- 5로 각각 5000, 2500, 1250 ㎎/㎏, 암·수 각 3개의 용량군을 설정하였다. 본 연구에서는 대조군과 비교하여 시험물질 투여로 인한 급성독성 여부를 관찰하였고, 보중익기탕과 발효보중익기탕을 투여한 시험물질 투여군 간의 체중 및 임상증상 등을 비교함으로써, 발효로 인한 독성물질 생성 여부를 관찰하였다. 투여 경로는 한방 임상에서 주로 적용되고 있는 경구투여법을 이용하였으며, 경구투여용 일회용 존데와 주사관을 이용하여 배부 피부 고정법으로 몸체를 고정한 후 위내에 경구 투여하였다.
- 임상에서 주로 氣血陰陽俱虛를 치료하는 목적으로 사용되나, 최근 면역증강, 항알레르기, 항암, 항당뇨 등에 대한 효과가 실험적 연구를 통하여 보고되었다. 본 연구에서는 유산균을 이용한 발효를 통하여 배당체 성분을 비배당체로 전환시켜 약리성분을 강화하고자 하였다. 생물전환 정도가 높은 보중익기탕 개발을 위하여 9종류의 균주에 의하여 보중익기탕이 발효되었으며, 우수한 균주를 검색하기 위하여 성분분석 및 생물전환 성분 분리, 동정이 실시되었다.
- 하지만 보중익기탕 발효물은 이전에 사용례가 없는 물질로, 효능평가 이전에 그 안전성에 대한 연구가 선행되어야 한다. 이에 본 연구에서는 발효이전의 탕제 및 발효물의 실험동물에 대한 단회투여 독성실험을 실시하였다. 실험에 사용된 동물 수는 시험결과의 해석 및 평가가 용이한 최소한의 수로 하였다.
- 본 연구에서는 발효보중익기탕의 급성독성을 실험적으로 평가하고자 ICR 마우스에 시험물질을 투여한 후 임상증상 및 부검소견, 치사율과 체중변화 등을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 처방구성에 따른 각 한약재들은 중량의 10배에 달하는 생수(화이트, muhak, Korea)에 1시간동안 침적시킨 다음 180분간 전탕추출법(cosmos-660, Gyeongseo extractor, Korea)에 의한 열수 추출을 실시하였다 발효과정은 다음과 같다. 추출된 보중익기탕은 1M NaOH로 pH를 7.
- 투여 용량은 OECD guide line16 및 식품의약품안전청 고시에서 2000 ㎎/㎏ 에서 사망이 나타나지 않는 물질을 무독성물질로 규정하고 있음을 바탕으로, 고용량 5000 ㎎/㎏를 기준으로 하여 공비 0.5로 각각 5000, 2500, 1250 ㎎/㎏, 암·수 각 3개의 용량군을 설정하였다.
- 단회투여 독성 실험은 한국한의학연구원 동물실험실에서 실시하였으며, 암·수 ICR 마우스(Orientbio, Korea)를 사용하였다. 외관을 육안으로 검사한 후 입고하였으며, 실험 실시 전 일주일간의 순화과정을 거친 후 실험을 수행하였다. 순화 기간 중, 일반 임상증상을 관찰하여 이상증상이 관찰된 동물은 실험에서 제외시켰으며, 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 대조군과 비교하여 시험물질 투여로 인한 급성독성 여부를 관찰하였고, 보중익기탕과 발효보중익기탕을 투여한 시험물질 투여군 간의 체중 및 임상증상 등을 비교함으로써, 발효로 인한 독성물질 생성 여부를 관찰하였다. 투여 경로는 한방 임상에서 주로 적용되고 있는 경구투여법을 이용하였으며, 경구투여용 일회용 존데와 주사관을 이용하여 배부 피부 고정법으로 몸체를 고정한 후 위내에 경구 투여하였다. 각 용량군의 한약재는 투여 직전에 멸균생리식염수로 희석하여 실험에 사용 하였다.
- 각 용량군의 한약재는 투여 직전에 멸균생리식염수로 희석하여 실험에 사용 하였다. 실험물질에 의한 독성을 평가하기 위하여 실험물질 투여 전 동물을 하룻밤 절식시켰으며, 투여 후 6시간 후 식이를 공급하였다.
- 임상 증상은 투여 직후부터 6시간 동안 매시간 관찰하였으며, 그 후 14일(1일 1회) 동안 일반증상 관찰법에 의하여 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행이상 등에 대한 일반 증상을 관찰하였다17. 모든 실험동물의 체중은 모든 동물에 대하여 투여 전과 투여 후 1, 3, 7, 14일에 일정한 시간에 측정하였다.
- . 모든 실험동물의 체중은 모든 동물에 대하여 투여 전과 투여 후 1, 3, 7, 14일에 일정한 시간에 측정하였다. 실험동물을 희생하기 전날 밤 18시간 절식시킨 후 부검하였으며, 마취제는 Zoletil50(Virbac S.
- A, France)과 Rompun 2%(Bayerkorea, Korea)을 사용하였다. 혈액 채취 및 방혈 후, 주요 내부 장기의 병변을 육안적으로 관찰하였고, 간, 심장, 신장, 폐, 비장을 적출하여 생리식염수로 3회 이상 세척 후 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
- 혈액학적 검사는 WBC(white blood cell), RBC(red blood cell), HGB(hemoglobin), HCT(hematocrit),MCH(Mean Corpuscular Hemoglobin), MCV(Mean Corpuscular Volume), MCHC(Mean Corpuscular Hemoglobin Boncentration), PLT(platelet), Neut(Neutrophil), Lymph(Lymphocyte), Mono(Monocyte)를 혈구분석기 ADVIA2120i(Siemens, Germany)를 이용하여 측정하였다.
- 혈액 생화학적 분석은 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic-pyruvic transaminase), LDH(lactate dehydrogenase), ALP(alkaline phosphatase),urea, creatinine을 자동생화학분석기 XL-200(MS Korea Co., Ltd, Korea)를 이용하여 측정하였다. 분석 시사용한 시료는 부검시 복부 대정맥에서 채취한 혈액을 5000 rpm, 10분 조건에서 원심분리하여 얻은 혈청을 사용하였다.
- 즉, 보중익기탕 및 발효보중익기탕 추출물은 암·수 ICR 마우스에 0(control), 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 단회 경구 투여하였고, 이후 14일 동안 사망율, 체중, 임상증상을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 유산균을 이용한 발효를 통하여 배당체 성분을 비배당체로 전환시켜 약리성분을 강화하고자 하였다. 생물전환 정도가 높은 보중익기탕 개발을 위하여 9종류의 균주에 의하여 보중익기탕이 발효되었으며, 우수한 균주를 검색하기 위하여 성분분석 및 생물전환 성분 분리, 동정이 실시되었다. 김 등14이 선행 발표한 연구결과에서, 보중익기탕 발효물의 생물전환 성분으로 isoliquiritigenin,liquiritigenin이 분리, 동정되었으며, 본 연구에 사용한 Lactobacillus fermentum 발효물이 생물전환 정도가 우수한 것으로 보고되었다.
- 실험에 사용된 동물 수는 시험결과의 해석 및 평가가 용이한 최소한의 수로 하였다. 본 시험물질은 경구용 제제로 임상에서 널리 사용되므로, 투여경로는 경구로 하였으며, 투여용량은 5000 ㎎/㎏을 고농도로 설정하였다. 즉, 보중익기탕 및 발효보중익기탕 추출물은 암·수 ICR 마우스에 0(control), 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 단회 경구 투여하였고, 이후 14일 동안 사망율, 체중, 임상증상을 관찰하였다.
- 즉, 보중익기탕 및 발효보중익기탕 추출물은 암·수 ICR 마우스에 0(control), 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 단회 경구 투여하였고, 이후 14일 동안 사망율, 체중, 임상증상을 관찰하였다. 투여 14일 후 부검하여 내부 장기의 이상병변 유무에 대한 육안적 소견을 관찰하였고, 주요 내부장기의 무게, 혈액 생화학 검사 및 혈구검사를 실시하였다. 실험결과, 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 투여한 모든 암·수 ICR 마우스에 대하여 사망이 관찰되지 않았고, 이로 인하여 LD50은 5000㎎/㎏ 이상으로 산출된다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 처방 내용은 Table 1과 같으며, 황기, 백출, 당귀, 진피, 시호는 국산을 영천현대약업사에서, 승마는 중국산을 영천현대약업사에서, 인삼은 국산을 농협중앙회에서, 감초는 중국산을 허브팜에서 각각 구입하였다.
- 5기압에서 15분간 가압멸균하고, 상온까지 냉각시킨 후, 유산균을 1%로(v/v)로 접종하고 37 ℃의 항온배양기에서 48시간동안 통기 배양하여 발효하였다. 발효에 사용한 유산균 Lactobacillus fermentum은 한국식품연구원(Korea Food Research Institute: KFRI) 식품미생물 유전자은행에서 분양받았다. 시료는 동결건조기(FD5512, IlshinBioBase, Korea)를 사용하여 분말 형태로 조제하였으며, 보중익기탕과 발효 보중익기탕의 함량 수율은 각 28.
- 발효에 사용한 유산균 Lactobacillus fermentum은 한국식품연구원(Korea Food Research Institute: KFRI) 식품미생물 유전자은행에서 분양받았다. 시료는 동결건조기(FD5512, IlshinBioBase, Korea)를 사용하여 분말 형태로 조제하였으며, 보중익기탕과 발효 보중익기탕의 함량 수율은 각 28.43과 28.40% 이다.
- 단회투여 독성 실험은 한국한의학연구원 동물실험실에서 실시하였으며, 암·수 ICR 마우스(Orientbio, Korea)를 사용하였다.
- 5주령 암·수 ICR 마우스에 대한 급성 경구독성을 평가하기 위하여 실험군은 대조군을 포함하여 총 7개 군을 설정하였다.
- 외관을 육안으로 검사한 후 입고하였으며, 실험 실시 전 일주일간의 순화과정을 거친 후 실험을 수행하였다. 순화 기간 중, 일반 임상증상을 관찰하여 이상증상이 관찰된 동물은 실험에서 제외시켰으며, 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다. 본 실험은 실험동물윤리위원회의 심의를 거쳤으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다.
- 모든 실험동물의 체중은 모든 동물에 대하여 투여 전과 투여 후 1, 3, 7, 14일에 일정한 시간에 측정하였다. 실험동물을 희생하기 전날 밤 18시간 절식시킨 후 부검하였으며, 마취제는 Zoletil50(Virbac S. A, France)과 Rompun 2%(Bayerkorea, Korea)을 사용하였다. 혈액 채취 및 방혈 후, 주요 내부 장기의 병변을 육안적으로 관찰하였고, 간, 심장, 신장, 폐, 비장을 적출하여 생리식염수로 3회 이상 세척 후 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
- , Ltd, Korea)를 이용하여 측정하였다. 분석 시사용한 시료는 부검시 복부 대정맥에서 채취한 혈액을 5000 rpm, 10분 조건에서 원심분리하여 얻은 혈청을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 SPSS package program(version 12.0)을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였으며 각 군의평균치간의 차이에 대한 유의성은 one-way ANOVA(analysis of variance)와 Tukey HSD에 의하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 단회투여 독성시험은 암·수 ICR 마우스를 대상으로 하였으며, 식품의약품안전청 고시 제 2009-116호 의약품 등의 독성시험방법15에 따라 실시하였다.
성능/효과
- 본 실험은 실험동물윤리위원회의 심의를 거쳤으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다.
- 단회투여 독성시험 실시 기간 동안 실험동물의 사망 및 임상증상을 관찰한 결과는 Table 2, 3과 같다. 시험물질 투여 후 14일간 실험동물을 관찰한 결과, 정상대조군과 비교하여 보행장애, 행동이상, 웅크림, 설사, 부종, 호흡촉박, 몸단장, 뛰어오름, 유루, 무기력증, 구토, 비루, 마비, 유연 등 시험 물질 투여와 관련된 어떠한 임상증상의 이상소견도 관찰되지 않았다. 또한 고용량 5000 ㎎/㎏을 투여한 실험동물을 포함 모든 실험군에서 사망이 관찰되지 않았으므로, LD50 값은 5000 ㎎/㎏ 이상으로 산출된다.
- 시험기간 동안 시험물질 투여군과 대조군모두 개시체중에 비하여 체중이 증가하였으며, 투여 전과 투여 후 1, 3, 7, 14일 모두 대조군과 시험군간의 유의적인 체중변화의 차이는 관찰할 수 없었으며, 보중익기탕 발효 전·후 추출물 투여군 간의유의적인 체중변화 차이 또한 관찰할 수 없었다.
- 실험물질 단회 투여 14일 후 실험동물의 장기의 무게는 Table 5와 같다. 간 및 신장에서 산발적인 간 및 신장 무게의 수컷에서는 증가가 암컷에서는 감소가 관찰되었으나, 용량의 존적이지 않으며, 통계적으로도 유의하지 않았다.
- 혈액학적 검사를 실시한 결과는 Table 6과 같다. WBC, RBC, HGB, HCT, MCH, MCV, MCHC 그리고 PLT 항목을 측정한 결과 모든 실험군의 혈액학적 검사 결과 수치가 정상대조군과 비교하여 유의한 증가나 감소는 관찰되지 않았다.
- 혈액생화학적 분석을 실시한 결과는 Table 7과 같다. GOT, GPT, LDH, UREA, Creatinine 항목을 측정한 결과 모든 실험군의 혈액학적 검사 결과 수치가 정상대조군과 비교하여 유의한 증가나 감소는 관찰되지 않았다.
- 실험결과, 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 투여한 모든 암·수 ICR 마우스에 대하여 사망이 관찰되지 않았고, 이로 인하여 LD50은 5000㎎/㎏ 이상으로 산출된다.
- 이에 본 연구에서는 발효이전의 탕제 및 발효물의 실험동물에 대한 단회투여 독성실험을 실시하였다. 실험에 사용된 동물 수는 시험결과의 해석 및 평가가 용이한 최소한의 수로 하였다. 본 시험물질은 경구용 제제로 임상에서 널리 사용되므로, 투여경로는 경구로 하였으며, 투여용량은 5000 ㎎/㎏을 고농도로 설정하였다.
- 실험결과, 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 투여한 모든 암·수 ICR 마우스에 대하여 사망이 관찰되지 않았고, 이로 인하여 LD50은 5000㎎/㎏ 이상으로 산출된다. 또한 시험기간 동안 각 농도의 보중익기탕 및 발효보중익기탕 추출물을 투여한 시험물질 투여군과 대조군에서 경구 투여 후 1, 3, 7, 14일의 체중에서 유의한 차이가 나타나지 않았고, 전 시험기간 동안 특이한 임상증상이 나타나지 않았으며, 부검소견에서도 내부 장기에 대한 어떠한 육안적 이상병변도 관찰되지 않았다. 혈구검사 및 혈액 생화학적 검사 결과를 분석한 결과, 정상대조군과 비교하여 감소나 증가가 산발적으로 보였으나, 이는 용량의 존적이지 않았으며, 통계적으로도 유의하지 않았다.
- 또한 시험기간 동안 각 농도의 보중익기탕 및 발효보중익기탕 추출물을 투여한 시험물질 투여군과 대조군에서 경구 투여 후 1, 3, 7, 14일의 체중에서 유의한 차이가 나타나지 않았고, 전 시험기간 동안 특이한 임상증상이 나타나지 않았으며, 부검소견에서도 내부 장기에 대한 어떠한 육안적 이상병변도 관찰되지 않았다. 혈구검사 및 혈액 생화학적 검사 결과를 분석한 결과, 정상대조군과 비교하여 감소나 증가가 산발적으로 보였으나, 이는 용량의 존적이지 않았으며, 통계적으로도 유의하지 않았다. 보중익기탕 원물은 이미 단회투여 독성연구가 실시되었으며, 안전한 물질로 보고되었다18 본 연구에서 또한 보중익기탕이 단회경구 투여 독성실험의 저독성 기준인 2000 ㎎/㎏을 훨씬 상회하는 5000 ㎎/㎏ 용량에서 실험동물에 독성이 나타나지 않았기에 김 등18의 연구결과와 같이 급성독성이 없는 안전한 물질로 생각되며, 보중익기탕 발효물에서도 독성 증상이 나타나지 않아, 암·수 ICR 마우스에 있어 보중익기탕 및 발효보중익기탕의 LD50은 5000 ㎎/㎏이상으로 산출된다.
- 1. 시험기간 중 모든 실험동물에서 사망동물이 관찰되지 않아, ICR 마우스에 대한 LD50값은 5000 ㎎/㎏ 이상으로 산출된다.
- 2. 시험기간 중 모든 동물에서 임상증상의 이 상례는 관찰되지 않았다
- 3. 보중익기탕 및 발효보중익기탕 추출물 투여로 인한 체중변화 역시 관찰되지 않았다.
- 4. 실험 종료 시, 주요 내부 장기에 대하여 육안적 병변을 관찰하였으나 이상 병변은 관찰되지 않았으며, 용량의존적인 장기무게의 증가나 감소도 관찰되지 않았다.
- 5. 혈액검사 결과, 정상대조군과 비교하여 유의한수치의 변화가 관찰되지 않았다.
후속연구
- 본 실험에 사용된 보중익기탕 및 발효보중익기탕은 선행연구에서liquiritigenin, isoliquiritigenin 두 성분이 발효 전에 비하여 20배가량 증가하였음을 보고하였다14. 하지만 보중익기탕 발효물은 이전에 사용례가 없는 물질로, 효능평가 이전에 안전성에 대한 검증이 반드시 필요하다. 이에 본 연구에서는 보중익기탕 발효전후 물질의 안전성을 규명하기 위하여 단회투여 독성시험을 실시하였다.
- 김 등14이 선행 발표한 연구결과에서, 보중익기탕 발효물의 생물전환 성분으로 isoliquiritigenin,liquiritigenin이 분리, 동정되었으며, 본 연구에 사용한 Lactobacillus fermentum 발효물이 생물전환 정도가 우수한 것으로 보고되었다. 하지만 보중익기탕 발효물은 이전에 사용례가 없는 물질로, 효능평가 이전에 그 안전성에 대한 연구가 선행되어야 한다. 이에 본 연구에서는 발효이전의 탕제 및 발효물의 실험동물에 대한 단회투여 독성실험을 실시하였다.
- 보중익기탕 원물은 이미 단회투여 독성연구가 실시되었으며, 안전한 물질로 보고되었다18 본 연구에서 또한 보중익기탕이 단회경구 투여 독성실험의 저독성 기준인 2000 ㎎/㎏을 훨씬 상회하는 5000 ㎎/㎏ 용량에서 실험동물에 독성이 나타나지 않았기에 김 등18의 연구결과와 같이 급성독성이 없는 안전한 물질로 생각되며, 보중익기탕 발효물에서도 독성 증상이 나타나지 않아, 암·수 ICR 마우스에 있어 보중익기탕 및 발효보중익기탕의 LD50은 5000 ㎎/㎏이상으로 산출된다. 즉, 보중익기탕 발효물은 발효로 인한 급성독성이 발생하지 않는 것으로 사료되나, 추후 실험적 연구를 통하여 포괄적인 연구가 필요할 것이다.
- 이상의 결과로 보아 발효보중익기탕은 실험동물에 대하여 급성 독성이 없는 한의약물로서 그 효능규명을 통한 활용이 기대된다.
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