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문제 정의
- 하지만 대부분의 액체크로마토그래피-유도결합플라즈마/질량분석기는 메틸수은 분리 시 전처리 용액의 pH를 조절하지 않으면 피크 깨짐 등의 문제가 발생하여 pH를 조절하고 있다. 본 연구에서는 어류에 잔류하는 메틸수은을 신속하고 정확하게 분석하기 위하여 마이크로웨이브를 이용한 전처리 방법, HPLCICP/MS 조건, 시험법 검증의 실험을 통하여 효율적인 분석법을 확립하였다. 전처리 방법은 추출용매 1% L-cysteineㆍHCl로 추출온도 60℃에서 추출시간 120분 동안 추출하는 최적 조건을 확립하였다.
- 이에 본 연구에서는 어류 중 잔류하는 메틸수은을 신속하고 정확하게 분석하기 위하여 마이크로웨이브를 이용한 전처리 방법, HPLC-ICP/MS 조건, 시험법 검증의 실험을 통하여 선진화된 분석법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 따라서 90℃ 이상의 온도에서 메틸수은이 분해되는 경향을 자세히 살펴보기 위하여 메틸수은의 표준용액을 90∼150℃에서 반응시킨 후 무기수은과 메틸수은의 농도를 비교하였다.
- 추출시간은 5, 10, 15, 20, 30, 60분 동안 반응시켰으며, 수은은 다른 중금속과 달리 상온에서 액체로 존재하는 금속으로 온도에 영향을 많이 받기 때문에 추출온도는 40, 60, 90, 120, 150℃로 변화시켰다. 또한 90℃이상 온도에 따른 메틸수은의 분해되는 경향을 살펴보기 위하여 메틸수은의 표준액을 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150℃로 다르게 반응시킨 후 무기수은과 메틸수은의 함량을 비교하였다. 시료량의 변화에 따른 회수율을 비교하기 위하여 시료량을 0.
- 또한 선택된 이동상에 대하여 농도를 0.01∼1.0%로 하여 컬럼의 내구성 및 효율성을 비교하였다.
- 선정된 추출용매 L-cysteineㆍHCl이 메틸수은 회수율에 미치는 최적의 농도를 알아보기 위하여 0.1∼2.0%로 농도를 다르게 하여 반응 시킨 후 회수율을 비교하였다.
- 선택된 이동상에 대하여 농도를 0.01∼1.0%에서 동일한 시료량을 반복 주입하여 효율성을 비교하였다.
- 시료량에 따른 메틸수은의 회수율을 알아보기 위하여 시료량을 0.2, 0.5, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0 g 까지 다르게 반응시킨 후 회수율을 비교하였다. 시료량 0.
- 또한 90℃이상 온도에 따른 메틸수은의 분해되는 경향을 살펴보기 위하여 메틸수은의 표준액을 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150℃로 다르게 반응시킨 후 무기수은과 메틸수은의 함량을 비교하였다. 시료량의 변화에 따른 회수율을 비교하기 위하여 시료량을 0.2, 0.5, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0 g로 각각 다르게 하여 실험하였다. 시료별(어종) 매질효과가 다르기 때문에 메틸수은 기준규격이 설정된 다랑어류, 새치류 및 심해성 어류(메로, 상어, 고래 및 홍메기)에 대하여 실험하였다.
- 0 g로 각각 다르게 하여 실험하였다. 시료별(어종) 매질효과가 다르기 때문에 메틸수은 기준규격이 설정된 다랑어류, 새치류 및 심해성 어류(메로, 상어, 고래 및 홍메기)에 대하여 실험하였다.
- 어류 중 메틸수은 HPLC-ICP/MS에 대한 조건 확립을 위하여 이동상의 종류 및 농도, 검출한계 및 정량한계에 대하여 실험을 수행하였다. 이동상의 종류는 L-cysteine + Pyridine, L-cysteine + Ammonium acetate 및 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl을 선택하여 실험을 수행하였다.
- 이동상 Pyridine + L-cysteine, L-cysteine + Ammonium acetate 및 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl은 문헌 등을 참고하여 선택하였으며(Qvarnstr m et al, 2002; Reyes et al, 2009; Santos et al, 2009), 이동상에 대한 메틸수은의 분리도 및 감도를 알아보았다. 메틸수은의 머무름 시간(Retention Time, RT)은 모두 5분 이내였으며, 감도 및 분리도는 약간의 차이가 있으나 모두 양호하게 나왔다.
- 메틸수은의 머무름 시간(Retention Time, RT)은 모두 5분 이내였으며, 감도 및 분리도는 약간의 차이가 있으나 모두 양호하게 나왔다. 이동상의 종류 (Pyridine + L-cysteine, L-cysteine + Ammonium acetate 및 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl)에 따른 컬럼 내구성 및 피크 분리도를 알아보기 위하여 각 이동상별로 동일한 시료 양을 반복 주입한 후 비교하였다. Pyridine + L-cysteine과 L-cysteine + Ammonium acetate 이동상은 일정 시료를 주입 후 피크폭이 넓어지거나 피크가 깨지는 경향이 나타났다(Fig.
- 어류 중 메틸수은 HPLC-ICP/MS에 대한 조건 확립을 위하여 이동상의 종류 및 농도, 검출한계 및 정량한계에 대하여 실험을 수행하였다. 이동상의 종류는 L-cysteine + Pyridine, L-cysteine + Ammonium acetate 및 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl을 선택하여 실험을 수행하였다. 또한 선택된 이동상에 대하여 농도를 0.
- 전처리 조건 중 메틸수은 분석에 영향을 미치는 추출용매의 종류 및 농도, 추출시간 및 온도, 어종, 시료량 등의 요인에 대하여 실험을 수행하였다. 추출용매의 종류는 50% 메탄올, 0.
- 추출시간에 따른 메틸수은의 회수율을 알아보기 위하여 5∼60분 동안 반응시킨 후 회수율을 비교하였다.
- 0%로 다양하게 하여 처리하여 실험하였다. 추출시간은 5, 10, 15, 20, 30, 60분 동안 반응시켰으며, 수은은 다른 중금속과 달리 상온에서 액체로 존재하는 금속으로 온도에 영향을 많이 받기 때문에 추출온도는 40, 60, 90, 120, 150℃로 변화시켰다. 또한 90℃이상 온도에 따른 메틸수은의 분해되는 경향을 살펴보기 위하여 메틸수은의 표준액을 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150℃로 다르게 반응시킨 후 무기수은과 메틸수은의 함량을 비교하였다.
- 추출시간에 따른 메틸수은의 회수율을 알아보기 위하여 5∼60분 동안 반응시킨 후 회수율을 비교하였다. 추출시간을 5분에서 15분까지 증가시켰을 때, 메틸수은 회수율도 60%(5분)에서 94%(15분)로 비례적으로 증가 하였으며 15분 이후에는 메틸수은 회수율이 94%로 비슷한 수준을 나타내어 추출시간을 15분으로 설정하였다(Table 3).
- 추출온도가 메틸수은 회수율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다랑어 및 메로에 대해 온도를 40, 60, 90, 100, 120, 150℃에서 각기 반응시킨 후 회수율을 비교하였다. 추출온도 40℃에서 다랑어 및 메로의 메틸수은 회수율은 각각 81, 83%이였으며, 추출온도 60∼90℃에서의 회수율 범위는 94∼100%였다(Table 4).
- 추출용매가 메틸수은 회수율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 50% 메탄올, 0.25 M NaCl + 5 M HCl 및 1% L-cysteineㆍHCl을 처리한 후 메틸수은의 회수율을 비교하였다. 추출용매 중 50% 메탄올은 수산물 중 비소 화학종 동시 분석에 사용되는 용매로서 수은 화학종과 동시에 전처리할 수 있는 가를 알아보기 위해 적용하였지만 회수율이 20% 로 낮았다.
- 추출용매의 종류는 50% 메탄올, 0.25 M NaCl + 5 M HCl 및 1% L-cysteineㆍHCl을선택하였으며, 선정된 추출용매의 농도를 0.1∼2.0%로 다양하게 하여 처리하여 실험하였다.
- 확립된 전처리 및 기기조건의 검증을 위하여 매질(Matrix)이 어류인 표준인증물질(Certified Reference Material) 3개(BCR-463: IRMM, Geel in Belgium, ERM-CE464: IRMM Geel in Belgium, SRM 1976: NIST, MD in USA)를 구입하여 정확성 및 반복성을 평가하였다.
대상 데이터
- 이외에도 컬럼에 대한 이론단수가 낮아져 피크에 대한 감도 및 머무름 시간 등에 영향을 미쳤다. L-cysteine + L-cysteineㆍ HCl 이동상은 다른 두 개의 이동상과 동일한 시료 양을 반복 주입 한 후에도 분리도가 1.2 이상으로 양호하였고 피크 끌림도 일어나지 않아 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl을 이동상으로 선정하였다(Fig. 3).
- 메틸수은 기준규격이 설정된 눈다랑어, 흑새치 및 심해성어류(메로, 상어, 고래 및 홍메기)를 수산물시장, 백화점 및 대형마트 등을 통해 기준규격이 설정된 가식부위를 구매하여 별도의 손질과정 없이 시료를 균질화한 후 실험에 사용하였다.
- 메틸수은(CH3Hg+) 표준품은 염화메틸수은(CH3HgCl, methylmercury chloride, Alfa Aesar, MA, USA)을 구매하였으며, 시약은 L-cysteineㆍHClㆍH2O(Purity: >99.0%, SigmaAldrich, MO, USA), HCl(Purity: 37.0%, Sigma- Aldrich, MO, USA), NaCl(Purity: >99.0%, Sigma-Aldrich, MO, USA), CH3OH(Purity: >99.0%, J.T. Baker, Korea), NH4COOH(Purity: 99.0% trace metals basis, Sigma- Aldrich, MO, USA), Pyridine(Purity: 99.8%, Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 L-cysteine(Purity: >99%, Acros, Geel, Belgium)를 구매하여 사용하였다.
- 8%, Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 L-cysteine(Purity: >99%, Acros, Geel, Belgium)를 구매하여 사용하였다. 모든 실험에 사용된 증류수는 Milli-Q ultrapure water purification system(Millipore Co., Massachusetts, USA)에 의해 18.2 MΩ 수준으로 정제된 물을 사용하였다.
- 1). 추출용매 1% L-cysteineㆍHCl은 산성용액이면서도 메틸수은과 결합력이 강한 SH기를 함유하고 있어 다른 2개의 추출용매보다 회수율이 높고 플라즈마가 안정화되어 피크 끌림 현상이 없어 추출용매로 선정하였다(Table 1).
데이터처리
- 검출한계 및 정량한계는 공시료(메틸수은을 함유하지 않은 시료에 전처리 과정을 동일하게 한 시료)를 10회 측정한 후 표준편차를 구한 다음 각각 표준편차× 3.3/표준검량곡선의 기울기와 공시료의 표준편차× 10/표준검량곡선의 기울기를 이용하여 산출하였다(Isabel Taverniers et al., 2004).
- 0%로 하여 컬럼의 내구성 및 효율성을 비교하였다. 직선성을 평가하기 위하여 분석물질의 농도와 측정값을 각각 x와 y축으로 하여 검량선을 작성 한 후, 회귀분석하였다. 검출한계 및 정량한계는 공시료(메틸수은을 함유하지 않은 시료에 전처리 과정을 동일하게 한 시료)를 10회 측정한 후 표준편차를 구한 다음 각각 표준편차× 3.
성능/효과
- 0%에서 동일한 시료량을 반복 주입하여 효율성을 비교하였다. 0.01% L-cysteine +0.01% L-cysteineㆍHCl은 피크 폭이 넓게 나타났으며, 1.0% L-cysteine + 1.0% L-cysteineㆍHCl은 바탕선(Baseline)이 높게 형성되어 미량 검출에 문제가 있었다(Fig. 4). 0.
- 4). 0.1% L-cysteine + 0.1% L-cysteineㆍHCl는 0.01% 농도에 비해 메틸수은의 피크 폭도 좁아졌고 감도도 향상 되었으며, 0.5%이상의 농도보다는 바탕선(Baseline)이 낮게 형성되어 미량 수준 까지 검출 할 수 있었다(Fig. 5).
- 이는 50% 메탄올이 다른 추출용매에 비하여 메틸수은과 결합되어 있는 단백질 등을 해리할 수 있는 능력이 떨어지며, 또한 ICP-MS의 플라즈마에 유기용매를 일정량 이상 사용할 경우 플라즈마가 불안정하여 정확한 양을 측정하기 어렵기 때문이다. 0.25 M NaCl + 5 M HCl은 식품공전에서 어류 중 GC-ECD를 이용한 메틸수은 분석에 있어 전처리 용매로 사용되어지고 있어 선정하였으며 회수율도 93%로 높았다. 하지만 메틸수은과 결합력이 강한 SH기를 함유한 물질이 없고, 산도가 높기 때문에 일정이상의 시간이 경과 하면 메틸수은에 대한 감도가 저하되고, 피크 끌림 등의 현상이 발생하는 문제점이 있다(Fig.
- 이동상의 종류 (Pyridine + L-cysteine, L-cysteine + Ammonium acetate 및 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl)에 따른 컬럼 내구성 및 피크 분리도를 알아보기 위하여 각 이동상별로 동일한 시료 양을 반복 주입한 후 비교하였다. Pyridine + L-cysteine과 L-cysteine + Ammonium acetate 이동상은 일정 시료를 주입 후 피크폭이 넓어지거나 피크가 깨지는 경향이 나타났다(Fig. 2). 이외에도 컬럼에 대한 이론단수가 낮아져 피크에 대한 감도 및 머무름 시간 등에 영향을 미쳤다.
- 기기조건 중 HPLC에서는 시료주 입량 50 μL, 컬럼온도는 25℃에서 0.1% L-cysteineㆍHCl + 0.1% L-cysteine 이동상으로 메틸수은을 분리 한 후, ICP-MS에서 분자량 202의 분석물질을 정량하는 조건을 확립하였다.
- 다양한 시료에 대한 확립된 시험법을 적용한 결과, 눈다랑어, 흑새치, 메로, 상어, 고래 및 홍메기에서 메틸수은 회수율은 각각 97, 97, 98, 95, 99, 96%로 AOAC에서 제시한 1mg/kg을 첨가 할 때의 80∼110%에 만족한 결과를 나타내었다(Table 7).
- 이동상 Pyridine + L-cysteine, L-cysteine + Ammonium acetate 및 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl은 문헌 등을 참고하여 선택하였으며(Qvarnstr m et al, 2002; Reyes et al, 2009; Santos et al, 2009), 이동상에 대한 메틸수은의 분리도 및 감도를 알아보았다. 메틸수은의 머무름 시간(Retention Time, RT)은 모두 5분 이내였으며, 감도 및 분리도는 약간의 차이가 있으나 모두 양호하게 나왔다. 이동상의 종류 (Pyridine + L-cysteine, L-cysteine + Ammonium acetate 및 L-cysteine + L-cysteineㆍHCl)에 따른 컬럼 내구성 및 피크 분리도를 알아보기 위하여 각 이동상별로 동일한 시료 양을 반복 주입한 후 비교하였다.
- 시료량 0.2∼1.5 g에서 메틸수은의 회수율은 90∼98%였으며, 시료량 2.0 g에서는 매질의 영향 때문에 메틸수은의 회수율이 73%로 0.2∼1.5 g에 비해 20%정도 감소하였다(Table 6).
- 본 연구에서는 어류에 잔류하는 메틸수은을 신속하고 정확하게 분석하기 위하여 마이크로웨이브를 이용한 전처리 방법, HPLCICP/MS 조건, 시험법 검증의 실험을 통하여 효율적인 분석법을 확립하였다. 전처리 방법은 추출용매 1% L-cysteineㆍHCl로 추출온도 60℃에서 추출시간 120분 동안 추출하는 최적 조건을 확립하였다. 기기조건 중 HPLC에서는 시료주 입량 50 μL, 컬럼온도는 25℃에서 0.
- 확립된 전처리 및 기기조건을 통하여 시료별 회수율을 구한 결과 95∼99%였다. 전처리 용매와 이동상에 L-cysteine이 존재함으로써 수은에 대한 안정성, Memory effect 및 피크 끌림 등의 문제를 해결할 수 있었다. 확립된 HPLC-ICP/MS 방법에 대해 표준인증물질을 이용하여 검증한 결과, 회수율 및 상대표준편차가 각각 93∼96%, 1∼3%였다.
- 직선성은 분석물질의 50∼150% 농도범위 내 5개 농도에 대한 측정값과 분석물질의 농도 관계를 회귀분석하여 평가한 결과, 상관계수(r2) 값은 0.9998로 일반적으로 인정하는 r2>0.99 이상으로 만족하는 결과를 나타내었다.
- 추출온도 40℃에서 다랑어 및 메로의 메틸수은 회수율은 각각 81, 83%이였으며, 추출온도 60∼90℃에서의 회수율 범위는 94∼100%였다(Table 4).
- 추출용매 L-cysteineㆍHCl의 농도 0.1∼0.6%에서 메틸수은의 회수율은 47∼62%였으나, 0.9∼2.0%에서는 추출용매의 농도가 증가할수록 메틸수은 회수율도 증가하는 것으로 나타났다(Table 2).
- 확립된 HPLC-ICP/MS 방법에 대해 표준인증물질을 이용하여 검증한 결과, 회수율 및 상대표준편차가 각각 93∼96%, 1∼3%였다.
- 확립된 HPLC-ICP/MS 방법에 대해 표준인증물질을 이용하여 검증한 결과, 회수율 및 상대표준편차가 각각 93∼96%, 1∼3%였다. 확립된 방법은 추출과정 후 별도의 전처리 과정 없이 바로 HPLC-ICP/MS를 이용하여 검출할 수 있어 메틸수은을 분석하기에 매우 적합한 것으로 판단된다.
- 확립된 전처리 및 기기조건을 통하여 시료별 회수율을 구한 결과 95∼99%였다.
- 확립된 전처리 및 기기조건의 검증을 위하여 표준인증물질 BCR-463, ERM-CE464 및 SRM 1976에 대한 정확성을 구하기 위하여 회수율을 구한 결과, 각각 95, 93 및 96%로 AOAC에서 제시한 회수율 범위 80∼110%에 만족한 결과를 얻었으며, 반복성은 상대표준편차를 이용하여 구한 결과, 모든 표준인증물질에서 3% 이내로 AOAC에서 제시한 범위 6∼15%에 만족한 결과를 얻었다(Table 8).
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