[논문]한국의 논 토양 미생물 다양성 분석을 위한 Quantitative Real-time PCR의 응용

최명은; 이인중; 신재호

doi:10.5338/kjea.2011.30.4.367

한국의 논 토양 미생물 다양성 분석을 위한 Quantitative Real-time PCR의 응용
Assessment of Korean Paddy Soil Microbial Community Structure by Use of Quantitative Real-time PCR Assays 원문보기

한국환경농학회지 = Korean journal of environmental agriculture, v.30 no.4, 2011년, pp.367 - 376

최명은 (경북대학교 농업생명과학대학 응용생명과학부) , 이인중 (경북대학교 농업생명과학대학 응용생명과학부) , 신재호 (경북대학교 농업생명과학대학 응용생명과학부)

초록
AI-Helper

논 토양의 미생물 생태 다양성을 조사하기 위한 효과적인 방법으로 qRT-PCR을 적용하고자 본 연구를 수행하였다. 논 토양 미생물의 gDNA를 분리하기 위하여 Mo Bio kit를 사용한 효과적이고 안정적인 gDNA 분리 방법을 확립하였다. 논 토양 미생물 다양성을 qRT-PCR로 검출하기 위하여 bacteria를 세분한 ${\alpha}$-Proteobacteria, ${\beta}$-Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes 다섯 가지 문과 전체 bacteria, 전체 fungi를 구분할 수 있는 특이 primer set을 선정하여 다양한 조건의 시험을 통하여 최종 조건을 확립하였으며 재현성 실험을 통하여 방법의 유의성을 검증하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

BACKGROUND: In order to develop effective assessment method for Korean paddy soil microbial community structure, reliable genomic DNA extraction method from paddy soil and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) method are needed to establish METHODS AND RESULTS: Out of six conventional soil genomic DNA extraction methods, anion exchange resin purification method was turn to be the most reliable. Various PCR primers for distinguishing five bacterial phylum (${\alpha}$-Proteobacteria, ${\beta}$-Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes), all bacteria, and all fungi were tested. Various qRT-PCR temperature conditions were also tested by repeating experiment. Finally, both genomic DNA extraction and qRT-PCR methods for paddy soil were well established. CONCLUSION: Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) method to assess paddy soil microbial community was established.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

논 토양의 미생물 생태 다양성을 조사하기 위한 효과적인 방법으로 qRT-PCR을 적용하고자 본 연구를 수행하였다. 논 토양 미생물의 gDNA를 분리하기 위하여 Mo Bio kit를 사용한 효과적이고 안정적인 gDNA 분리 방법을 확립하였다.
일반 토양에 비해 DNA의 추출이 어려운 논 토양 미생물의 gDNA를 추출하기 위한 최적의 방법을 찾기 위하여 재료 및 방법에서 자세히 언급된 바와 같은 다양한 추출 방법을 시도하였다. 이때, 논 토양과 추출성을 비교하기 위한 대조군으로 과수원 토양에서도 같은 방법으로 gDNA를 추출하였다(Fig.

제안 방법

qRT-PCR 결과의 해석을 위하여 각 phylum 별 표준 미생물의 16S 혹은 18S rDNA에 감응하는 qRT-PCR의 standard curve를 작성하기 위해 각각의 표준 벡터를 qRT-PCR의 주형 DNA로 사용하여 qRT-PCR 반응 후 주형 DNA의 농도에 따른 형광 검출곡선의 Ct 값과 초기 농도 값의 관계를 copy 수로 변환한 뒤 선형감응 정량선을 작성하였다(Fig. 2G ~ 2L). 전체 정량선의 R² 값이 0.
qRT-PCR 반응 용액은 추출한 토양 gDNA 1 ng과 각각의 primer set 10 pmol, SYBR Green dye와 완충용액, 효소가 함유된 SsoFastTM EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) 5 μL를 혼합한 다음 멸균 증류수를 적당량 첨가하여 총 10 μL가 되도록 제조하였다.
qRT-PCR을 이용한 각 미생물의 정량을 위하여 각 phylum을 대표하는 6종의 미생물로부터 16S rDNA 및 18S rDNA를 클로닝하여 복제 및 보관이 쉽고 copy 수를 정확히 알 수 있는 플라스미드 벡터로 제작한 뒤 qRT-PCR의 표준 정량에 사용하였다. 약 1465-bp에 해당하는 16S rDNA를 클로닝한 pα-Proteobacteria, pβ-Proteobacteria, pActinobacteria, pBacteroidetes, pFirmicutes 등의 플라스미드는 모두 5,272-bp로 분자량을 약 3,427 Kg / mole으로 환산하여 실험에 사용하였고 340-bp에 해당하는 18S rDNA를 클로닝한 pFungi는 4,147-bp의 크기로 분자량을 2,696 Kg / mole로 환산하여 표준 벡터로 사용하였다.
각 phylum의 16S rDNA 혹은 18s rDNA를 클로닝하기 위해서 SolGent™ T-Blunt PCR Cloning Kit (SolGent, Daejeon, Korea)에 포함된 T-vector를 사용하였다.
각 phylum의 16S rDNA가 클로닝된 plasmid는 qRT-PCR 조건과 표준 정량 그래프가 실제 논 토양에서 사용될 수 있는지 알아보기 위하여 모델 논 토양에 10 ng씩 각 phylum 별로 투입하여 그 수치가 재현성 있게 나타나는지를 조사하였다.
PCR 반응조건은 95℃에서 denaturation을 한 후, 각각의 온도로 annealing 반응을 진행하고 72℃에서 30 초간 extention 하는 cycle을 35회 반복하는 것으로 하였다. 각 단계별 반응 시간과 annealing 온도는 각 phylum 별로 최적화시켜 진행하였다.
이상과 같은 결과를 종합하여 확보한 논 토양 미생물 군집 분석을 위한 표준 qRT-PCR 조건과 재료 및 방법에서 기술한 각 phylum 별 표준 primer set을 확립하였다. 각각의 qRT-PCR 산물들은 최적의 선형 감응도를 유지하기 위해 180 ~ 365-bp의 짧은 길이를 택하였고 각 phylum 별 증폭 cycle에서 bacterial phylum은 안정적인 초기 denature를 위해 95℃에서 5분간 pre-heating하였으나 Bacteriodetes의 증폭에는 1 분간, Fungi의 증폭에는 10 분간 pre-heating 하였다. 모든 bacteria의 annealing temperature는 60℃를 사용하였으나 Bacteriodetes의 경우 특이성을 높이기 위해 65℃를 사용하였다.
논 토양 미생물 다양성을 qRT-PCR로 검출하기 위하여 bacteria를 세분한 α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes 다섯 가지 문과 전체 bacteria, 전체 fungi를 구분할 수 있는 특이 primer set을 선정하여 다양한 조건의 시험을 통하여 최종 조건을 확립하였으며 재현성 실험을 통하여 방법의 유의성을 검증하였다.
논 토양 미생물 다양성을 qRT-PCR로 분석하기 위하여 기존의 연구자들이 미생물 군집 탐지를 위해 제시한 수십 종의 primer를 제작하고 시행착오적 PCR test를 통하여 논 토양에서 세균과 진균을 구분하여 검출할 수 있는 primer set와 세균을 5종의 phylum으로 분리하여 검출할 수 있는 논 토양에 최적인 primer set을 선정하였다(Table 2).
논 토양 미생물 다양성을 qRT-PCR로 분석하기 위하여 먼저 논 토양으로부터 미생물 gDNA를 안정적으로 추출하는 방법을 확립하였다. 실험에 사용된 논 토양은 경상북도 군위에서 3 년 이상 우렁이 농법으로 경작된 곳에서 채취하여 사용하였다.
논 토양의 미생물 생태 다양성을 조사하기 위한 효과적인 방법으로 qRT-PCR을 적용하고자 본 연구를 수행하였다. 논 토양 미생물의 gDNA를 분리하기 위하여 Mo Bio kit를 사용한 효과적이고 안정적인 gDNA 분리 방법을 확립하였다. 논 토양 미생물 다양성을 qRT-PCR로 검출하기 위하여 bacteria를 세분한 α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes 다섯 가지 문과 전체 bacteria, 전체 fungi를 구분할 수 있는 특이 primer set을 선정하여 다양한 조건의 시험을 통하여 최종 조건을 확립하였으며 재현성 실험을 통하여 방법의 유의성을 검증하였다.
본 연구에서는 상대적으로 토양 genomic DNA(gDNA)의 추출과 분석이 까다로운 우리나라 논 토양에 존재하는 미생물 군집 구조를 다섯 가지 세균 phylum과 진균으로 구분하여 넓은 범위의 분류학적 접근으로 분석하는 방법과 각 미생물 군집을 이루는 주된 그룹들을 상대적으로 정량하는 방법을 확립하였다.
4 N K₂Cr₂O₇·H₂O in H₂SO₄ / H₂O (1 : 1)) 10 mL를 가하고 소형 여두를 덮은 뒤 200℃ 전열판에서 5분간 가열한 다음 냉각시켰다. 소량의 증류수로 여두 부분을 씻어 내린 후 증류수 150 mL을 첨가한 다음 5 mL phosphoric acid (85 % H₃PO₄)와 0.3 mL 지시약(diphenylamine 0.5% in H₂O / H₂SO₄ (1 : 5))을 가한 뒤 0.2 N의 황산 제1철 암모니움 용액(Fe(NH₄)₂(SO₄)₂6H₂O)으로 담녹색 종말점을 확인하여 적정하였다. 토성 분석을 위하여 채취한 토양을 dry oven에 넣어 50℃ 에서 72 시간 동안 완전히 건조한 다음 분쇄하여 2 mm, 0.
일반 토양에 비해 DNA의 추출이 어려운 논 토양 미생물의 gDNA를 추출하기 위한 최적의 방법을 찾기 위하여 재료 및 방법에서 자세히 언급된 바와 같은 다양한 추출 방법을 시도하였다. 이때, 논 토양과 추출성을 비교하기 위한 대조군으로 과수원 토양에서도 같은 방법으로 gDNA를 추출하였다(Fig. 1). 추출된 total DNA를 0.
이렇게 확립된 qRT-PCR 조건과 표준 정량 그래프가 실제 논 토양에서 사용될 수 있는지 알아보기 위하여 모델 논 토양을 분석하고 여기에 미리 알고 있는 양의 각 phylum 별 미생물을 투입하여 그 수치가 재현성 있게 나타나는지를 조사하였다(Table 5).
이상과 같은 결과를 종합하여 확보한 논 토양 미생물 군집 분석을 위한 표준 qRT-PCR 조건과 재료 및 방법에서 기술한 각 phylum 별 표준 primer set을 확립하였다. 각각의 qRT-PCR 산물들은 최적의 선형 감응도를 유지하기 위해 180 ~ 365-bp의 짧은 길이를 택하였고 각 phylum 별 증폭 cycle에서 bacterial phylum은 안정적인 초기 denature를 위해 95℃에서 5분간 pre-heating하였으나 Bacteriodetes의 증폭에는 1 분간, Fungi의 증폭에는 10 분간 pre-heating 하였다.
, Boston, MA, USA)를 사용하여 용액의 pH를 측정하였다. 전기전도도(electric conductivity, EC)의 측정을 위하여 풍건 토양 10 g에 증류수 50 mL을 가한 뒤 60 분간 진탕하고 Whatman No. 2 filter paper (7-cm diameter)로 여과한 후 여액을 Orion 3-STAR EC meter (Orion Research Inc., Boston, USA)로 측정하였다. 유기물은 Tyurin법으로 측정하였다(Schollenberger, 1927).
1A의 전기영동 사진에서 보이는 하단의 끌림 현상은 주로 토양의 humic acid가 제거되지 않아 생기는 것으로 anion exchange resin을 사용한 토양 gDNA 분리 kit를 사용했을 때에는 효율적으로 제거되는 것을 알 수 있다. 추출한 total DNA를 Implen 사의 NanoPhotometer (model 1443, Implan GmbH, Munich, Germany)를 사용하여 A260 nm, A280 nm, A230 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A260/A280, A260/A230의 비로 각각 protein과 humic acid의 오염 정도를 나타내었다. Table 4에서 보는 바와 같이 lysis buffer method로 추출한 논 토양 gDNA 농도와 순도가 가장 낮았고, Mo Bio PowerSoil kit으로 추출한 과수원 토양 gDNA 순도가 가장 높았다.
2 N의 황산 제1철 암모니움 용액(Fe(NH₄)₂(SO₄)₂6H₂O)으로 담녹색 종말점을 확인하여 적정하였다. 토성 분석을 위하여 채취한 토양을 dry oven에 넣어 50℃ 에서 72 시간 동안 완전히 건조한 다음 분쇄하여 2 mm, 0.425 mm, 0.075 mm 체에 통과시키면서 각 체를 통과하는 백분율로 입도 분석한 다음 얻어진 모래, 실트, 점토의 비를 토성구분표에 대입하여 토성을 확인하였다.
화학성분 분석은 농촌진흥청 농업과학기술원 토양 및 식물체 분석법(NIAST, 2000)을 적용하였다. 토양의 pH 측정을 위하여 토양에 증류수의 비율이 1 : 5 (w / w)가 되도록 증류수를 첨가하고 1 시간 동안 진탕한 후 표준 전극을 넣고 60 초 이내에 Orion 520A pH meter (Orion Research, Inc., Boston, MA, USA)를 사용하여 용액의 pH를 측정하였다. 전기전도도(electric conductivity, EC)의 측정을 위하여 풍건 토양 10 g에 증류수 50 mL을 가한 뒤 60 분간 진탕하고 Whatman No.
실험 토양을 확보하기 위해 5 cm 깊이의 겉흙을 제거한 후 깊이 5 cm ~ 20 cm까지의 토양을 논의 다양한 부위로부터 취하였으며, 채취한 토양은 즉시 비닐 봉투에 넣고 잘 섞어 토양 gDNA 추출용 토양 원 시료로 사용하였다. 토양의 토성분석을 위해서 실험실에서 7일간 풍건하고 잘게 부수어 2 mm 체를 통과시킨 것을 화학성분 분석에 사용하였다. 화학성분 분석은 농촌진흥청 농업과학기술원 토양 및 식물체 분석법(NIAST, 2000)을 적용하였다.
확립된 PCR primer가 서로 다른 phylum에서는 증폭되지 않는 특이성을 확보하기 위하여 다양한 qRT-PCR 반응 조건을 시험하였다. 각 phylum을 대표하는 균주를 주형으로 다양한 annealing 온도 조건에서 PCR을 수행한 결과 Fig.

대상 데이터

본 실험에 사용한 시약들은 각 제조사의 GR (Guaranteed Reagent)급 이상의 것들을 사용 목적에 맞게 각각 구매하여 사용하였다. DNA의 분리, 플라스미드의 추출 및 PCR 등 각종 DNA 조작에 사용한 각종 효소 및 kit은 주로 솔젠트 사(SolGent, Daejeon, Korea)의 것을 사용하였고 전기영동 등에 필요한 시약은 다카라 사(TaKaRa Korea Medical Inc., Seoul, Korea)의 것을 이용하였다. 각종 완충용액 및 항생제 등 기초 시약은 주로 Sigma 사(Sigma Co.
대장균 DH5α는 각종 플라스미드의 클로닝, 조작, 보존 및 추출을 위해서 사용하였다. qRT-PCR standard curve를 작성하기 위하여 농촌진흥청 농업유전자원정보센터(KACC)로부터 분양받아 사용한 각 phylum 별 미생물은 Table 1과 같다. 각 phylum의 16S rDNA 혹은 18s rDNA를 클로닝하기 위해서 SolGent™ T-Blunt PCR Cloning Kit (SolGent, Daejeon, Korea)에 포함된 T-vector를 사용하였다.
대장균 배양 및 보존을 위한 배지로는 Luria Bertani (LB) 배지를 사용하였고, 필요에 따라 항생제 ampicillin을 최종 100 μg/mL의 농도로 첨가하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 시약들은 각 제조사의 GR (Guaranteed Reagent)급 이상의 것들을 사용 목적에 맞게 각각 구매하여 사용하였다. DNA의 분리, 플라스미드의 추출 및 PCR 등 각종 DNA 조작에 사용한 각종 효소 및 kit은 주로 솔젠트 사(SolGent, Daejeon, Korea)의 것을 사용하였고 전기영동 등에 필요한 시약은 다카라 사(TaKaRa Korea Medical Inc.
실험에 사용된 토양은 경상북도 군위군의 우렁이 농법을 시행하는 논에서 (위도 36° 6′ 8″, 경도 128° 37′ 11″) 채취하였다. 실험 토양을 확보하기 위해 5 cm 깊이의 겉흙을 제거한 후 깊이 5 cm ~ 20 cm까지의 토양을 논의 다양한 부위로부터 취하였으며, 채취한 토양은 즉시 비닐 봉투에 넣고 잘 섞어 토양 gDNA 추출용 토양 원 시료로 사용하였다. 토양의 토성분석을 위해서 실험실에서 7일간 풍건하고 잘게 부수어 2 mm 체를 통과시킨 것을 화학성분 분석에 사용하였다.
논 토양 미생물 다양성을 qRT-PCR로 분석하기 위하여 먼저 논 토양으로부터 미생물 gDNA를 안정적으로 추출하는 방법을 확립하였다. 실험에 사용된 논 토양은 경상북도 군위에서 3 년 이상 우렁이 농법으로 경작된 곳에서 채취하여 사용하였다. 사용된 논 토양의 주요 물리 화학성은 Table 3과 같다.
실험에 사용된 토양은 경상북도 군위군의 우렁이 농법을 시행하는 논에서 (위도 36° 6′ 8″, 경도 128° 37′ 11″) 채취하였다.

이론/모형

, Boston, USA)로 측정하였다. 유기물은 Tyurin법으로 측정하였다(Schollenberger, 1927). 풍건토양 0.
토양의 토성분석을 위해서 실험실에서 7일간 풍건하고 잘게 부수어 2 mm 체를 통과시킨 것을 화학성분 분석에 사용하였다. 화학성분 분석은 농촌진흥청 농업과학기술원 토양 및 식물체 분석법(NIAST, 2000)을 적용하였다. 토양의 pH 측정을 위하여 토양에 증류수의 비율이 1 : 5 (w / w)가 되도록 증류수를 첨가하고 1 시간 동안 진탕한 후 표준 전극을 넣고 60 초 이내에 Orion 520A pH meter (Orion Research, Inc.

성능/효과

Lysis buffer method의 경우 오염의 정도로 나타날 수 있는 전기영동상 끌림 현상이 적은 반면에 DNA 절대량이 부족했고, sodium phosphate buffer method와 skim milk method는 상대적으로 추출된 DNA양이 많은 반면에 끌림 현상이 많이 나타났다. Epicentre kit와 Mo Bio kit를 사용한 추출법에서는 끌림이 없는 깨끗한 DNA band를 얻을 수 있었는데 특히 Mo Bio kit를 사용한 경우 논 토양과 과수원 토양 모두에서 더 높은 효율로 추출되었다. Fig.
모든 bacteria의 annealing temperature는 60℃를 사용하였으나 Bacteriodetes의 경우 특이성을 높이기 위해 65℃를 사용하였다. Fungi를 검출하기 위한 annealing temperature는 62℃를 사용하였고 denaturation과 annealing을 각각 20 sec으로 줄였을 때 최적의 특이성이 나타났다. Extension은 72℃에서 30 sec으로 모두 같은 조건으로 하였다.
1에서 보는 바와 같이 시도된 방법 모두에서 전체적으로 논 토양보다 과수원 토양에서 추출한 gDNA의 band가 더 진하였고 순도도 대체로 높은 것으로 나타났다. Lysis buffer method의 경우 오염의 정도로 나타날 수 있는 전기영동상 끌림 현상이 적은 반면에 DNA 절대량이 부족했고, sodium phosphate buffer method와 skim milk method는 상대적으로 추출된 DNA양이 많은 반면에 끌림 현상이 많이 나타났다. Epicentre kit와 Mo Bio kit를 사용한 추출법에서는 끌림이 없는 깨끗한 DNA band를 얻을 수 있었는데 특히 Mo Bio kit를 사용한 경우 논 토양과 과수원 토양 모두에서 더 높은 효율로 추출되었다.
추출한 total DNA를 Implen 사의 NanoPhotometer (model 1443, Implan GmbH, Munich, Germany)를 사용하여 A260 nm, A280 nm, A230 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A260/A280, A260/A230의 비로 각각 protein과 humic acid의 오염 정도를 나타내었다. Table 4에서 보는 바와 같이 lysis buffer method로 추출한 논 토양 gDNA 농도와 순도가 가장 낮았고, Mo Bio PowerSoil kit으로 추출한 과수원 토양 gDNA 순도가 가장 높았다. 논 토양 추출 gDNA는 수치상으로는 skim milk와sodium phosphate 방법으로 뽑는 것이 가장 깨끗했지만 Fig.
Table 5에서 보는 바와 같이 본 논문의 qRT-PCR을 위한 gDNA 추출에 쓰인 논 토양에서는 α-Proteobacteria와 β-Proteobacteria가 토양 1 g 당 105 범위인 8.38 x 105 ,3.42 x 105으로 나타났으며 Actinobacteria, Firmicutes, Bacteriodetes는 106 범위인 7.82 x 106, 2.54 x 106, 6.13 x 106으로서 Proteobacteria보다 10배 정도 높은 수치로 나타났다.
확립된 PCR primer가 서로 다른 phylum에서는 증폭되지 않는 특이성을 확보하기 위하여 다양한 qRT-PCR 반응 조건을 시험하였다. 각 phylum을 대표하는 균주를 주형으로 다양한 annealing 온도 조건에서 PCR을 수행한 결과 Fig. 2A ~ 2F에 나타난 바와 같이 전체 set에서 공통적으로 특이적 증폭이 일어나는 annealing 온도는 60℃이었으며 각 미생물 phylum에 특이적인 primer set을 사용했을 때만 SYBR Green의 발광이 지수적으로 증가하였다. 또 이때의 qRT-PCR에 의해 생성된 증폭산물들은 melting curve의 단일 peak를 나타내었으므로 각각의 미생물 phylum에 특이적인 증폭임을 확인하였다(데이터 미제시).
Table 4에서 보는 바와 같이 lysis buffer method로 추출한 논 토양 gDNA 농도와 순도가 가장 낮았고, Mo Bio PowerSoil kit으로 추출한 과수원 토양 gDNA 순도가 가장 높았다. 논 토양 추출 gDNA는 수치상으로는 skim milk와sodium phosphate 방법으로 뽑는 것이 가장 깨끗했지만 Fig. 1A와 종합적으로 비교해보았을 때 논 토양으로부터 gDNA를 추출할 때 Mo Bio kit을 이용하면 가장 안정성과 재현성이 높고 PCR에 효율적이었다.
2A ~ 2F에 나타난 바와 같이 전체 set에서 공통적으로 특이적 증폭이 일어나는 annealing 온도는 60℃이었으며 각 미생물 phylum에 특이적인 primer set을 사용했을 때만 SYBR Green의 발광이 지수적으로 증가하였다. 또 이때의 qRT-PCR에 의해 생성된 증폭산물들은 melting curve의 단일 peak를 나타내었으므로 각각의 미생물 phylum에 특이적인 증폭임을 확인하였다(데이터 미제시).
실험에 쓰였던 표준 벡터를 토양에 인위적으로 첨가한 후 Mo Bio kit으로 토양 gDNA를 추출 및 정제하고 각각의 primer set로 qRT-PCR을 시행한 결과 인위적으로 특정 표준 벡터를 첨가한 phylum의 실험구에게서만 정량적으로 증가한 감도가 나타났고 다른 경우에서는 모두 원 시료의 범위와 유사한 안정적인 검출량이 나타났다. 본 실험을 통하여 인위적으로 표준 벡터가 첨가된 경우에는 모두 정량적으로 증가된 양이 검출된다는 것이 최종적으로 확인되었다.
66 x 10³으로 나타났다. 실험에 쓰였던 표준 벡터를 토양에 인위적으로 첨가한 후 Mo Bio kit으로 토양 gDNA를 추출 및 정제하고 각각의 primer set로 qRT-PCR을 시행한 결과 인위적으로 특정 표준 벡터를 첨가한 phylum의 실험구에게서만 정량적으로 증가한 감도가 나타났고 다른 경우에서는 모두 원 시료의 범위와 유사한 안정적인 검출량이 나타났다. 본 실험을 통하여 인위적으로 표준 벡터가 첨가된 경우에는 모두 정량적으로 증가된 양이 검출된다는 것이 최종적으로 확인되었다.
2G ~ 2L). 전체 정량선의 R² 값이 0.997 이상으로 신뢰할 수 있으므로 이 정량선과 수식을 이용하여 qRT-PCR에서 얻어진 Ct 값으로 각 토양 미생물을 phylum 별로 정량할 수 있었다.
1). 추출된 total DNA를 0.8% agarose gel에서 전기영동으로 분리한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 시도된 방법 모두에서 전체적으로 논 토양보다 과수원 토양에서 추출한 gDNA의 band가 더 진하였고 순도도 대체로 높은 것으로 나타났다. Lysis buffer method의 경우 오염의 정도로 나타날 수 있는 전기영동상 끌림 현상이 적은 반면에 DNA 절대량이 부족했고, sodium phosphate buffer method와 skim milk method는 상대적으로 추출된 DNA양이 많은 반면에 끌림 현상이 많이 나타났다.
토양 세균 전체를 검출하기 위해서는 primer Eub338과 Eub518을 사용하여 200-bp의 16S rDNA 단편을 증폭하였고 α-proteobacteria에 속하는 세균을 검출하기 위해서는 primer Eub338과 Alf685으로 365-bp의 단편을, β-Proteobacteria에 속하는 세균은 primer Eub338과 Bet680으로 360-bp의 단편을, Actinobacteria에 속하는 세균은 primer Eub518과 Actino235으로 300-bp의 단편을, Firmicutes에 속하는 세균은 Eub5518과 Lgc353으로 180-bp의 단편을, Bacteroidetes에 속하는 세균은 Eub518과 Cfb319으로 220-bp의 단편을, 그리고 전체 토양 진균을 검출하기 위해서는 primer Fu18S1과 Nussu1536을 사용하여 약 340-bp 내외의 18S rDNA 단편을 각각 증폭하였다.

후속연구

논 토양 미생물의 군집 변화 분석을 위하여 본 연구에서 확립된 논 토양 gDNA 추출법과 qRT-PCR 방법을 이용하면 논 토양의 경작 방법, pH, 계절에 따른 변화와 더불어 여러 환경요소에 의한 논 토양 미생물의 변화 관계를 보다 신속하고 유의성 있게 측정할 수 있게 될 것이다. 이러한 연구결과는 논 토양의 미생물 군집 구성과 기능에 대한 정보 획득 건전성을 측정하기 위한 기초 방법으로 확립될 수 있을 것이다.
논 토양 미생물의 군집 변화 분석을 위하여 본 연구에서 확립된 논 토양 gDNA 추출법과 qRT-PCR 방법을 이용하면 논 토양의 경작 방법, pH, 계절에 따른 변화와 더불어 여러 환경요소에 의한 논 토양 미생물의 변화 관계를 보다 신속하고 유의성 있게 측정할 수 있게 될 것이다. 이러한 연구결과는 논 토양의 미생물 군집 구성과 기능에 대한 정보 획득 건전성을 측정하기 위한 기초 방법으로 확립될 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	논 토양으로부터 gDNA를추출할 때 가장 효율적인 방법은 무엇인가?	논 토양 추출 gDNA는 수치상으로는 skim milk와sodium phosphate 방법으로 뽑는 것이 가장 깨끗했지만 Fig. 1A와 종합적으로 비교해보았을 때 논 토양으로부터 gDNA를추출할 때 Mo Bio kit을 이용하면 가장 안정성과 재현성이 높고 PCR에 효율적이었다.
	토양 미생물의 역할은 무엇인가?	, 2002). 유기물 분해, 질소 순환, 식물의 질소 이용에 중요한 역할을 하는 토양 미생물을 이해하는 것은 환경을 유지하고 보존하는데 크게 도움이 되므로 토양 미생물 이해의 중요성이 지속적으로 대두되어 왔다(Paul, 1989).
	quantitative real-time PCR의 검출 원리는 무엇인가?	, 2004; Stubner, 2002). 이 방법은 측정 대상이 되는 특정 핵산을 PCR로 증폭할 때 증폭되는 산물에 정량적으로 비례하는 fluorescence 신호를 발생시켜 각 PCR 사이클 동안의 fluorescence 신호를 감지하여 초기의 측정 대상이었던 핵산의 양을 상대적으로 알아내는 원리에 기초한다(Raeymaekers, 2000). 이러한 qRT-PCR 방법은 다른 여러 가지 토양 미생물 군집의 연구방법 중에서도 매우 독특한 면이 있어서 특정 phylogenetic group에 속하는 토양미생물을 상대적으로 빠르고 정확하게 검출해 낼 수 있다.

참고문헌 (29)

Borneman, J., Hartin, R.J., 2000, PCR primers that amplify fungal rRNA genes from environmental samples, Appl Environ Microbiol. 66, 4356-4360.

상세보기
Buckley, D.H., Schmidt, T.M., 2001, The Structure of Microbial Communities in Soil and the Lasting Impact of Cultivation, Microbial Ecology. 42, 11-21.

상세보기
Christensen, H., Hansen, M., Sorensen, J., 1999, Counting and size classification of active soil bacteria by fluorescence in situ hybridization with an rRNA oligonucleotide probe, Appl Environ Microbiol. 65, 1753-1761.

상세보기
Dandie, C.E., Miller, M.N., Burton, D.L., Zebarth, B.J., Trevors, J.T., Goyer, C., 2007, Nitric oxide reductase-targeted real-time PCR quantification of denitrifier populations in soil, Appl Environ Microbiol. 73, 4250-4258.

상세보기
Fierer, N., Jackson, J.A., Vilgalys, R., Jackson, R.B., 2005, Assessment of soil microbial community structure by use of taxon-specific quantitative PCR assays, Applied and Environmental Microbiology. 71, 4117-4120.

상세보기
Grosskopf, R., Janssen, P.H., Liesack, W., 1998, Diversity and structure of the methanogenic community in anoxic rice paddy soil microcosms as examined by cultivation and direct 16S rRNA gene sequence retrieval, Appl Environ Microbiol. 64, 960-969.

상세보기
Hawksworth, D.L., 2001, The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited, Mycological Research. 105, 1422-1432.

상세보기
Kabir, S., Rajendran, N., Amemiya, T., Itoh, K., 2003, Quantitative measurement of fungal DNA extracted by three different methods using real-time polymerase chain reaction, Journal of Bioscience and Bioengineering. 96, 337-343.

상세보기
Kolb, S., Knief, C., Stubner, S., Conrad, R., 2003, Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA-targeted real-time PCR assays, Applied and Environmental Microbiology. 69, 2423-2429.

상세보기
Lane, D.J., 1991, 16S/23S rRNA sequencing, Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics.
Marchesi, J.R., Sato, T., Weightman, A.J., Martin, T.A., Fry, J.C., Hiom, S.J., Wade, W.G., 1998, Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA, Applied and Environmental Microbiology. 64, 795-799.

상세보기
Muyzer, G., de Waal, E.C., Uitterlinden, A.G., 1993, Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA, Appl Environ Microbiol. 59, 695-700.

상세보기
Nakatsu, C.H., Torsvik, V., Ovreas, L., 2000, Soil Community Analysis Using DGGE of 16S rDNA Polymerase Chain Reaction Products, Soil Sci. Soc. Am. J. 64, 1382-1388.

상세보기
NIAST, 2000, Method of soil and plant analysis . National Institute of Agricultural Science and Technology (NIAST), Suwan, Korea.
Okano, Y., Hristova, K.R., Leutenegger, C.M., Jackson, L.E., Denison, R.F., Gebreyesus, B., Lebauer, D., Scow, K.M., 2004, Application of real-time PCR to study effects of ammonium on population size of ammonia-oxidizing bacteria in soil, Applied and Environmental Microbiology. 70, 1008-1016.

상세보기
Overmann, J., Coolen, M.J.L., Tuschak, C., 1999, Specific detection of different phylogenetic groups of chemocline bacteria based on PCR and denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rRNA gene fragments, Arch Microbiol. 172, 83-94.

상세보기
Paul, E.A., Clark, F.E., 1989, Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, San Diego, CA.
Raeymaekers, L., 2000, Basic principles of quantitative PCR, Molecular Biotechnology. 15, 115-122.

상세보기
Rhee, S.K., Liu, X., Wu, L., Chong, S.C., Wan, X., Zhou, J., 2004, Detection of genes involved in biodegradation and biotransformation in microbial communities by using 50-mer oligonucleotide microarrays, Appl Environ Microbiol. 70, 4303-4317.

상세보기
Rubio, M.B., Hermosa, M.R., Keck, E., Monte, E., 2005, Specific PCR assays for the detection and quantification of DNA from the biocontrol strain Trichoderma harzianum 2413 in soil, Microb Ecol. 49, 25-33.

상세보기
Schollenberger, C.J., 1927, A Rapid Approximate Method for Determining Soil Organic Matter, Soil Science. 24, 65-68.

상세보기
Stach, J.E.M., Maldonado, L.A., Ward, A.C., Goodfellow, M., Bull, A.T., 2003, New primers for the class Actinobacteria: application to marine and terrestrial environments, Environ Microbiol. 5, 828-841.

상세보기
Straatsma, G., Ayer, F., Egli, S., 2001, Species richness, abundance, and phenology of fungal fruit bodies over 21 years in a Swiss forest plot, Mycological Research. 105, 515-523.

상세보기
Stubner, S., 2002, Enumeration of 16S rDNA of Desulfotomaculum lineage 1 in rice field soil by real-time PCR with SybrGreen (TM) detection, J Microbiol Meth. 50, 155-164.

상세보기
Torsvik, V., Ovreas, L., 2002, Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems, Current Opinion in Microbiology. 5, 240-245.

상세보기
Torsvik, V., Ovreas, L., Thingstad, T.F., 2002, Prokaryotic diversity-Magnitude, dynamics, and controlling factors, Science. 296, 1064-1066.

상세보기
Torsvik, V., Salte, K., Sorheim, R., Goksoyr, J., 1990, Comparison of phenotypic diversity and DNA heterogeneity in a population of soil bacteria, Appl Environ Microbiol. 56, 776-781.

상세보기
Vazquez-Marrufo, G., Vazquez-Garciduenas, M.S., Gomez-Luna, B.E., Olalde-Portugal, V., 2002, DNA isolation from forest soil suitable for PCR assays of fungal and plant rRNA genes, Plant Molecular Biology Reporter. 20, 379-390.

상세보기
Yeates, C., Gillings, M.R., Davison, A.D., Altavilla, N., Veal, D.A., 1998, Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification, Biol Proced Online. 1, 40-47.

상세보기

저자의 다른 논문 :

LOADING...

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증