청목노상 뽕잎에서 분리한 Helicobacter pylori 저해물질에 대한 약효평가 Evaluation of Medicinal Activity on Isolated Inhibitory Compounds against Helicobacter pylori from Cheongmoknosang Mulberry Leaves원문보기
뽕잎으로부터 분리한 H. pylori 억제물질이 건강기능식품으로 산업화되기 위하여 이들 유용성분이 생체 내에서 약리성을 가지는지 여부를 검토하였다. 청목노상으로부터 분리한 혼합물은 $200{\mu}g/100{\mu}L$의 농도에서 H. pylori에 대한 저해 clear zone을 형성하여 항균활성을 나타내었고, C57BL/6종 mouse에 H. pylori의 감염을 유도 한 결과 6주 이상이 되어야 H. pylori의 감염이 되는 것을 확인하였으며, 이 때 감염균수는 평균 $8{\times}10^5$ CFU/mL이었다. 경구투여를 통해 청목노상뽕잎에서 추출한 유효성분의 혼합물이 H. pylori 감염에 있어 예방 및 치료 효과를 갖는지 시험한 결과, 절개된 위속의 H. pylori colony 수가 약물투여 군에서 대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다. 마우스의 혈청을 분리하여 immunoglobulin isotype을 측정한 결과, 대조군 보다 IgG1, IgA 등이 높게 생성되는 것이 확인되었고, 시료 혼합물에 의해 항체생성이 증가되어 H. pylori 감염을 억제하는 것으로 판단되었다. 이러한 결과로 뽕잎에서 추출한 유용성분인 caffeic acid, rosemarinic acid와 chlorogenic acid가 H. pylori의 감염에 있어서 예방 또는 치료효과가 있는 것으로 확인되었다. 따라서 H. pylori에 의해 유발되고 감염률이 증가되고 있는 위염, 위궤양, 위암의 예방과 치료가 가능할 것으로 판단되었다.
뽕잎으로부터 분리한 H. pylori 억제물질이 건강기능식품으로 산업화되기 위하여 이들 유용성분이 생체 내에서 약리성을 가지는지 여부를 검토하였다. 청목노상으로부터 분리한 혼합물은 $200{\mu}g/100{\mu}L$의 농도에서 H. pylori에 대한 저해 clear zone을 형성하여 항균활성을 나타내었고, C57BL/6종 mouse에 H. pylori의 감염을 유도 한 결과 6주 이상이 되어야 H. pylori의 감염이 되는 것을 확인하였으며, 이 때 감염균수는 평균 $8{\times}10^5$ CFU/mL이었다. 경구투여를 통해 청목노상뽕잎에서 추출한 유효성분의 혼합물이 H. pylori 감염에 있어 예방 및 치료 효과를 갖는지 시험한 결과, 절개된 위속의 H. pylori colony 수가 약물투여 군에서 대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다. 마우스의 혈청을 분리하여 immunoglobulin isotype을 측정한 결과, 대조군 보다 IgG1, IgA 등이 높게 생성되는 것이 확인되었고, 시료 혼합물에 의해 항체생성이 증가되어 H. pylori 감염을 억제하는 것으로 판단되었다. 이러한 결과로 뽕잎에서 추출한 유용성분인 caffeic acid, rosemarinic acid와 chlorogenic acid가 H. pylori의 감염에 있어서 예방 또는 치료효과가 있는 것으로 확인되었다. 따라서 H. pylori에 의해 유발되고 감염률이 증가되고 있는 위염, 위궤양, 위암의 예방과 치료가 가능할 것으로 판단되었다.
Inhibitory effect of useful components from Cheongmoknosang mulberry leaves extracts against Helicobacter pylori were investigated to develope them to a health functional food. It was confirmed that H. pylori bacterial infection occurred after 6 weeks over in C57BL/6 mouse which was caused the infec...
Inhibitory effect of useful components from Cheongmoknosang mulberry leaves extracts against Helicobacter pylori were investigated to develope them to a health functional food. It was confirmed that H. pylori bacterial infection occurred after 6 weeks over in C57BL/6 mouse which was caused the infection, and the average number of pathogens was $8{\times}10^5$ CFU/mL. Effects of the prevention and cure against H. pylori were tested by the mouth administration with Cheongmoknosang mulberry leaves extracts include the active ingredient, and number of H. pylori colony in stomach of drug groups were decreased more than control group. The result of testing immuno-glogulin isotype from the separated serum from a mouse, IgG1, IgA produced more in administered group, and it is expected to inhibit the H. pylori infection because of increasing antibody production in the mixture. These results suggest that caffeic acid, rosemarinic acid and chlorogenic acid in Cheongmoknosang mulberry leaves extracts are very effective to prevent or cure against H. pylori infection. So the ratio of infection is increasing and it is regarded to be able to prevent and cure the disease like gastritis, gastric ulcer and gastric cancer which are caused by H. pylori.
Inhibitory effect of useful components from Cheongmoknosang mulberry leaves extracts against Helicobacter pylori were investigated to develope them to a health functional food. It was confirmed that H. pylori bacterial infection occurred after 6 weeks over in C57BL/6 mouse which was caused the infection, and the average number of pathogens was $8{\times}10^5$ CFU/mL. Effects of the prevention and cure against H. pylori were tested by the mouth administration with Cheongmoknosang mulberry leaves extracts include the active ingredient, and number of H. pylori colony in stomach of drug groups were decreased more than control group. The result of testing immuno-glogulin isotype from the separated serum from a mouse, IgG1, IgA produced more in administered group, and it is expected to inhibit the H. pylori infection because of increasing antibody production in the mixture. These results suggest that caffeic acid, rosemarinic acid and chlorogenic acid in Cheongmoknosang mulberry leaves extracts are very effective to prevent or cure against H. pylori infection. So the ratio of infection is increasing and it is regarded to be able to prevent and cure the disease like gastritis, gastric ulcer and gastric cancer which are caused by H. pylori.
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문제 정의
pylori에 대한 항균효과는 우수한 것으로 확인되었다. 따라서 in vitro 실험 결과 청목노상 뽕잎을 이용한 H. pylori에 대한 항균제로써 활용이 가능하다고 판단되어 단일물질이 아닌 H. pylori 억제효과가 최대한으로 발현되는 혼합물질에 대한 동물 생체 내에서의 억제 효과를 확인하기 위하여 동물실험을 수행하였다.
본 연구에서는 뽕잎으로부터 분리한 H. pylori 억제물질이 건강기능식품으로 산업화되기 위하여 in vivo 실험에서 이들 유용성분이 생체 내에서 약리성을 가지는지 여부를 검토하여 보았다.
시험 물질의 H. pylori에 대한 예방 효과를 측정하기 위해 시험물질을 경구투여 시킨 마우스의 H. pylori에 대한 감염성을 조사하였다. 6마리의 C57BL/6 mouse를 한 group으로 하여 시험물질을 멸균한 물과 DMSO를 이용하여 용해시키고 2일 간격으로 4번 경구투여 하였으며, 4번째 투여 다음날부터 H.
가설 설정
H. pylori colony count.
H. pylori에 대한 억제물질의 동정.
제안 방법
6마리의 C57BL/6 mouse를 한 group으로 하여 시험물질을 멸균한 물과 DMSO를 이용하여 용해시키고 2일 간격으로 4번 경구투여 하였으며, 4번째 투여 다음날부터 H. pylori 배양액 100 µL(약 1×109 CFU)를 이틀 간격으로 4회 경구투여 하였다.
pylori의 감염을 유도하였다. H. pylori SS1 strain을 109 CFU/0.5 mL의 농도로 Brain Heart Infusion broth에 현탁시키고 이틀 간격으로 3회 경구 투여하였다. 2주경과 후, 각각의 마우스 위를 절개하여 Brain Heart Infusion broth 1 mL에 담구고 homogenize (Nissei AM-8, Nihonseiki Kaisha LTD, Tokyo, Japan)하였다.
H. pylori SS1 감염에 대한 약효 평가 중 시험 물질의 예방 효과 측정.
H. pylori SS1 감염에 대한 약효 평가 중 시험 물질의 치료 효과 측정.
H. pylori SS1 균주를 사용하여 감염 실험을 진행하였으며, H. pylori SS1 감염은 H. pylori 균주를 5% brucella blood agar plate에 도말한 후 2일 동안 37℃, 10% CO2 배양기에서 키운 후 회색빛이 도는 colony를 수거하여 10% FBS를 함유한 brucella broth에서 1×109 CFU/mL까지 배양시켰다.
H. pylori가 배양된 고체배지에 urea reagent 800 µL를 넣고 urease activity가 나타나는 집락을 counting 하였다.
In vitro virulence study는 H. pylori 감염 후 ether를 이용하여 마우스를 마취 시킨 후 개복하여 척추 동맥으로부터 혈액을 추출하여 1.5 mL tube로 옮긴 후 4℃에서 12시간 정치시켜 응고시키고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 상징액의 serum을 얻은 후 immunoglobulin isotype을 측정하였다. 그리고 위를 적출하여 절개한 후 위속에 들어 있는 음식물을 멸균된 D-PBS로 깨끗이 씻어준 후 무게를 측정하였다.
Positive control로는 Park 등[2010]에 의해 Rosa multiflora Thunberg로부터 분리된 H. pylori 억제물질인 protocatecuic acid, chlorogenic acid, quercetin 등을 동량 혼합하여 50~200µg/100 µL의 농도 범위에서 동일하게 실험하였다.
각 시료를 Brain Heart Infusion broth로 10배씩 희석시킨 후, H. pylori 선택 고체배지[columbia blood agar base, 10% bovine calf serum, vancomycin (10 mg/L), trimethoprim (5 mg/L), amphotericin B (5 mg/L)]에 100 µL를 접종하여 37℃, 10% CO2 incubator 에서 5일간 배양하였다.
5 mL tube로 옮긴 후 4℃에서 12시간 정치시켜 응고시키고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 상징액의 serum을 얻은 후 immunoglobulin isotype을 측정하였다. 그리고 위를 적출하여 절개한 후 위속에 들어 있는 음식물을 멸균된 D-PBS로 깨끗이 씻어준 후 무게를 측정하였다. Colony count는 절개된 위를 2 mL tube에 옮긴 후 멸균된 D-PBS 800 µL를 넣어 homogenizer 로 조직을 완벽히 분쇄하였다.
2% Bacto agar를 함유한 Brucella agar plate를 사용하였다. 또한 병원성 관련 실험을 하기 위해 10% fetal bovine serum (FBS)을 함유한 brucella broth를 사용하였다. 1 L 당 28 g의 brucella broth를 첨가하여 121℃에서 15분 동안 멸균하여 사용하였다.
감염은 멸균된 1 mL syringe을 사용하였으며 바늘을 제거한 후 마우스 존대를 끼워 수행하였다. 마우스는 2일 간격으로 4회 접종하였다. 시험물질 투여량은 시험 물질들은 식물 추출물로 많이 알려져 있으나, 혼합하여 사용되어진 예가 없어 처음 급성 독성 시험을 기초로 하여 용량을 설정하였다[Kim 과 Cho, 2011].
배양액을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 pellet을 얻은 후 살균된 phosphate buffered saline (PBS)을 gently pipetting하여 현탁하고, final 접종 volume을 100 µL(약 1×109 CFU)로 하여 마우스에 경구투여 하였다.
Colony count는 절개된 위를 2 mL tube에 옮긴 후 멸균된 D-PBS 800 µL를 넣어 homogenizer 로 조직을 완벽히 분쇄하였다. 분쇄액을 1/10 volume으로 serial dilution법을 이용하여 5% brucella blood agar plate에 도말하였으며, agar plate에 형성된 colony 수를 세어 CFU/g로 환산하여 나타내었다.
뽕잎으로부터 분리한 유용성분의 H. pylori에 대한 예방 효과를 측정하기 위해 C57BL/6 종에 H. pylori의 감염을 유도하였다. H.
시험 물질의 H. pylori에 대한 치료 효과를 측정하기 위해 6마리의 C57BL/6 mouse를 한 group으로 하여 H. pylori 배양액 100 µL(약 1×109 CFU)를 2일 간격으로 4회 경구투여로 감염시켰으며, 2주후, 시험물질을 멸균한 물과 DMSO 를 이용하여 용해시키고 2일 간격으로 4번 경구투여 하였다.
시험 물질의 예방 및 치료효과를 확인하기 위해서 H. pylori를 감염시키기 전과 감염시킨 후에 각각 시험물질을 투여하여 H. pylori colony수를 확인하였다. 그 결과 Fig.
실험재료인 청목노상 잎으로부터 분리한[Cho 등, 2007] caffeic acid, rosamarinic acid, chlorogenic acid를 1:1:1(w/w/w)로 혼합하여 이용하였으며 H. pylori 최적배지 plate(액체배지 50 mL당 special pepton 0.5 g, agar 0.75 g, NaCl 0.25 g, yeast extract 0.25 g, beef extract 0.2 g 및 pyruvic acid 0.025 g)에 H. pylori 균 100 µL 를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper (Φ 8 mm)를 올리고 0.45-µm membrane filter로 제균한 억제물질 혼합액(50~200 µg/100µL)을 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 37℃의 미호기성 조건에서 24시간 동안 incubation한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다.
시험물질 투여량은 시험 물질들은 식물 추출물로 많이 알려져 있으나, 혼합하여 사용되어진 예가 없어 처음 급성 독성 시험을 기초로 하여 용량을 설정하였다[Kim 과 Cho, 2011]. 처음 용량은 급성독성 시험을 실시하였을 때 사망동물이 관찰되지 않는 농도인 4000 mg/kg에서 투여하였으나 사망동물이 관찰됨에 따라 투여량을 2000 mg/kg으로 낮춰서 투여하였다. 단, 식품의약품 안전청의 ‘의약품등의 독성시험 기준’에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에 임의로 설정하여 투여하였다.
대상 데이터
배양용 배지로 Brucella broth와 5% sheep blood, 1.2% Bacto agar를 함유한 Brucella agar plate를 사용하였다. 또한 병원성 관련 실험을 하기 위해 10% fetal bovine serum (FBS)을 함유한 brucella broth를 사용하였다.
실험재료는 뽕잎의 한 종류인 청목노상 뽕잎을 경북상주소재의 잠사시험장에서 수확하여 추출물을 제조하고, Sephadex LH-20과 MCI gel CHP20 등의 column chromatography로 정제한 다음 H. pylori 억제효과가 뛰어난 caffeic acid, rosamarinic acid, chlorogenic acid 등 3가지 물질을 동정하여 동물실험을 위한 시료로 사용하였다[Cho 등, 2007].
특정병원체 부재(SPF, specific pathogen free)인 C57BL/6 마우스(오리엔트바이오(주), 성남, 한국)로 6주령이고 19~20 g의 mouse를 사용하였다.
성능/효과
H. pylori 균의 감염과 억제 약물의 투여에 의한 항체생성 체계의 변화를 관찰하기 위하여 H. pylori 균 감염마우스의 혈청을 분리하여 Immunoglobulin isotype을 측정한 결과, Table 3에서와 같이 약물 투여 후 H. pylori 균을 감염시킨 군에서 IgG1, IgA가 H. pylori 균만을 감염시킨 대조군 보다 높게 생성되는 것이 확인되었으며, 이는 투여된 약물에 의해 항체생성이 증가되어 H. pylori 감염이 억제 되는 것으로 판단되었다.
H. pylori에 의해 위의 무게가 차이가 나는지를 검토하기 위해 부검 후 위를 절취하여 무게를 잰 결과, Table 2에서와 같이 H. pylori에 감염 시킨 후 약물을 투입한 군에서는 0.02 g 정도의 무게증가가 측정되었으며, 약물투입 후 H. pylori을 감염시킨 군에서 0.01 g 정도의 위 무게의 감소가 나타났으나 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다.
pylori colony수를 확인하였다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 H. pylori 균만을 감염시킨 대조군 보다 약물 투여 후 H. pylori 균을 감염시킨 군과 H. pylori균을 감염시킨 후 약물을 투여한 군 모두에서 colony수가 감소하여 억제효과가 관찰되었다. 두 실험군 간의 억제효과를 비교하면 약물 투여 후 H.
pylori균을 감염시킨 후 약물을 투여한 군 모두에서 colony수가 감소하여 억제효과가 관찰되었다. 두 실험군 간의 억제효과를 비교하면 약물 투여 후 H. pylori 균을 감염시킨 군에서 억제효과가 더 우수하여 예방효과가 치료효과 보다 효과적임을 확인하였다.
뽕잎으로부터 분리한 유용성분인 caffeic acid, rosmarinic acid 및 chlorogenic acid의 H. pylori에 대한 예방효과를 측정하기 위해 C57BL/6 mouse종에 H. pylori의 감염을 유도한 결과 Fig. 2와 같이 6주 이상이 되어야 H. pylori의 감염이 되는 것을 확인하였으며, 감염균수는 평균 8×105 CFU/mL이었다.
이상의 결과로 볼 때 청목노상 뽕잎에서 추출한 유용성분인 caffeic acid, rosemarinic acid와 chlorogenic acid가 H. pylori 의 감염에 있어서 예방 또는 치료효과가 있는 것으로 확인되었고, H. pylori에 의해 유발되는 질병인 위염, 위궤양 등의 예방과 치료가 가능할 것으로 판단되었다.
후속연구
pylori의 감염이 되는 것을 확인하였으며, 감염균수는 평균 8×105 CFU/mL이었다. 이러한 감염 동물 모델은 H. pylori에 의한 위 질환 관련 질병 치료제 개발에 있어서 중요한 실험동물 모델이 될 것이다.
pylori에 대한 항균력이 매우 약하게 나타났으나, 3가지 물질을 동량씩 조합하여 혼합 처리하였을 때 억제효과가 최대가 된다고 보고한 바 있다[Cho 등, 2009]. 이러한 결과로 보아 위장 내에서 위궤양을 일으키는 원인균인 H. pylori의 억제제로 산업화에 적용시킬 수 있는 source로 활용이 가능할 것이라 판단되었다. Diker와 Hascelik[1994]는 차 추출물과 Sage의 60% ethanol 추출물에서 H.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
H. pylori이란 무엇인가?
이러한 위궤양의 원인에 대하여 Helicobacter pylori가 궤양관련 질병(위염, 위궤양, 십이지장 등)에 깊게 관여한다고 알려졌으며 최근에는 이 균에 의한 위암과의 연관성이 보고되고 있다[Fridovich, 1989; Halliwell와 Aruoma, 1991]. 나선형 몸통과 편모를 가지고 있는 그람음성 세균인 H. pylori 는 방어인자를 변경시켜 산을 생성함으로 위염과 위궤양을 발생시킨다고 알려져 이 균의 박멸이 임상에서 다양하게 시도되어 왔으며[Iwuoha와 Aina, 1997; Jennings와 Barnett, 1998], 세계 각국의 이 균에 대한 보균율 조사 결과에 의하면 유럽인의 60%, 아시아인의 90% 이상이 감염되어 있고, 특히 위암 사망률이 높은 한국, 일본 그리고 저개발국가 등이 큰 문제점으로 지적되고 있다.
H. pylori 감염에 대한 치료 요법은 무엇인가?
pylori는 인위적으로 제균을 시도하지 않는 한 대부분 평생 감염이 지속된다[Hubue 등, 1999; Higasi, 2000]. 현재 치료 요법으로는 항생제와 기존 약물과의 복합 투여에 의한 방법이 제시 되고 있으며 bismuth (BIS) 제제, proton pump inhibitor (PPi), ranitidine bismuth citrate (RBC) 등을 근간으로 하는 3중 요법과 BIS를 근간으로 하는 3제 요법에 PPi를 추가 하는 4중 요법 등이 사용되고 있으나[Jorge 등, 1991], 치료가 어렵고 항생제의 내성출현, 화학요법제의 약효 한계성이 대두되어 H. pylori 사멸을 위한 예방과 치료를 목적으로 새로운 약물 개발이 절대적으로 필요하다.
H. pylori는 체내에 어떤 영향을 끼치는가?
나선형 몸통과 편모를 가지고 있는 그람음성 세균인 H. pylori 는 방어인자를 변경시켜 산을 생성함으로 위염과 위궤양을 발생시킨다고 알려져 이 균의 박멸이 임상에서 다양하게 시도되어 왔으며[Iwuoha와 Aina, 1997; Jennings와 Barnett, 1998], 세계 각국의 이 균에 대한 보균율 조사 결과에 의하면 유럽인의 60%, 아시아인의 90% 이상이 감염되어 있고, 특히 위암 사망률이 높은 한국, 일본 그리고 저개발국가 등이 큰 문제점으로 지적되고 있다. H.
참고문헌 (15)
Cho YJ, Chun SS, Lee KH, Kim JH, Kwon HJ, An BJ, and Kim MU (2006) Screening of the antimicrobial activity against Helicobacter pylori and antioxidant by extracts from mulberry fruits. J Korean Soc Food Sci Nutr 35, 15-20.
Cho YJ, Ju IS, Kim BO, Kim JH, Lee BG, An BJ, and Choo JW (2007) The antimicrobial activity against Helicobacter pylori and antioxidant effect from the extracts of mulberry leaves. J Korean Soc Appl Biol Chem 50, 334-343.
Cho YJ, Lee KH, Cha WS, Ju IS, Yun DH, An BJ, Lee SH, Kim MU, and Chun SS (2009) Purification and Identification of inhibitory compounds from Cheongmoknosang mulberry leaves on Helicobacter pylori. J Appl Biol Chem 52, 65-69.
Higasi GS (2000) Appraisement of antioxidative activity from vegetables. Jpn J Food Ind 57, 56-64.
Hubue G, Wray V, and Nahrstedt A (1999) Flavonol Oligosaccharides from the Seeds of Aesculus Hippocastanum, Planta Med 65, 638-640.
Iwuoha CI and Aina JO (1997) Effects of steeping condition and germination time on the alpha-amylase activity, phenolics content and malting loss of Nigerian local red and hybrid short kaura sorghum malt. Food Chem 58, 289-295.
Jennings PE and Barnett AH (1998) New approaches to the pathogenesis and treatment of diabetic microangiopathy. Diabetic Med 5, 111-117.
Jorge M, Ricardo DS, Jacques R, Vemonique C, Anni C, and Michel M (1991) Procyanidin dimers and trimers from grape seeds. Phytochemistry 30, 1259-1264.
Ju IS and Cho YJ (2009) Purification and Identification of phenol compounds with inhibitory activity on Helicobacter pylori from Rhododendron mucronulatum Flos. extracts. J Life Sci 19, 1125-1131.
Kim BO and Cho YJ (2011) Evaluation of in vivo safety on inhibitory compounds agianst Helicobacter pylori from Cheongmoknosang mulberry leaves, Korean J Food Preserv 18, in press.
Park KT, Kim JS, Jo BS, An BJ, Chun SS, Kim JH, and Cho YJ (2010) Isolation and identification of inhibitory compounds on Helicobacter pylori from Rosa multiflora Thunberg fruit extracts. J Life Sci 20, 1511-1518.
Yun DH, Cha WS, Lee SH, An BJ, Kim JH, Chun SS, Bae JH, and Cho YJ (2010) Purification and Identification of inhibitory compounds on Helicobacter pylori from Cheongmiknosang callus for biomass. J Life Sci 20, 374-380.
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