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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 선학초 추출물의 미백활성을 멜라닌 인자인 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)를 마우스 흑색 세포종에 처리를 한 뒤, Western blot와 polymerase chain reaction (PCR)을 통하여 검증하고 기능성화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- 24시간이 지난 후 serum free 배지에 α-MSH 10 nM로 처리하고 선학초 열수 및 에탄올 추출물을 각각 1, 5, 10 µg/mL의 농도로 처리 하였다.
- B16F10 세포 내에서의 tyrosinase mRNA 발현을 확인하기 위하여 PCR을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다.
-
Tyrosinase 저해활성 측정.
- 다시 [5% skim milk in tris-buffered saline and tween 20 (TBST)]로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, England)와 반응시켜 X-ray film에 노출 시켰다. X-ray film에 현상되어진 밴드를 Biorad gel doc (Hercules, CA)을 이용하여 정량화 하였다.
- 단백질 20 µg를 10% polyacrylamide를 함유한 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane으로 electroblot 120V에서 1시간을 실시하였다.
- 5, 1, 5, 10 µg/mL)로 처리한 B16F10군에서는 tyrosinase protein의 발현이 처리하지 않는 군보다 감소하였다. 또한 선학초 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 tyrosinase의 mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 처리한 후 48시간 뒤에 PCR로 mRNA 발현량을 측정하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase를 사용하였다.
- 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. 마우스 흑색 세포종(B16F10)을 6 well에 동일한 조건으로 배양한뒤 선학초 추출물을 처리 한 다음 48h 후에 배지를 걷고 세포를 PBS로 세척하였다. Total RNA는 diethyl pyrocarbonate 처리된 saline으로 3번 세척하고 세포를 포집한 다음 trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 분리하였다.
- 선학초 추출물의미백효과를 알아보기 위하여 tyrosinase의 단백질 양을 측정하였다. 마우스 흑색 세포종(B16F10)을 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 선학초 추출물을 처리 한 다음 48시간 후에 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, radioimmunoprecipitation assay buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다. 세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다.
- 본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
- 선학초 열수 및 에탄올 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 확인한 결과 Fig. 2와 같이 대조군과 비교해 0.5, 1, 5, 10 µg/mL 농도에서 모두 80% 이상의 생존율을 나타내었으며, 이하 모든 세포실험에서 10 µg/mL로 진행 하였다.
- 선학초 추출물의 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 처리한 후 48시간 뒤에 tyrosinase protein 발현을 Western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.
- 선학초 추출물의미백효과를 알아보기 위하여 tyrosinase의 단백질 양을 측정하였다. 마우스 흑색 세포종(B16F10)을 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 선학초 추출물을 처리 한 다음 48시간 후에 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, radioimmunoprecipitation assay buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다.
-
세포내 tyrosinase 단백질 발현 양상 측정.
- 시료의 추출은 열수 및 에탄올 추출을 하였다. 열수 추출물의 경우 시료 100 g에 증류수 10배 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올 추출물의 경우 70% 에탄올을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
- 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양 하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (Tecan, Salzburg, Austria)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
- 시료의 추출은 열수 및 에탄올 추출을 하였다. 열수 추출물의 경우 시료 100 g에 증류수 10배 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올 추출물의 경우 70% 에탄올을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물들은 원심분리 및 여과, 농축 후 동결 건조하여 냉동실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
- 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.
- RT의 조건은 42℃에서 1시간 방치하여 cDNA를 제조하고 94℃에서 5분간 방치하여 reverse transcriptase (Promega, Madison, WI)를 불활성화 시켰다. 이어 PCR 조건은 94℃에서 30초(denaturation), 50℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 90초(extension)의 반응을 25~35회 반복 하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.
대상 데이터
- 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma chemical Co. (St Louis, MO)에서 구입하였다. 세포배양을 위해 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.
- 세포배양을 위해 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 hyclone 및 haemacytometer (Marienfeld, Germany)에서 구입하여 사용하였으며 tyrosinase primary antibody와 mouse-anti-goat 등 secondary antibody는 Santacruz (Santacruz, CA)에서 구입하였다.
- 또한 선학초 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 tyrosinase의 mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 처리한 후 48시간 뒤에 PCR로 mRNA 발현량을 측정하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase를 사용하였다. 그 결과 Fig.
이론/모형
- Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등[1986]의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
- 마우스 흑색 세포종(B16F10)을 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 선학초 추출물을 처리 한 다음 48시간 후에 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, radioimmunoprecipitation assay buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다. 세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 20 µg를 10% polyacrylamide를 함유한 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane으로 electroblot 120V에서 1시간을 실시하였다.
- 세포 생존율 측정은 Carmichael 등[1987]의 방법에 따라 측정하였다. 세포주 melanoma (B16F10)를 96 well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.
성능/효과
- 그 결과 Fig. 4에서 보는 바와같이 추출물을 처리하지 않는 B16F10군에서는 각 전사인자의 단백질 발현이 증가하였지만, 선학초 추출물을 농도별(0.5, 1, 5, 10 µg/mL)로 처리한 B16F10군에서는 tyrosinase protein의 발현이 처리하지 않는 군보다 감소하였다.
- 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase를 사용하였다. 그 결과 Fig. 5에서 보는 바와 같이 추출물을 처리하지 않는 B16F10군에서는 각 전사인자의 mRNA 발현이 증가 하였지만, 선학초 추출물을 농도 별로 처리한 군에서는 mRNA 발현이 감소하였다. 이는 Ha[2009]의 절패모 에탄올 추출물이 B16F10 세포에서 멜라닌 관련 단백질이 증가된 tyrosinase의 발현을 농도별 처리 시에도 감소 시키지 않았으며, Na[2009]의 목단피 추출물의 경우 tyrosinase, microphthalmia-associated transcription factor의 발현을 억제시키지 못한 결과와 비교하여 선학초 추출물은 근소하지만 농도 증가 시 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 선학초 열수 추출물의 경우 10 µg/mL의 농도에서 17%의 저해효과를 나타내었으며, 선학초 에탄올 추출물의 경우 농도 의존적으로 저해 효과를 나타내었으며 가장 높은 농도인 10 µg/mL의 농도에서 26%의 저해 효과를 나타내었다.
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