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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 톳 특유의 이취를 경감시키면서 GABA 와 같은 유용성분을 증대시키는 유산균주를 이용하여 발효한 톳 발효 추출액의 상업적인 적용 가능성을 검토하기 위하여 유산균 발효에 의한 톳 발효액의 항산화 활성, 세포 독성 평가 및 항염 활성 변화 등을 조사하였다.
- 이상의 항산화 실험결과를 종합해 볼 때 톳 추출액은 DPPH radical, hydroxyl radical, superoxide radical, alkyl radical과 같은 각종 유해 radical 생성을 억제시키는 효과를 가지고 있으며 그 활성은 유산균 발효에 의해서 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 이에 유산균 발효에 의해서 세포 독성이 생성되지 않는다면 천연 항산화제로써의 이용 가능성이 높을 것으로 판단되어 이후 MTT assay를 이용한 세포 독성에 관한 연구를 진행하였다.
제안 방법
- Band 강도는 densitometry로 정량하였고, 대조구로는 housekeeping 유전자인 β-actin을 이용하였다.
- HepG2 세포를 24 well plate에 5 × 105개를 분주하고, 4시간 뒤에 새 배지로 교체 후 일정농도 (0.5 및 1 mg/mL)의 톳 추출액 및 유산균 톳 발효액을 1시간 동안 전처리 후 lipopolysaccharide (LPS)를 1 μg/mL로 16 시간 동안 처리하였다.
- HepG2 세포를 6well culture plates에 1 × 106cells/well을 분주 후, 24시간 후에 각 well에 일정농도 (0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL)의 유산균 톳 발효액을 24시간 처리하고, 새 배지로 교체 후, 1.0 μg/mL LPS를 24시간동안 처리하였다.
- 세포배양 상층액 100 μL를 96 well에 덜어놓고 Griess 용액 (1% sulfanilamide/0.1% N- (1-naphthyl)- ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H3PO4) 100 μL를 첨가하고 5분 후 ELISA reader (Wallac 1420, USA) 를 통해 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3반복을 원칙으로 하여 평균값을 구하였다.
- 시료 20 μL에 0.3 M DMPO 20 μL, 10 mM FeSO4 20 μL, 10 mM H2O2 20 μL을 혼합한 다음 quartz capillary tube에 옮긴 후 2.5분 후에 ESR spectrometer로 측정하였다.
- 시료 30 μL에 60 μM DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) 용액 30 μL를 혼합 후 반응액을 100 μL quartz capillary tube에 옮겨 2분 후 electron spin resonance (ESR) spectrometer (JES-FA, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)로 측정하였다.
- 추출액 제조에 사용한 톳은 2009년 6월에 채취한 완도산을 구입하여 사용하였다. 열수 추출을 위해 수세, 탈염, 분쇄공정을 거쳐 적당한 크기로 분쇄한 톳 분쇄물에 16배의 물 (w/v)을 첨가하고 80℃에서 30분간 열수 추출하고 20 mesh 망으로 잔사를 제거한 추출액을 실험에 사용하였다 (Song et al.. 2011).
- 우선 24 well에 HepG2 세포 5 × 105개를 분주하고, 4시간 뒤에 새 배지로 교체 후 일정농도 (0.5 및 1 mg/mL)의 톳 추출액 및 유산균 톳 발효액을 24시간 동안 처리하였다.
- 이에 유산균 톳 발효액의 염증관련 cytokine 단백질에 대한 저해 효과를 확인하기 위해 HepG2 cell에 L. brevis LB-20으로 2일째 까지 발효시킨 유산균 톳 발효액과 톳 추출액을 각각 0.5 mg/mL와 1 mg/mL로 처리한 후 24시간 배양한 후 LPS (1μg/mL)를 처리하고 24시간 뒤 염증 관련 cytokine 단백질 발현 변화를 western blotting으로 확인 하였다.
- 5 및 1 mg/mL)의 톳 추출액 및 유산균 톳 발효액을 24시간 동안 처리하였다. 이후, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (0.1 mg/mL)을 각 well에 처리하여 4 시간 배양한 후 형성된 insoluble formazan을 DMSO에 녹이고 ELISA reader (Wallac 1420, USA)를 통해 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 다음의 식으로 계산하였다.
- 처리한 세포는 PRO-PREP buffer (iNtRON, Korea)로 protein을 추출 후, Bradford법 (1976)을 이용하여 정량하였다. 추출 protein은 10% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였고, nitocellulose membrane로 전이시킨 후, 비특이적 결합을 줄이기 위해 5% skim milk (containing 0.1% Tween-20)를 4℃에서 16시간 처리 하였다. 실험에 사용한 primary antibidy는 염증 관련 cytokine 단백질인 TNF-α 및 iNOS antibodies (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA.
- 톳 추출액은 항산화 활성 외에도 항염증에 대한 활성 등이 보고되고 있으며 (Ryu and Kim, 2006), 항염증 실험을 진행하기 위하여 MTT assay에서 세포 독성을 나타내지 않는 농도인 0.5 및 1.0 mg/mL에서 톳 추출액과 유산균 톳 발효액의 항염증 활성을 조사하였다.
- , 1995). 활성산소의 free radical에 대한 보호 효과를 측정하기 위해 xanthine oxidase가 xanthine과 반응하여 uric acid로 전환되고 (Kuppusamy and Zweier, 1989) 이때 생성 되는 O2 (superoxide radical)를 소거하는 효과를 톳 추출액과 유산균 톳 발효액을 대상으로 평가하였다 (Fig. 3). 톳 추출액의 경우에는 각각 0.
대상 데이터
- 2011). L. brevis LB-20 균주를 Lactobacilli MRS Broth (MRS; Difico, USA) 배지에 균주를 24 시간 전 배양 후, 배양액 10%를 톳 추출액에 접종하고 30℃에서 진탕 배양한 톳 발효액을 이용하여 항산화 및 항염증 활성 평가용 시료로 사용하였다.
- 사람의 간암세포 유래 HepG2 세포주는 American Type Clture Collection (Manassas, VA, USA) 로부터 분양받아 사용하였으며 10% inactivated fetal bovine serum과 1% penicillin과 streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)을 배양액으로 37℃, 5% CO2 와 95% air 조건에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 primary antibidy는 염증 관련 cytokine 단백질인 TNF-α 및 iNOS antibodies (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA.)를 사용하였고, secondary antibody 는 peroxidase-conjugated secondary antibodies (1:2000, Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 chemiluminescense로 확인하였다.
- 추출액 제조에 사용한 톳은 2009년 6월에 채취한 완도산을 구입하여 사용하였다. 열수 추출을 위해 수세, 탈염, 분쇄공정을 거쳐 적당한 크기로 분쇄한 톳 분쇄물에 16배의 물 (w/v)을 첨가하고 80℃에서 30분간 열수 추출하고 20 mesh 망으로 잔사를 제거한 추출액을 실험에 사용하였다 (Song et al.
- 톳 추출액의 발효를 위하여 사용된 균주는 전통 발효식품 중 김치에서 분리하여 부경대학교 식품공학과 식품미생물학 연구실에서 보관 중인 유산균들 중에서 톳 특유의 이취를 경감시키면서 GABA 전환 효율이 가장 우수한 Lactobacillus brevis LB-20을 실험에 사용하였다 (Song et al.. 2011). L.
이론/모형
- Alkyl radical (peroxyl radical)은 Hiramoto et al. (1993)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 10 μL의 시료에 각각 10 μL의 PBS (Phosphate buffered saline), 40 mM AAPH (2,2-azobis-(2-amidinopropane)-dihydrochloride), 40 mM POBN α- (4-pyridyl-1- oxide)-N-tert-butylnitrone을 첨가한다.
- DPPH radical 소거능은 Nanjo et al. (1996)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 30 μL에 60 μM DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) 용액 30 μL를 혼합 후 반응액을 100 μL quartz capillary tube에 옮겨 2분 후 electron spin resonance (ESR) spectrometer (JES-FA, JEOL Ltd.
- Hydroxyl radical 소거능은 Rosen et al. (1984)의 방법으로 분석하였다. 시료 20 μL에 0.
- L. brevis를 이용한 톳 추출액과 발효액의 세포독성은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay로 항염활성은 cell based NO assay 및 western blotting analysis 방법에 의하여 측정하였다.
- Superoxide radical은 Guo et al. (1999)에 따라 시료 10 μL에 0.3 mM riboflavin 10 μL, 1.6 mM EDTA 10 μL, 800 mM DMPO 10 μL를 첨가 후 365 nm의 UV lamp에서 1분 동안 조사하였다.
- 유산균 발효에 따른 톳 추출액의 세포 독성에 대해 조사하기 위하여 MTT assay를 이용하여 세포 독성에 관한 연구를 진행하였다 (Fig. 5). MTT assay에 의한 세포 독성 실험 결과, HepG2 세포 생존율은 톳 추출물의 농도가 0.
- 0 μg/mL LPS를 24시간동안 처리하였다. 처리한 세포는 PRO-PREP buffer (iNtRON, Korea)로 protein을 추출 후, Bradford법 (1976)을 이용하여 정량하였다. 추출 protein은 10% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였고, nitocellulose membrane로 전이시킨 후, 비특이적 결합을 줄이기 위해 5% skim milk (containing 0.
성능/효과
- 5). MTT assay에 의한 세포 독성 실험 결과, HepG2 세포 생존율은 톳 추출물의 농도가 0.5 mg/mL의 경우 112.12%, 1 mg/mL의 경우 112.44%이고 유산균 톳 발효액은 동일농도에서 각각 105.47%, 121.37%로 유산균 발효에 의한 세포 독성은 없는 것으로 나타났다. 다시마 추출액의 경우에도 효모발효 후 세포독성에 큰 변화가 없고 세포의 생존율이 다소 증가한다고 보고하고 있으며 이러한 결과는 전통 발효식품에서 분리한 유산균 및 효모 등의 발효미생물이 해조류의 발효 중에 인체에 유해한 독성물질을 생산하지 않는다는 것을 의미한다 (Eom et al.
- 4와 같다. Positive control인 ascorbic acid의 경우 0.5 mg/mL와 1 mg/mL의 농도에서 각각 79.51%, 81.25%의 활성을 나타내었고, 톳 추출액의 경우에는 각각 70.59%, 73.08.%, 유산균 톳 발효액은 동일 농도에서 각각 76.34%, 81.07%로 유산균 발효에 의해 톳 추출액의 alkyl radical 소거 활성이 소폭 증진되는 것을 알 수 있다. 또한 천연 항산화제 중 alkyl radical 소거능이 매우 우수한 것으로 알려진 ascorbic acid와 비교 시 동일농도에서 대등한 alkyl radical 소거능을 나타내었으며 alkyl radical의 소거활성이 뛰어나다고 알려진 chitosan과도 대등한 소거활성을 나타내었다 (Lee et al.
- 7, lane 2). 반면, 톳 추출액과 유산균 톳 발효액을 첨가한 경우에는 염증 관련 cytokine 단백질의 발현이 감소하는 결과를 나타내었으며 특히 0.5 mg/mL 유산균 톳 발효액을 첨가한 경우 가장 우수한 결과를 나타내었다 (Fig. 7, lane 3~6). HepG2 cell에서 LPS에 의해 유도되어진 염증 관련 cytokine 단백질인 TNF-α 와 iNOS의 발현 억제 효과는 결론적으로 유산균 톳 발효액에 의한 NO 생성 억제로 연결되고 이를 통한 항염증 효과가 기대된다.
- , 2010). 본 연구를 통해 세포내 NO 생성 정도를 측정한 결과 유산균 톳 발효액에 의해 NO 생성이 최고 21.95% 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 6). 이에 유산균 톳 발효액의 염증관련 cytokine 단백질에 대한 저해 효과를 확인하기 위해 HepG2 cell에 L.
- 실험결과 positive control인 LPS 단독처리에 의한 염증 관련 cytokine 단백질인 TNF-α와 iNOS의 발현이 증가하였다 (Fig. 7, lane 2).
- 이상의 항산화 실험결과를 종합해 볼 때 톳 추출액은 DPPH radical, hydroxyl radical, superoxide radical, alkyl radical과 같은 각종 유해 radical 생성을 억제시키는 효과를 가지고 있으며 그 활성은 유산균 발효에 의해서 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 이에 유산균 발효에 의해서 세포 독성이 생성되지 않는다면 천연 항산화제로써의 이용 가능성이 높을 것으로 판단되어 이후 MTT assay를 이용한 세포 독성에 관한 연구를 진행하였다.
- 6). 톳 발효 추출액은 positive control인 kojic acid (79.4%, 80.53%) 보다는 NO 생성정도의 억제율은 떨어지는 것으로 나타났지만, 발효액이 정제된 화합물이 아닌 점을 고려한다면 상당한 억제능을 가진 것으로 판단된다. 또한 이러한 결과는 다른 해조류 추출액의 미생물 발효에 의해 항염 활성이 증가하였다는 보고와도 같은 경향을 보여주고 있다 (Eom et al.
- 유산균 톳 발효액의 세포보호효과 (cell protective effect)를 항염증 활성의 지표로 측정되어지는 세포 내 NO (nitric oxide) 는 세포 내 독소인 1 μg/mL LPS 처리로 생성을 유도하였다. 톳 추출액의 경우 0.5 mg/mL 농도에서는 3.80%, 1 mg/mL의 경우에는 14.69.%의 NO 생성 억제 효과를 나타냈으며 유산균 톳 발효액에서는 각각 11.34% 및 21.95%로 유산균 발효에 의해 억제 활성이 증가하였으며 농도 의존적인 경향을 나타내었다 (Fig. 6). 톳 발효 추출액은 positive control인 kojic acid (79.
- 67%로 대조구인 톳 추출액 (비발효액)에 비해 소폭 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, 1 mg/mL 농도의 유산균 톳 발효액의 경우 정제된 화합물이 아님에도 불구하고 positive control 로 사용한 같은 농도의 ascorbic acid 보다 뛰어난 superoxide radical 소거 활성을 나타내고 있어 활성산소를 제어하는 천연 항산화제로서의 가치가 높은 것으로 판단된다.
후속연구
- HepG2 cell에서 LPS에 의해 유도되어진 염증 관련 cytokine 단백질인 TNF-α 와 iNOS의 발현 억제 효과는 결론적으로 유산균 톳 발효액에 의한 NO 생성 억제로 연결되고 이를 통한 항염증 효과가 기대된다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 톳 추출액의 유산균 발효는 독성에는 영향을 미치지 않으면서 톳 추출액의 항산화 활성뿐만 아니라 항염 활성도 증가시키는 것으로 나타났으며 이를 바탕으로 향후 톳의 관능성 및 기능성을 개선시킨 유산균 톳 발효액의 다양한 식품 소재로서의 응용 가능성에 대한 연구를 지속적으로 실시할 예정이다. 또한, 본 연구결과는 특유의 이취와 이미 때문에 원료 자체의 우수성에도 불구하고 다양한 식품소재로서 적용에 한계가 있는 다른 해조류에 대한 미생물 발효공정의 도입 및 이를 응용한 다양한 제품개발에 연결될 것으로 기대된다.
- (2010)도 효모 다시마 발효액의 항산화 활성의 증가에 대해 보고하고 있으나 그 활성 증가는 톳 추출액과 마찬가지로 radical의 종류에 따라 차이가 있다. 이는 해조류들 중에 존재하는 항산화물질의 종류, 함량 및 미생물 발효에 의한 해조류 대사산물 등의 차이에 기인하는 것으로 생각되지만 현재 이에 대한 연구는 진행이 되어 있지 않으며 향후 연구가 필요한 것으로 판단된다.
- 2010). 이러한 연구 결과는 향후 전통 발효식품에서 분리된 미생물을 이용한 다양한 해조류 가공 기술 개발에 연결될 것으로 기대된다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 톳 추출액의 유산균 발효는 독성에는 영향을 미치지 않으면서 톳 추출액의 항산화 활성뿐만 아니라 항염 활성도 증가시키는 것으로 나타났으며 이를 바탕으로 향후 톳의 관능성 및 기능성을 개선시킨 유산균 톳 발효액의 다양한 식품 소재로서의 응용 가능성에 대한 연구를 지속적으로 실시할 예정이다. 또한, 본 연구결과는 특유의 이취와 이미 때문에 원료 자체의 우수성에도 불구하고 다양한 식품소재로서 적용에 한계가 있는 다른 해조류에 대한 미생물 발효공정의 도입 및 이를 응용한 다양한 제품개발에 연결될 것으로 기대된다.
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