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문제 정의
- 따라서 본 연구는 배초향의 항산화 효능을 확인한 후 주름 개선 활성평가를 실시 하였으며, 배초향의 추출을 기존의 단일 추출방법이 아닌 복합 추출 공정으로 발효 전처리 공정법을 실시하여 수율 및 활성증진을 높이고자 하였다 (Park et al., 2004).
- 본 연구는 배초향의 항산화 효능을 본 후 항노화에 대한 효과를 확인하기 위하여, 피부의 탄력 유지 단백질인 collagen생성과 collagen의 생성을 저해하는 효소 MMP-1의 생성량을 측정하여 배초향 추출물의 주름개선에 대한 효과를 확인하였다. 배초향에 발효공정을 도입함으로서 일반 종래 추출법에 비하여 항주름에 대한 효능 증진을 확인하였다.
- 본 실험 결과도 유사한 경향을 보여 배초향의 경우도 항산화능의 증가가 동종의 균의 발효에 의한 배초향 내 acacetin, agastachin 등의 유용성분 함량 증가에 의한 것으로 예상되었으나 유산균 발효에 의한 배초향의 구체적인 유효성분 변화에 대해서 향후 심도 있는 별도의 연구가 필요할 것으로 판단되었다. 이와 같은 배초향의 항주름에 대한 결과로 향장소재로서 배초향의 새로운 가능성을 확인하였다.
제안 방법
- 0 mM의 N-succunyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide을 용해시킨 용액 950 ㎕에 배초향 추출물 50 ㎕를 농도별로 첨가하여 10분 간 상온에 방치하였다. 10분 뒤 마찬가지로 Tris-Cl buffer에 용해시킨 10 ㎍/㎖의 elastase를 50 ㎕만큼 첨가하여 20분 간 상온에서 배양한 후 410 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 저해율을 확인하였다.
- DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) free radical scavenging activity 실험은 Dietz (Dietz et al., 2005)의 방법을 변형하여 실험을 진행하였다.
- MMP-1 생성 실험은 Human MMP-1 ELISA Kit (Ray Biotech, Norcross, GA, USA)를 사용하여 실험을 진행하였다. 실험 전 CCD-986sk 세포에 배초향 추출물을 2일 간 배양시킨 후 배양한 상등액 샘플을 실험에 사용하였다.
- , 2005)의 방법을 변형하여 실험을 진행하였다. 각 공정 별 농도별로 시료 150 ㎕을 첨가 후 methanol로 제조한 0.1 mM DPPH용액 150 ㎕을 혼합하여 상온에서 30분 간 암실에 방치 한 뒤 517 ㎚의 파장에서 흡광도 측정하였다. 측정한 값은 아래의 식으로 구하여 DPPH radical scavenging activity (%)로 나타내었다.
- , 1981; Zou and Cong, 1991). 또한 항산화 효과에 대하여 많은 연구가 되어 (Cho et al., 2011; Jhee and Yang, 1996), 본 연구진은 배초향의 항산화 효과에 착안하여 항노화에 관련 된 주름개선에 대한 배초향의 효능을 확인하였다. 활성산소는 피부 탄력을 유지해 주는 collagen의 생성을 저해 할 뿐만 아니라 (Jang et al.
- 에탄올 추출물은 건조 된 배초향 100 g을 사용하여 80℃의 조건에서 70% 에탄올을 용매로 하여 24시간 추출하였고, 발효 추출물의 경우 건조 된 배초향 100 g을 유산균 Lactobacillus rhamnosus와 Lactobacillus paracasei의 복합균에 MRS broth 배지 (Difco™ Lactobacilli MRS broth, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 7일 동안 37℃, 120 rpm에서 배양하였다. 배양 후 에탄올 추출물과 동일하게 70% 에탄올 추출 후 아로니아 추출액을 감압여과기를 사용하여 여과하였다. 여과 후에 회전식 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
- 배초향 추출물의 주름개선에 대한 효능을 확인하기 위하여, 피부의 탄력을 유지해주는 단백질인 collagen 생성 정도를 확인하였다. Fig.
- 배초향 추출물의 항산화를 평가하고자 DPPH free radical scavenging activity을 확인하였으며, Fig. 1에 측정 된 결과를 표시하였다. DPPH는 파장 517 ㎚에서 최대 흡광도를 나타내고, 환원 시에 517 ㎚에서 흡광도가 감소한다.
- 본 연구는 배초향의 항산화 효능을 본 후 항노화에 대한 효과를 확인하기 위하여, 피부의 탄력 유지 단백질인 collagen생성과 collagen의 생성을 저해하는 효소 MMP-1의 생성량을 측정하여 배초향 추출물의 주름개선에 대한 효과를 확인하였다. 배초향에 발효공정을 도입함으로서 일반 종래 추출법에 비하여 항주름에 대한 효능 증진을 확인하였다. 본 연구와 유사한 유산균으로 발효한 도꼬마리 추출물과 톳 추출물 등의 경우도 발효 후 추출물들의 항산화 활성이 증가된 것으로 나타났으며, 이의 주된 원인은 발효에 의한 천연물 내 유용성분의 함량이 증가한 것으로 확인되었다 (Kang and Kim, 2010; Song et al.
- 본 연구진은 종래 천연물의 추출 공정법인 70% 에탄올 추출을 실시하되, 그에 앞서 상기의 발효 추출 방법의 장점을 활용하고자 유산균을 통한 배초향의 발효 전처리를 실시하였으며, 발효 하지 않은 시료와 발효 한 시료를 사용하여 항 주름활성실험을 실시하여 발효 전 후의 샘플의 주름개선효과에 대한 활성을 비교 분석하여 배초향의 향장 효과에 대해 확인하고 발효 공정을 통하여 주름개선 효과에 대한 증진을 확인하였다.
- 배초향 시료의 추출은 1~3 ㎝로 잘게 잘라진 건조 된 잎과 줄기 부분을 분쇄기를 사용하여 10분간 1300 mesh로 분쇄하였다. 분쇄한 샘플을 에탄올 및 발효 후 에탄올 추출 2가지 추출방법으로 각각 수직 환류냉각기가 설치되어있는 둥근바닥 플라스크를 사용하여 실험을 진행하였다. 에탄올 추출물은 건조 된 배초향 100 g을 사용하여 80℃의 조건에서 70% 에탄올을 용매로 하여 24시간 추출하였고, 발효 추출물의 경우 건조 된 배초향 100 g을 유산균 Lactobacillus rhamnosus와 Lactobacillus paracasei의 복합균에 MRS broth 배지 (Difco™ Lactobacilli MRS broth, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 7일 동안 37℃, 120 rpm에서 배양하였다.
- 그 후 MTT 용액을 제거하고, PBS로 2회 세척해준다. 세척 후 DMSO를 200 ㎕ 만큼 주입한 뒤 30분 동안의 반응을 시키고 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 570 ㎚의 파장에서 흡광도를 확인하여 세포 독성을 평가하였다.
- 세포 실험을 실시하기 전 정상세포에 대한 배초향 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 사용하여 독성평가를 실시하였다. 해당결과는 Fig.
- 배양 후 에탄올 추출물과 동일하게 70% 에탄올 추출 후 아로니아 추출액을 감압여과기를 사용하여 여과하였다. 여과 후에 회전식 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후, 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSHINBioBase, Dongducheon, Korea)에 72시간 동안 동결건조하여 분말로 만들어 실험에 사용하였다.
- 일반 에탄올 추출물에 비해 발효 공정을 거친 에탄올 추출물의 소거활성이더 높긴 하나 그 차이는 크지 않았다. 이를 바탕으로 항산화 효능과 연관지어 항 주름의 효능을 측정 한 연구를 참고하여 (Jang et al., 2013), 배초향 시료를 통한 주름개선효능에 대한 평가를 진행하였다.
- 각 추출물은 농도별 대부분 유의적인 차이를 보이며 독성이 증가하였으나, 이와 같은 독성은 다른 세포독성을 실시한 연구와 비교하면 주름개선효능에 관한 같은 세포로 실시한 청미래덩굴에 대한 연구를 확인하였을 때 (Lee and Lee, 2013), 실험에 쓰인 가장 높은 농도에서 생존률이 약 83%에 달하였다. 이를 참고로 하였을 때, 배초향 추출물의 16.26%의 독성은 주름개선 효능을 확인하는 세포실험에 있어 독성이 높지 않은 것으로 판단되어 세포 실험을 진행하였다.
- 이와 같은 결과는 발효공정이 collagen 생성량 증가에 도움이 되었다고 볼 수 있으며, 앞서 DPPH의 결과에 대한 항산화 활성 증가에 비해 collagen 생성량의 증가가 더욱 뚜렷하게 확인 되었다. 추가적으로 주름생성의 또 다른 원인인 collagen 생성을 저해하는 효소 MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1)의 생성량을 측정하여 배초향 추출물의 항주름 효능을 확인하였다.
- 피부조직에 탄력을 유지해주는 elastin을 저해하여 피부 주름생성에 원인이 되는 elastase 저해율을 측정하여 그 결과를 Fig. 2에 확인하였다. 가장 높은 농도인 0.
대상 데이터
- CCD-986sk 세포를 이용하여 실험을 진행하였으며, collagen 생성 측정은 Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara, Otsu, Japan)제품을 사용하였다. Kit에 준비 된 plate 에 Antibody-POD Conjugate Solution을 100 ㎕ 넣고, 미리 세포에 처리하여 24시간 동안 배양한 배초향 추출물을 농도별로 20 ㎕를 첨가한다.
- HDF (Human dermal fibroblasts)는 CCD-986sk으로 한국 세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 동결 된 것으로 구입하였다. 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- HDF (Human dermal fibroblasts)는 CCD-986sk으로 한국 세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 동결 된 것으로 구입하였다. 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St.
- 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하였다.
- 배초향 추출물의 세포 독성 평가에는 MTT 용액을 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 사용하였다. 세포 독성 평가에 피부섬유아세포 CCD-986sk를 사용하였고, 해당 세포를 1.
- 세포 독성 평가에 피부섬유아세포 CCD-986sk를 사용하였고, 해당 세포를 1.3 × 105 cells/㎖ 농도로 96-well plate에 주입한 뒤 24시간 동안 incubator에서 배양하였다.
- MMP-1 생성 실험은 Human MMP-1 ELISA Kit (Ray Biotech, Norcross, GA, USA)를 사용하여 실험을 진행하였다. 실험 전 CCD-986sk 세포에 배초향 추출물을 2일 간 배양시킨 후 배양한 상등액 샘플을 실험에 사용하였다. 키트에 준비된 plate에 샘플과 standard를 100 ㎕을 주입 한 뒤 상온에서 2시간 30분 동안 배양한다.
- 추출에 쓰인 배초향은 2012년도 10월 경 수확 된 인도네시아 원산지로 음건 된 줄기와 잎을 1~3 ㎝정도 잘게 분쇄 후 추출에 사용하였다. 배초향 시료의 추출은 1~3 ㎝로 잘게 잘라진 건조 된 잎과 줄기 부분을 분쇄기를 사용하여 10분간 1300 mesh로 분쇄하였다.
데이터처리
- 모든 실험의 데이터 통계처리는 3회 반복하였으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 통하여 two-way ANOVA 방법으로 처리하였다. 처리구간의 최소 유의 수준의 차는 p < 0.
이론/모형
- Elastase 저해율 측정은 Kim 등의 방법을 참고하여 실험을 진행하였다 (Kim et al., 2011). 0.
성능/효과
- 3 ㎎/㎖의 농도에서 EE와 생성량이 비슷하였으나 농도가 상승함에 따라 유의적인 차이를 보이며 증가하였다. 1.0 ㎎/㎖ 의 농도에서 EE는 77.4 ng/㎖ 의 collagen이 생성되었으며, FEE는 113.1 ng/㎖의 생성량으로 EE에 비해 증가하였다. 이와 같은 결과는 발효공정이 collagen 생성량 증가에 도움이 되었다고 볼 수 있으며, 앞서 DPPH의 결과에 대한 항산화 활성 증가에 비해 collagen 생성량의 증가가 더욱 뚜렷하게 확인 되었다.
- 3에 표시하였다. 70% 에탄올 배초향 추출물은 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 15.68%의 독성을 보였으며, 발효 공정을 거친 70% 에탄올 추출물은 16.26%의 세포독성으로 유의적인 차이는 없었다. 각 추출물은 농도별 대부분 유의적인 차이를 보이며 독성이 증가하였으나, 이와 같은 독성은 다른 세포독성을 실시한 연구와 비교하면 주름개선효능에 관한 같은 세포로 실시한 청미래덩굴에 대한 연구를 확인하였을 때 (Lee and Lee, 2013), 실험에 쓰인 가장 높은 농도에서 생존률이 약 83%에 달하였다.
- 모든 샘플이 농도가 증가함에 따라 MMP-1의 생성량이 감소하였다. 가장 높은 농도 1.0 ㎎/㎖에서 EE는 1632 pg/㎖의 생성량이 확인되었고, FEE는 1398 pg/㎖로 EE에 비해 유의적인 차이를 보이며 감소한 것을 확인할 수 있었다. 주름개선효능에 대하여 연구 된 바 있는 황철나무등의 연구를 보면 (Shin et al.
- 3%의 저해율을 보였다. 농도가 증가 함에 따라 유의적인 차이를 보이며 저해율이 증가하였으며, 발효 공정을 통한 70% 에탄올 추출물은 23.0%로 확인되었다. 발효 전 보다 발효 후에 elastase 저해율이 소량 증가하였으며, 상기와 같은 배초향 추출물의 저해율은 주름개선효과에 대하여 연구 보고 된 도화 에탄올 추출물과 비교시, 도화 에탄올 추출물의 경우 0.
- 5에 나타내었다. 모든 샘플이 농도가 증가함에 따라 MMP-1의 생성량이 감소하였다. 가장 높은 농도 1.
- 98%로 유의적인 차이를 보이지 않았다. 모든 시료는 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거활성이 증가하는 것을 확인하였다. 일반 에탄올 추출물에 비해 발효 공정을 거친 에탄올 추출물의 소거활성이더 높긴 하나 그 차이는 크지 않았다.
- 1 ㎎/㎖에서 2030 ng/㎖의 MMP-1의 생성량이 측정되었다. 배초향 추출물의 농도가 10배 높으나, 그 생성량의 차이가 20 ~ 30배 이상 낮은 것으로 보아 배초향 추출물에 대한 MMP-1의 생성량 저해 활성을 확인하였고, 항주름 활성에 효능이 있음을 확인하였다. 발효 공정을 실시하였을 때 MMP-1의 생성량이 저해 되어 발효가 주름개선에 도움이 되었다 판단할 수 있다.
- 5 ㎎/㎖의 농도에서 약 13%에 달하는 저해율이 확인되었다 (Lee and An, 2010). 보다 낮은 농도에서 23.0%로 확인 된 배초향 추출물의 저해율을 보아 주름개선에 대한 효능을 확인하였다.
- 22%의 DPPH 자유라디칼 소거능을 보였다. 이와 비교하여 배초향 추출물은 0.03 ㎎/㎖의 낮은 농도에서 70% 에탄올 추출물 (EE)은 28.45%, 발효 에탄올 추출물 (FEE)은 34.81%로 유의적인 차이를 보였으나, 가장 높은 농도인 0.1 ㎎/㎖에서 EE는 62.71%의 소거능을, FEE의 경우에는 62.98%로 유의적인 차이를 보이지 않았다. 모든 시료는 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거활성이 증가하는 것을 확인하였다.
후속연구
- , 2011). 본 실험 결과도 유사한 경향을 보여 배초향의 경우도 항산화능의 증가가 동종의 균의 발효에 의한 배초향 내 acacetin, agastachin 등의 유용성분 함량 증가에 의한 것으로 예상되었으나 유산균 발효에 의한 배초향의 구체적인 유효성분 변화에 대해서 향후 심도 있는 별도의 연구가 필요할 것으로 판단되었다. 이와 같은 배초향의 항주름에 대한 결과로 향장소재로서 배초향의 새로운 가능성을 확인하였다.
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