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문제 정의
- C. destructans의 동정은 분자생물학적 기법을 이용하는 것이 시간과 경비를 절감하는 것에 유리하기 때문에 본 연구에서는 일반적인 형태적 동정과 함께 종 동정을 위해 인삼분리균들의 DNA를 기존에 보고된 종 특이적 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. Hamelin 등(1996)이 식물체로부터 C.
- 따라서 본 연구는 국내 인삼에 발병하는 C. destructans 집단에 대하여 물리적 상처나 환경적 요인, 접종시기에 따른 병원성 차이를 확인하고자 병원성 검정 방법을 달리하여 균의 병원성 분석 시 효율적인 실험 방법을 제시하려고 하였으며, RAPD 분석을 통하여 이들 균주들간 병원성과 지역별 유전적 관계 및 다양성을 분석하고자 하였다.
제안 방법
- 2기압, 15분)한 멸균수 50 ml를 적셔놓은 티슈를 깔고 배양된 균사를 cork borer(직경 5 mm)로 떼어내어 인삼표면에 올려놓은 후 밀봉하여 보관하였다. 20℃항온기에서 4주간 보관한 후 이병정도를 관찰하였다. 또한 상처접종은 배양된 균사를 떼어내어 white tip을 이용하여 인삼에 상처를 내고 고정시켰으며, 위와 동일한 방법으로 이병정도를 관찰하였다.
- 또한 PDA배지에 접종하여 20로 2주일간 배양한 후 PDA 배지에 재접종하였으며, 1주일 간격으로 균총의 형태와 색, 소·대형분생포자, 후벽포자 등의 형성여부 및 그 특징 등을 조사하였다.
- 20℃항온기에서 4주간 보관한 후 이병정도를 관찰하였다. 또한 상처접종은 배양된 균사를 떼어내어 white tip을 이용하여 인삼에 상처를 내고 고정시켰으며, 위와 동일한 방법으로 이병정도를 관찰하였다.
- destructans로 동정된 균주들의 병원성 유 · 무 및 그 차이를 조사하기 위하여 묘삼을 준비하였으며 접종원은 균주를 PDA 배지에 접종 후 20℃에서 14일간 배양하여 사용하였다. 배양된 균사조직을 멸균수 40 ml와 함께 마쇄한 균사현탁액에 묘삼을 침지시킨 후 충남 금산에 위치한 예정지 관리된 포장에 4월에 이식하여 7개월 후 이병주율을 확인하였다.
- 채집된 인삼에서 갈색 병반의 조직을 흐르는 물에 수세하고, 건전부위와 부패부위의 조직을 5 mm 크기로 절단하여 2% NaOCl에 1분간 침지하여 표면소독을 하였고, 멸균수로 2~3회 세척한 다음 여과지 위에 놓아 수분을 제거하였으며, 표면소독이 된 병든 조직을 water agar 또는 PCNBA배지에 올려놓고(Punja, 1997), 15에서 7일간 배양하였다. 배양된 조직에서 자라 나온 균사 중 단균사를 떼어 PDA 배지에 재분리 하였고, 이것을 15에서 10일간 배양한 후 단포자 분리를 실시하였다. 또한 PDA배지에 접종하여 20로 2주일간 배양한 후 PDA 배지에 재접종하였으며, 1주일 간격으로 균총의 형태와 색, 소·대형분생포자, 후벽포자 등의 형성여부 및 그 특징 등을 조사하였다.
- 병든 인삼조직에서 분리된 인삼뿌리썩음병균(C. destructans)의 병원성을 조사하기 위하여 인삼에 무상처 접종 후 20℃항온기에서 4주간 보관하여 관찰하였다. 대부분의 균주들이 병반을 형성하지 못하였지만 CY037, CY080 균주만이 약한 갈색의 인삼뿌리썩음병반을 형성하였다(Table 2).
- 병든 조직에서 분리하여 C. destructans로 동정된 균주들의 병원성 유 · 무 및 그 차이를 조사하기 위하여 묘삼을 준비하였으며 접종원은 균주를 PDA 배지에 접종 후 20℃에서 14일간 배양하여 사용하였다.
- 병원균의 유전적 유연관계를 알아보고자 URP primer 12개와 OPA 10개를 사용하여 RAPD 분석을 실시하였다. RAPD분석을 실시한 결과를 토대로 밴드 양상의 차이가 뚜렷이 나타나는 3개의 primer, URP-01, URP-03, URP-09를 선발하였다.
- 본 실험에 사용되어진 인삼뿌리썩음병균(C. destructans) 집단에 대해 DNA 수준에서의 유전적 특성을 알아보고자 URP-1, URP-3, URP-9를 이용하여 PCR 분석을 하였다 (Fig. 4). 18개의 C.
- RAPD에 의해 얻어진 DNA polymorphism은 밴드 유무에 따라 0과 1로 나열하여 컴퓨터에 입력할 data로 작성하였다. 이 data는 NTSYS program을 이용하여 아래와 같은 공식으로 유사도를 구하였고, 그것을 기반으로 UPGMA에 의한 집괴 분석을 실시하였다(Ver. 1.70, Rohlf, 1992).
- 국내 인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans)은 인삼에 가장 심각한 병을 야기하는 병원균 중의 하나이다. 인삼뿌리썩음병의 효과적인 방제를 위한 기초 연구 자료로 활용하고자 병원성 검정 및 유전적 다양성 분석을 통해 국내 인삼뿌리썩음병균 C. destructans의 종 특성을 분석하였다. 국내 인삼뿌리썩음병반으로부터 분리된 C.
- 채집된 인삼에서 갈색 병반의 조직을 흐르는 물에 수세하고, 건전부위와 부패부위의 조직을 5 mm 크기로 절단하여 2% NaOCl에 1분간 침지하여 표면소독을 하였고, 멸균수로 2~3회 세척한 다음 여과지 위에 놓아 수분을 제거하였으며, 표면소독이 된 병든 조직을 water agar 또는 PCNBA배지에 올려놓고(Punja, 1997), 15에서 7일간 배양하였다. 배양된 조직에서 자라 나온 균사 중 단균사를 떼어 PDA 배지에 재분리 하였고, 이것을 15에서 10일간 배양한 후 단포자 분리를 실시하였다.
대상 데이터
- C. destructans로 동정된 균주들의 병원성을 조사하기 위하여 2% NaOCl로 표면 소독되어진 2년근 인삼을 준비하였으며 접종원은 균주를 PDA 배지에 접종 후 20에서 14일간 배양하여 사용하였다. 밀폐용기를 70% 에탄올로 소독 후에 고압멸균(121℃, 1.
- 병원균의 유전적 유연관계를 알아보고자 URP primer 12개와 OPA 10개를 사용하여 RAPD 분석을 실시하였다. RAPD분석을 실시한 결과를 토대로 밴드 양상의 차이가 뚜렷이 나타나는 3개의 primer, URP-01, URP-03, URP-09를 선발하였다. URP primer set는 주)서린과학의 제품을 사용하였다.
- RAPD분석을 실시한 결과를 토대로 밴드 양상의 차이가 뚜렷이 나타나는 3개의 primer, URP-01, URP-03, URP-09를 선발하였다. URP primer set는 주)서린과학의 제품을 사용하였다.
- 전국의 주요 인삼 포장으로부터 얻어진 인삼뿌리썩음 병반으로부터 18개의 공시균주들을 얻었다(Table 1). 공시 균주들의 C.
이론/모형
- destructans의 동정은 분자생물학적 기법을 이용하는 것이 시간과 경비를 절감하는 것에 유리하기 때문에 본 연구에서는 일반적인 형태적 동정과 함께 종 동정을 위해 인삼분리균들의 DNA를 기존에 보고된 종 특이적 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. Hamelin 등(1996)이 식물체로부터 C. destructans를 검출하기 위해 개발한 종 특이적 primer (ITS1/ITS4 primer set와 Dest1/Dest4 primer set)를 이용한 nested PCR을 수행하여 균주의 동정을 실시하였다. PCR 조건은 ITS1/ITS4 primer set의 경우, 95℃에서 3분간 denaturation 후, 95℃ 35초, 55℃ 1분, 72℃ 2분으로 35cycle 증폭하였으며, 이후 72℃에서 8분간 두어 반응을 완결하였고, Dest1/Dest4 primer set의 경우는 annealing 62℃ 1분, 30cycle 증폭 하였고 다른 조건은 ITS1/ITS4 primer set과 동일하게 반응시켜 gel electrophoresis로 PCR 산물을 확인하였다.
- 공시균주들을 순수분리한 다음 genomic DNA를 분리하기 위해 potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하여 20℃에서 정치 배양하였다. 균사를 수확하여 1.5 ml effendorf tube에 나누고 동결 건조시켜 마쇄한 후, Doyle 등(1990)의 방법을 적용하여 C. destructans의 genomic DNA를 분리하였다.
성능/효과
- 4). 18개의 C. destructans 균주들은 근연종인 C. candidum KCTC16046, C. album KCTC16047, C. heteronema KCTC16048을 비롯한 Fusarium solani CNU-FSPA103, F. oxysporum CNU-FORL18 균주들과는 달리 하나의 그룹을 형성하였으며, 전(2008)의 결과와 마찬가지로 이 그룹 내에서도 2개의 소그룹을 형성하였고, 소그룹 내에서도 유전적 다양성이 존재함을 알 수 있었다. 이들 2개의 소그룹 중 경기도(CY008, CY033, CY075), 충청남도(CY050, CY055), 충청북도(CY037, CY051, CY060, CY066, CY076)의 균주들이 하나의 그룹을 형성하였고, 충청남도 금산(CY006), 충청북도 괴산(CY010, CY036)균주를 제외한 다른 하나의 그룹보다 비교적 병원성이 높게 나타났고 이를 통하여 유연관계 분석을 통한 유전적 변이와 병원성이 관련이 될 것이라 판단되지만, 보다 이들의 세부적인 관계를 확인하기 위해서는 더 많은 균주의 병원성 검정과 다양한 영역의 시퀀스를 통한 분석이 필요할 것이다.
- C. destructans의 동정은 배양시간의 절약과 포자 유도의 어려움 등으로 분자생물학적 기법을 이용하는 것이 동정에 매우 유리하다. 따라서 병든 인삼에서 분리된 공시균주들을 동정하고자 DNA를 수거하여 기존에 C.
- 또한 접종 방법을 달리하여 병원성 검정을 실시했을 때 실내 검정은 실외배양혼합액 접종의 결과와 매우 유사하게 나타나 추후 신속하게 병원성 검정을 위해 매우 유용할 것으로 판단되었다. 국내 인삼뿌리썩음병균(C. destructans)의 RAPD 분석결과 유사한 균류들과 확연히 구별되는 단일 그룹을 형성하였으며, 이 병원균 집단은 두 개의 소그룹으로 크게 나뉘었고 각 그룹내 균주들 간 병원성과의 유전적 차이를 확인할 수 있었다.
- 3; Table 2). 그리고 상대적으로 병원성이 약한 공시균주들에 의해 형성된 이병부위라 할지라도 절개 시 내부로 병반이 진전되어져 있어 C. destructans의 전형적인 뿌리썩음병반을 확인할 수 있었다.
- destructans의 동정은 배양시간의 절약과 포자 유도의 어려움 등으로 분자생물학적 기법을 이용하는 것이 동정에 매우 유리하다. 따라서 병든 인삼에서 분리된 공시균주들을 동정하고자 DNA를 수거하여 기존에 C. destructans 종 특이적 primer로 보고된 Dest1/Dest4 primer(Hamelin et al., 1996) 를 이용한 nested PCR을 수행한 결과 인삼 분리균들로부터 모두 400 bp 크기의 증폭산물들을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 이들 병해 중 대다수가 주로 뿌리를 침해하는 병해로 이들은 기상조건, 지역적 토양오염 정도에 따라 국부적, 집단적으로 발생하여 피해를 주고, 토양의 물리성 악화와 이화학성의 부적합이 복합적으로 발생한다고 하였다(정, 1979; 오, 1981; 유 등, 1993). 따라서 실내 상처접종에 의한 결과가 포장 검정의 병원성이 대다수 유사였으며, 실내 검정은 다른 토양 병원균의 단절과 환경적인 요인을 차단함으로 인하여 보다 정확하고 신속한 C. destructans 의 병원성 검정에 유리하다고 판단된다.
- 인삼에 인공접종 시 균주들간 병원성의 차이도 다양하게 나타나 병원균 집단내 유전적 다양성이 존재할 것으로 예상되었다. 또한 접종 방법을 달리하여 병원성 검정을 실시했을 때 실내 검정은 실외배양혼합액 접종의 결과와 매우 유사하게 나타나 추후 신속하게 병원성 검정을 위해 매우 유용할 것으로 판단되었다. 국내 인삼뿌리썩음병균(C.
- 재배예정지로 관리된 포장에서 수행된 공시균주들의 검정 결과는 실내 병원성 조사 결과와 유사하게 나타났다. 모든 공시균주들은 최소 16.7%의 이병주율을 나타냈고, 18균주 중 4균주를 제외한 균주들은 50%가 넘는 이병주율이 나타나 인삼에 대한 강한 병원성을 확인 할 수 있었다(Fig. 3; Table 2). 그리고 상대적으로 병원성이 약한 공시균주들에 의해 형성된 이병부위라 할지라도 절개 시 내부로 병반이 진전되어져 있어 C.
- destructans는 배지상에서 소형분생포자, 대형분생포자 그리고 후벽포자의 생성유무와 형태적 특징으로 다른 유사균들 및 Cylindrocarpon 속의 다른 종들과 구분되어 진다(Booth, 1966). 본 실험에 사용된 균주들은 모두 소형 분생포자와 세포벽이 두터운 후벽포자가 관찰되었으며 균총색이 다양하게 나타났지만(data not shown), 추후 이들 균주들은 담갈색과 암갈색의 균총을 형성하여 C. destructans로 동정되었다.
- 상처접종을 통한 공시균주들의 2년근 인삼에 대한 병원성을 조사한 결과 공시균주들 간에 접종부위에서 병반의 크기 차이에 따른 상대적인 병원성 차이가 나타남을 확인할 수 있었다(Fig. 2; Table 2).
- destructans 공시 균주들은 배지상에서 다양한 균총의 형태를 나타냈다. 인삼에 인공접종 시 균주들간 병원성의 차이도 다양하게 나타나 병원균 집단내 유전적 다양성이 존재할 것으로 예상되었다. 또한 접종 방법을 달리하여 병원성 검정을 실시했을 때 실내 검정은 실외배양혼합액 접종의 결과와 매우 유사하게 나타나 추후 신속하게 병원성 검정을 위해 매우 유용할 것으로 판단되었다.
후속연구
- oxysporum CNU-FORL18 균주들과는 달리 하나의 그룹을 형성하였으며, 전(2008)의 결과와 마찬가지로 이 그룹 내에서도 2개의 소그룹을 형성하였고, 소그룹 내에서도 유전적 다양성이 존재함을 알 수 있었다. 이들 2개의 소그룹 중 경기도(CY008, CY033, CY075), 충청남도(CY050, CY055), 충청북도(CY037, CY051, CY060, CY066, CY076)의 균주들이 하나의 그룹을 형성하였고, 충청남도 금산(CY006), 충청북도 괴산(CY010, CY036)균주를 제외한 다른 하나의 그룹보다 비교적 병원성이 높게 나타났고 이를 통하여 유연관계 분석을 통한 유전적 변이와 병원성이 관련이 될 것이라 판단되지만, 보다 이들의 세부적인 관계를 확인하기 위해서는 더 많은 균주의 병원성 검정과 다양한 영역의 시퀀스를 통한 분석이 필요할 것이다. 또한 충청남도 괴산의 균주들의 경우, 두 개의 그룹에서 고루 분포하여 C.
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