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문제 정의
- 본 연구에서는 척리 즉 물이끼를 이용한 고부가가치 기능성 소재를 개발하기 위하여 물이끼의 Ethanol 추출물을 이용한 항암활성과 식물화학적 성분연구를 수행 하였다.
- 열대에서부터 극지에 가까운 지역까지 연못, 습지, 늪지, 호숫가 및 습기가 있는 절벽, 벼랑 등지에서 군락을 이루어자란다. 엽맥이 없고 줄기의 표피층에는 서로 연결된 커다란 저장 세포들이 다수 분포되어 있는데, 세포의 표면에 있는 천공을 통해 외부에서 수분이 들어와 몸무게의 20여배까지 수분을 저장할 수 있다.
제안 방법
- 이중 소분획 B33을 methanol (55%)를 용매로 하여 C18 column 으로 정제 하여 황색 분말상 물질 5(22 mg)를 얻었다. B5분획을CH2Cl2:MeOH(1:1)전개용매로 Sephadex LH-20 columnchromatogra-phy를 실시하여 5개의 분획(B51-B55)으로 나누고 이중 B52를 CHCl3:MeOH(3:1)을 용매로 하여 SiO2 column chromatography를 실시하여 9개의 소분획(B521~B529)으로 나누었으며 소분획 B526 분획을 methanol(80%)로 용매로 하여 C18 column으로 정제하여 황색 오일상 물질 6(9 mg)을 얻었고 B10 분획을 MeOH(100%)를 용매로 하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하여 7개의 소분획(B101~B107)으로 나누고 이중 소분획 B105 분획을 methanol(60%)용매로 하여 C18 column으로 정제 하여 황색 분말상 물질 7(16 mg)을 얻었고 Scheme 1에 나타내었다.
- BuOH분획으로 부터는 5, 7, 3',4'-tetra hydroxy flavone(Luteolin), 3-[[3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propenyl]oxy]-1, 4, 5-trihydroxycyclohexane carboxylic acid(Chlorogenic acid)와 quercetin-3-O-rutinoside(Rutin)를 분리하여 IR, UV, Mass, NMR과 이화학적인 확인법으로 그 구조를 규명하였고 Fig. 1에 나타내었다.
- CHCl3분획(1.2 g)을 H2O:MeOH(100:0~0:100)을 유출 용매로 하여 DIAION HP-20 column chromate-graphy를 실시하여 10개의 분획(C1~C10)으로 나누었으며 C2분획을 다시 Hexane:EtOAc(1:1)을 용매로 하여 SiO2 column chromatography 실시하여 9개의 소분획(C21~C29)으로 나누었다. 이중 소분획 C22를 methanol(100%)을 용매로 하여 Sephadex LH-20로 정제 하여 백색의 분말상 물질 1(17 mg)을 얻었다.
- CHCl3분획으로부터 2-chromenone(Coumarin)을 분리하였고 EtOAc 분획에서3, 4-Dihydroxy-cinnamic acid(Caffeic acid), 3, 3', 4', 5, 7-pentahydroxy-2phenylchromen-4-one(quercetin)과 kaemperol-3-O-β-Dglucopy–ranoside(astragalin)을 분리 하였다.
- 이중 소분획 C22를 methanol(100%)을 용매로 하여 Sephadex LH-20로 정제 하여 백색의 분말상 물질 1(17 mg)을 얻었다. EtOAc분획(1 g)을 CHCl3:MeOH:H2O(6:4:1)전개 용매로 하여 SiO2 columnchromato-graphy를 실시하여 15개(E1~E15) 소분획을 얻은 후, 소분획 E6를 농축하여 이를 methanol(100%)을 용매로 하여 Sephdaex LH-20을 실시한 후 다시 CHCl3:MeOH: H2O(9:4:1) 전개 용매로 SiO2 column chromatography를 실시, 정제하여 백색의 분말상 물질 2(12 mg)를 얻었다. E8~10을 농축하여 이들을 MeOH:H2O(9:1) 용매로 재결정하여 황색 침상결정의 물질 3(15 mg)을 얻었고, E12 분획을 농축 후 CH2Cl2:MeOH(1:1)를 전개용매로 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하고 다시 농축 후 CHCl3:MeOH(5:1)을 용매로 하여 SiO2 column으로 정제하여 황색 침상 결정 물질 4(19 mg)를 얻었다.
- 즉, 건조된 물이끼의 Ethanol 추출물로부터 다양한 극성용매를 이용한 분획과 반복적인 컬럼크로마토그래피 실험법을 실시하여 7종의 화합물을 분리, 정제하여 이화학적 성상 과 기기분석자료를 통한 구조를 규명 하였으며. In viro assay를 통한 3종의 암세포주에 대한 항암활성을 측정하였다.
- E8~10을 농축하여 이들을 MeOH:H2O(9:1) 용매로 재결정하여 황색 침상결정의 물질 3(15 mg)을 얻었고, E12 분획을 농축 후 CH2Cl2:MeOH(1:1)를 전개용매로 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하고 다시 농축 후 CHCl3:MeOH(5:1)을 용매로 하여 SiO2 column으로 정제하여 황색 침상 결정 물질 4(19 mg)를 얻었다. n-butanol분획(1.3 g)을 농축 후 H2O:MeOH(100:0~0:100)을 유출 용매로 하여 DIAION HP-20 column chromatography를 실시하여 12개의 분획(B1~B12)으로 나누었으며, 그 중 B3 분획을 다시 CHCl3:MeOH:H2O(8:2:1)을 용매로 하여 SiO2 column chromatography를 실시하여 7개의 소분획(B31~B37)으로 나누었다. 이중 소분획 B33을 methanol (55%)를 용매로 하여 C18 column 으로 정제 하여 황색 분말상 물질 5(22 mg)를 얻었다.
- 또한, 총 27개의 carbon signal 중 당의 signal을 제외하고 총 15개의 carbon signal이 관찰 되었으며, 이는 flavonoid의 골격을 나타내는 signal로 추정하였으며, δ177.6에서 C-4의 carbonyl기를 관찰할 수 있었다.
- 위와 같이 물이끼의 전초에서 물질을 분리⋅동정하기 위해 EtOH추출물을 CHCl3, EtOAc 및 BuOH로 용매 분획하였다.
- 융점측정은 Elctrothermal digital melting point apparatus를 사용하여 측정하였고. NMR은 Varian Unity Inova 500 spectrophotometer를 사용하였다.
- 3종의 암세포주(A549, HeLa, SK-OV-3)에 대하여 세포독성연구를 수행해 본 결과 폐암세포주인 A549에서 유의성 있는 결과를 보였다. 이 결과는 난치성 질환인 암을 치료하려는 목적 의약품 보다는 Chemopreventive agent로서의 예방 의학적 기능성 소재로 충분한 가치가 있음이 사료 되어지기에 식물화학적 성분연구를 실시하여 7종의 화합물(Comp.1 : Coumarin, Comp.2 : Caffeic acid, Comp.3 : Quercetin, Comp.4 : Astragalin, Comp.5 : Luteolin, Comp.6 : Chlorogenic acid, Comp.7 : Rutin)를 분리하여 구조동정 하였다.
- 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7은 본 식물에서는 처음 분리되었으나 이미 이종의 식물에서는 보고 되어진 성분들이다. 이들 성분의 구조는 I.R, U.V, 1H-NMR, 13C-NMR 및 MS 스펙트럼 자료를 문헌과 비교하여 구조를 결정하였다.
- 추출액을 감압 농축하여 EtOH 엑기스 8 g을 얻었다. 이를 chloroform(CHCl3), ethylacetate(EtOAc), n-butanol(BuOH)로 용매 분획하여 chloroform(1.2 g), ethyl acetate(1 g), n-butanol(1.3 g) 분획으로부터 화합물 7종을 분리 하였다.
- 7(C-2)에는 carbonyl signal을 관찰할 수 있었다. 이상의 자료로부터 화합물 1은 2-chromenone(coumarin)으로 구조를 추정하였고 기존의 문헌을 비교하여 구조를 확인 동정하였다(Jung et al.,1978; Mukherjee et al., 1998; Moon and Zee, 1999; Lee et al., 2002; Min, 2006).
- 0(C-2)에서는 olefinic carbon signal을 관찰할 수 있었다. 이상의 자료로부터 화합물 2는 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid(caffeic aid)로 구조를 추정하였고 기존의 문헌을 비교하여 구조를 확인 동정하였다(Park, 1973; Kim, 1975; Kwon et al., 2000; Lee, 2002; Jung et al., 2003).
- 이상의 자료로부터 화합물 5는 5, 7, 3', 4'-tetra hydroxy flavone(luteolin)으로 구조를 추정하였고 기존의 문헌을 비교하여 구조를 확인 동정하였다(Kim and Choi, 1993; Kim et al., 2005).
- 6에서 C-4의 carbonyl기를 관찰할 수 있었다. 이상의 자료로부터 화합물 7은 quercetin-3-O-rutinoside(rutin)로 구조를 추정하였고 기존의 문헌을 비교하여 구조를 동정하였다(Nam et al., 1975; Agrawal, 1989).
- 이에 저자 등은 국내에 자생하는 이끼에 대한 체계적인 연구를 수행하던 중에 물이끼에 대한 식물화학적 연구의 필요성을 인식하여 물이끼의 성분 및 생리활성연구를 수행 하였다. 즉, 건조된 물이끼의 Ethanol 추출물로부터 다양한 극성용매를 이용한 분획과 반복적인 컬럼크로마토그래피 실험법을 실시하여 7종의 화합물을 분리, 정제하여 이화학적 성상 과 기기분석자료를 통한 구조를 규명 하였으며. In viro assay를 통한 3종의 암세포주에 대한 항암활성을 측정하였다.
- 항암활성을 측정하기 위해서 96 well에 5×104 cells/ml로 100 μl씩 세포를 동일하게 분주하고 24시간 동안 배양한 후 여러 농도의 시료 용액을 배지에 희석하여 첨가 하였다.
- 화합물 3의 구조는 IR, UV 스펙트럼, 1H-NMR, 13C-NMR 스펙트럼 자료를 문헌치와 비교하여 3, 3', 4', 5, 7-pentahydroxy-2-phenylchromen-4-one(quercetin)으로 구조를 확정하였다(Lee et al., 2003; Huong et al., 2004; Park et al., 2004).
- 화합물 4의 구조는 Mg/HCl and Zn/HCl test와 U.V 스펙트럼, 1H-NMR,13C-NMR 스펙트럼 자료를 문헌치와 비교하여 kaempferol-3-O-β-D-gluco Pyranoside(astragalin)로 구조를 확정하였다(Lee et al., 1994; Kim et al.,1996; Won et al., 2004).
- 는 211~213℃이며 IR spectrum에서는 3470-3353(OH), 2927, 1727(>C=O), 1601(aromatic), 1458(cycloalkane), 1189(phenol)강한 흡수대를 확인할 수 있었고 UV spectrum에서는 216, 242, 300(sh), 326: 흡수대를 관찰할 수 있었다. 화합물 6의 I.R, U.V 스펙트럼, 1H-NMR ,13C-NMR 스펙트럼 자료를 문헌치와 비교하여 3-[[3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propenyl]oxy]-1,4,5-Trihydroxyc-yclohe xanecarbox-ylic acid(chlorogenic acid)로 구조를 확정하였다(Park and Jung, 1975; Chung et al., 1978; Lee, 1998; Kim et al., 2005).
대상 데이터
- EI-MS spectrum 은 JMS–700(Jeol, Japan)와 FAB-MS는 VG70-VSEG(VG Analytical, UK)를 사용 측정하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Merck)와 LiChroprep C18(Merck)를 사용하였고, molecular sieve column chromatography용 packing 물질은Sephadex LH-20(GE)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 precoated plate(Art.
- EI-MS spectrum 은 JMS–700(Jeol, Japan)와 FAB-MS는 VG70-VSEG(VG Analytical, UK)를 사용 측정하였다.
- HeLa(human cervical adenocarcinoma), A549(human lung adenocarcinoma), SK-OV-3(human ovarian adenocarcinoma)는 한국세포주은행에서 구입 하였다. 이들 세포들은 열처리 불활성화 된 10% FBS 및 penicillin(100 U/ml) and streptomycin sulfate(100 mg/ml)이 포함된 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2 조건을 유지하여 배양했다.
- 융점측정은 Elctrothermal digital melting point apparatus를 사용하여 측정하였고. NMR은 Varian Unity Inova 500 spectrophotometer를 사용하였다. EI-MS spectrum 은 JMS–700(Jeol, Japan)와 FAB-MS는 VG70-VSEG(VG Analytical, UK)를 사용 측정하였다.
- Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Merck)와 LiChroprep C18(Merck)를 사용하였고, molecular sieve column chromatography용 packing 물질은Sephadex LH-20(GE)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 precoated plate(Art.552, Merck)를 사용하였고, TLC 발색시약은 10% H2SO4을 사용하였으며 UV 254 nm, 365 nm detction을 병행 하였다.
- 물이끼(Sphagnum palustre)는 2007년 7월 강원도 평창군 대관령면에 소재한 선자령 일대(해발 800 m)에서 채집하여 농촌진흥청 국립식량과학원 고령지농업연구센터 유전자원 시험포장내 생육된 물이끼와 정확히 비교감정 후 사용하였고, 식물표본은 고령지 농업연구센터 유기분석실험실(표본번호: NIHA-005)에 보관되어 있다.
데이터처리
- 실험치의 값은 3번의 독립된 실험을 시행하여 mean ±S.D.로 나타냈으며 분석은 Student’s t-test로 그 유의성을 나타내었다.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum에서 당으로부터 기인하는 총 12개의 carbon signal {δ101.4(Glc-1), 74.2(Glc-2), 76.6(Glc-3), 70.1(Glc-4), 76.1(Glc-5), 67.1(Glc-6), 101.0(Rha-1), 70.5(Rha-2), 70.7(Rha-2), 72.0(Rha-3), 68.4(Rha-4), 17.8(Rha-6)}을 통해 2개의 당이 결합하고 있음을 확인할 수 있었고, 특히, glucose의 C-6 위치에 당이 결합되어 있음을 추측할 수 있었다.
- 3종의 암세포주(A549, HeLa, SK-OV-3)에 대하여 세포독성연구를 수행해 본 결과 폐암세포주인 A549에서 유의성 있는 결과를 보였다. 이 결과는 난치성 질환인 암을 치료하려는 목적 의약품 보다는 Chemopreventive agent로서의 예방 의학적 기능성 소재로 충분한 가치가 있음이 사료 되어지기에 식물화학적 성분연구를 실시하여 7종의 화합물(Comp.
- 화합물 2 는 백색 분말상의 물질로써 FeCl3에서 양성반응을 보였고 m.p.는 222~223℃이며, MS spectrum에서는 m/z 180에서 molecular ion peak를 관찰할 수 있었고 IR spectrum에서는 3450(OH), 1650(C=O)등에서 강한 흡수대를 관찰할 수 있었다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 δ7.
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