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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 인삼류 생약의 추출조건에 따른 사포닌의 종류 및 함량을 비교분석함으로서 홍삼특이 사포닌 Rg3, Rh1 및 Rh2의 수득율을 높여 기능성 천연제제를 개발하고, compound 48/80으로 유도되는 히스타민 유리 억제에 미치는 인삼 추출물들의 효능을 분석하고자 하였다. 이를 위해 인삼 추출물의 세포 독성을 랫트 비만세포에서 농도별로 비교 검증하였고, 세포 독성을 유발하지 않는 농도를 반응조건을 확립하고 히스타민 유리를 조절하는 기능을 검증하였다.
- 이를 위해 인삼 추출물의 세포 독성을 랫트 비만세포에서 농도별로 비교 검증하였고, 세포 독성을 유발하지 않는 농도를 반응조건을 확립하고 히스타민 유리를 조절하는 기능을 검증하였다. 또한 이러한 결과를 바탕으로 고려인삼의 추출 방법에 따라 특성화된 항아토피 특이성분을 활용한 아토피 관리 제품개발 등의 기초자료로 활용하고자 한다.
제안 방법
- 랫트의 복강에서 분리한 비만세포에 대표적인 탈과립 유도제인 compound 48/40을 처리함으로서, 알러지 반응의 원인 물질인 히스타민 유리를 유도하는 모델을 이용하여 인삼추출물의 억제 효과를 검증하였다. 먼저 인삼추출물의 랫트 비만세포에 대한 단기 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다(Fig.
- 랫트의 복강에서 분리한 비만세포에 대표적인 탈과립 유도제인 compound 48/40을 처리함으로서, 알러지 반응의 원인 물질인 히스타민 유리를 유도하는 모델을 이용하여 인삼추출물의 억제 효과를 검증하였다. 먼저 인삼추출물의 랫트 비만세포에 대한 단기 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다(Fig. 1). 인삼추출물을 랫트 비만세포를 배양한 96 well plate에 0.
- 이에 인삼추출물이 compound 48/80에 의한 랫트 비만세포의 히스타민 유리를 억제하는 효과를 검증하였다. 상기의 단기 독성 시험 결과를 바탕으로 80% 이상의 세포 생존율이 유지되는 0.5 mg/ml 의 인삼추출물 또는 생리식염수를 전처리한 시험군에 compound 48/80을 처리하고 무처리군을 대조군으로 하여 유리된 히스타민의 양을 측정하였다(Fig. 2). 그 결과 compound 48/80 단독 처리군은 대조군에 비해 30% 가량의 히스타민 유리의 증가를 확인하였다.
- 수삼 추출물에서 홍삼특이 사포닌 성분의 함량을 증대시키고자 추출온도 및 시간에 따른 사포닌 성분별 함량 변화를 조사하였다. 수삼을 85℃에서 48시간 추출 시 총 사포닌 함량이 23.
- 수삼 추출물에서 홍삼특이 사포닌 성분의 함량을 증대시키고자 추출온도 및 시간에 따른 사포닌 성분별 함량 변화를 조사하였다. 수삼을 85℃에서 48시간 추출 시 총 사포닌 함량이 23.5 mg/g(D.W.)로 가장 많았으며, 본 조건에서 추출한 인삼추출물의 항알러지 기능성을 검토하고자 랫트 비만세포에서 compound 48/80로 유도된 히스타민 유리 작용을 억제하는 인삼추출물의 효능을 분석하였다. 인삼추출물의 비만세포에 대한 세포 독성 시험 결과 각 추출물은 수시간 노출시 높은 세포 생존율을 보이고 있었고 비교적 고농도인 0.
- 시료는 1,500×rpm으로 3분간 원심분리한 후 각 반응군에서 동일한 용량의 상청액을 취하여 Speed Vac(Servant, USA)에서 저온 건조시킨 후 100 μl의 PBS로 재용해하여 이용하였으며, 정량키트의 공급자 매뉴얼에 기록된 방법에 의거하여 실험을 실시하였다.
- 6 mm, Alltech)을 사용하였다. 이 동상은 H2O(Solvent A)와 CH3CN(Solvent B)을 사용하여 solvent B의 비율을 17%에서 20%(10분), 32%(15분), 45%(30분), 100%(48분)으로 순차적으로 변화시켜 주고 마지막으로 다시 17%(58분)로 조절하였다. 1회당 injection volume은 10 μl이며, 전개온도는 실온이었고 유속은 분당 0.
- 의 수득율을 높여 기능성 천연제제를 개발하고, compound 48/80으로 유도되는 히스타민 유리 억제에 미치는 인삼 추출물들의 효능을 분석하고자 하였다. 이를 위해 인삼 추출물의 세포 독성을 랫트 비만세포에서 농도별로 비교 검증하였고, 세포 독성을 유발하지 않는 농도를 반응조건을 확립하고 히스타민 유리를 조절하는 기능을 검증하였다. 또한 이러한 결과를 바탕으로 고려인삼의 추출 방법에 따라 특성화된 항아토피 특이성분을 활용한 아토피 관리 제품개발 등의 기초자료로 활용하고자 한다.
- Compound 48/80은 비만세포 및 여러 조직에서 히스타민을 유리시키는 대표적인 물질로서 매우 낮은 농도 범위에서도 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Rothschild, 1970). 이에 인삼추출물이 compound 48/80에 의한 랫트 비만세포의 히스타민 유리를 억제하는 효과를 검증하였다. 상기의 단기 독성 시험 결과를 바탕으로 80% 이상의 세포 생존율이 유지되는 0.
- 인삼 추출 방법에 따른 홍삼 특이 사포닌 함량을 향상시키는 조건을 확립하고자, 수삼을 85℃와 95℃조건에서 각각 증류수로 추출하였으며, 이때 추출시간을 달리하여 추출 효율을 조사하였다. 추출 온도와 추출 시간에 따른 최종 추출물의 ginsenosides 함량을 조사한 결과는 Table 1과 Table 2에 나타내었다.
- 인삼 추출물의 랫트 비만세포의 히스타민 유리에 미치는 영향을 확인하기 위해 각 추출물을 15분간 전처리하고 Compound 48/80(6 μg/ml)으로 15분간 자극하였다.
- 추출온도 및 시간에 따른 홍삼 특이 사포닌 변화를 조사하기 위해 수삼(6년근, 충남 금산)을 수세한 후 실내에서 30분간 방치하여 물기를 제거하였다. 추출은 증류수를 추출용매로 하여 85℃ 및 95℃에서 24시간, 48시간씩 각각 하였으며, 여과 후 감압 농축하여 분석용 엑스를 조제하였다.
- 추출온도 및 시간에 따른 홍삼 특이 사포닌 변화를 조사하기 위해 수삼(6년근, 충남 금산)을 수세한 후 실내에서 30분간 방치하여 물기를 제거하였다. 추출은 증류수를 추출용매로 하여 85℃ 및 95℃에서 24시간, 48시간씩 각각 하였으며, 여과 후 감압 농축하여 분석용 엑스를 조제하였다.
- 8 ml 이었다. 크로마토그램은 ELSD 검출기(Alltech)를 이용하여 작성하였다. ginseonside 표준품(Rg1, Rf, Re, Rd, Rc, Rb2, Rb1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2)은 한국인삼연초연구원(현 KT&G 중앙연구원)에서 분양 받은 것을 사용하였다.
- 회수된 세포 부유액을 22.3%(w/v) Histodenz(Sigma-Aldrich, USA)-MEM medium의 상층에 조심스럽게 중첩시키고 600×g, 냉장 조건에서 15분간 원심분리를 실시하였다.
대상 데이터
- 200-250 g 웅성 Sprague Dawley Rat 는 오리엔트 바이오(성남, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 동물실은 12시간 간격으로 점등과 소등을 반복하였으며 물과 사료는 자유스럽게 섭취할 수 있도록 하였다.
- ginseonside 표준품(Rg1, Rf, Re, Rd, Rc, Rb2, Rb1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2)은 한국인삼연초연구원(현 KT&G 중앙연구원)에서 분양 받은 것을 사용하였다.
- 3%(w/v) Histodenz(Sigma-Aldrich, USA)-MEM medium의 상층에 조심스럽게 중첩시키고 600×g, 냉장 조건에서 15분간 원심분리를 실시하였다. 침전된 세포는 회수하여 동일한 medium 에서 부유시켜 밀리리터당 10-6개 수준으로 희석하여 실험에 사용하였다(Yamada et al., 2006).
데이터처리
- 모든 실험 결과는 Mean ± S.E.M으로 표시하였으며 student’s t-test를 실시하여 유의성을 검증하였고 오차값(p value)이 0.05 이하인 것을 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- Mast cells(3×104 cell/ml, 100 μl) were incubated for 24 hr in CO2 incubator and then treated 200 μl of ginseng extracts with indicated dose for 1 hr. Cytotoxicity were measured by MTT assay. Data are shown as the means ± S.
- 랫트의 복강 비만세포는 Kim 등(1998)의 방법을 이용하여 분리하였다. 비만세포의 분리 과정을 간단히 설명하면 다음과 같다.
- 세포 독성에 의한 세포 생존율을 정량하기 위하여 MTT assay를 시행하였다(Mosmann, 1983). 각 세포를 96 well plate에 well 당 2×104 cell/ml의 밀도로 100 μl씩 분주하고 12시간동안 배양한 후 인삼 추출물을 시간별로 처리한 후 medium으로 2회 세척하였다.
- 인삼 추출물의 랫트 비만세포의 히스타민 유리에 미치는 영향을 확인하기 위해 각 추출물을 15분간 전처리하고 Compound 48/80(6 μg/ml)으로 15분간 자극하였다. 세포배양 상청액중에 있는 히스타민 정량은 경쟁적 면역흡착 정량법(Competitive-Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay: ELISA)법을 이용하였다(ALPCO Diagnostics, NH, USA). 시료는 1,500×rpm으로 3분간 원심분리한 후 각 반응군에서 동일한 용량의 상청액을 취하여 Speed Vac(Servant, USA)에서 저온 건조시킨 후 100 μl의 PBS로 재용해하여 이용하였으며, 정량키트의 공급자 매뉴얼에 기록된 방법에 의거하여 실험을 실시하였다.
- 온도별 처리된 각각의 시료들은 ginsenosides의 함량 분석을 위해 일정량씩 취하여 수포화 n-butanol 추출법인 Ando 등(1971)의 방법에 따라서 추출하였다. 검체시료 7.
성능/효과
- 추출 온도와 추출 시간에 따른 최종 추출물의 ginsenosides 함량을 조사한 결과는 Table 1과 Table 2에 나타내었다. 85℃조건에서 추출한 추출액에서의 ginsenoside 함량을 비교하였을 때, Rh2, Rh1, Rg3 함량이 48시간 추출 시 1.12, 3.93, 4.75 mg/g(D.W.)으로 24시간 추출조건보다 많았으며, total ginsenosides 함량 또한 48시간 추출조건에서 23.5 mg/g(D.W.)으로 가장 많 았다(Table 1). 동일한 시료를 95℃에서 추출하는 방법을 이용하였을 때에도 48시간 추출 조건이 24시간 추출 조건보다 효과적이었는데, total ginsenosides 함량이 21.
- 2). 그 결과 compound 48/80 단독 처리군은 대조군에 비해 30% 가량의 히스타민 유리의 증가를 확인하였다. 이에 반해 인삼추출물을 전처리 한 경우 compound 48/80을 처리하였을 때 히스타민의 유리가 유의하게 감소되어 대조군과 유사한 결과를 보였다.
- )으로 가장 많 았다(Table 1). 동일한 시료를 95℃에서 추출하는 방법을 이용하였을 때에도 48시간 추출 조건이 24시간 추출 조건보다 효과적이었는데, total ginsenosides 함량이 21.06 mg/g(D.W.)을 나타내었다. 추출온도에 따른 개별 ginsenoside 함량변화를 보면 Rg3의 경우 95℃에서 24시간 추출 시 5.
- , 2005) 인삼 또는 홍삼 추출물 및 대사산물의 효능은 다양한 면역반응에서 긍정적 효과를 가지는 것을 알 수 있다. 따라서 이들 ginsenosides 함량이 높은 추출물들을 홍삼에 비해 상대적으로 저가인 인삼에서 획득하기 위한 적정 추출 온도와 시간을 실험한 결과, 85℃에서 48시간 추출하는 조건임을 판정할 수 있었고, 이는 효율적인 조성물의 조건 확립에 중요한 기초 자료가 될 것으로 판단된다.
- 인삼추출물을 랫트 비만세포를 배양한 96 well plate에 0.06 – 2 mg/ml의 농도로 1시간동안 배양 하였을 때, 인삼추출물로서 0.5 mg/ml의 비교적 고농도에서도 80% 이상의 생존율을 보임을 확인하였다.
- )로 가장 많았으며, 본 조건에서 추출한 인삼추출물의 항알러지 기능성을 검토하고자 랫트 비만세포에서 compound 48/80로 유도된 히스타민 유리 작용을 억제하는 인삼추출물의 효능을 분석하였다. 인삼추출물의 비만세포에 대한 세포 독성 시험 결과 각 추출물은 수시간 노출시 높은 세포 생존율을 보이고 있었고 비교적 고농도인 0.5 mg/ml 처리군에서도 80% 이상의 세포 생존율을 보였다. 인삼추출물의 히스타민 유리 억제 효과를 조사하기 위해 랫트 비만세포에 대표적인 탈과립 유도제인 compound 48/80을 단독 또는 각 추출물을 동시에 처리한 후 얻어진 상청액의 히스타민의 정량을 실시한 결과 비만세포는 compound 48/80의 처리 조건에서 대조군에 비하여 30% 가량의 히스타민 유리량이 증가하였는데, 인삼추출물 처리 시 히스타민 유리 수준이 정상 수준에 가까이 감소하는 것을 확인하였다.
- 5 mg/ml 처리군에서도 80% 이상의 세포 생존율을 보였다. 인삼추출물의 히스타민 유리 억제 효과를 조사하기 위해 랫트 비만세포에 대표적인 탈과립 유도제인 compound 48/80을 단독 또는 각 추출물을 동시에 처리한 후 얻어진 상청액의 히스타민의 정량을 실시한 결과 비만세포는 compound 48/80의 처리 조건에서 대조군에 비하여 30% 가량의 히스타민 유리량이 증가하였는데, 인삼추출물 처리 시 히스타민 유리 수준이 정상 수준에 가까이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 인삼추출물의 항 알러지 목적으로의 이용 가능성을 제시하고 있다.
후속연구
- 본 연구에는 인삼에서 다양한 종류의 ginsenoside를 추출하여 함량을 비교하였고 효과적인 추출 조건을 확립하였으며, ginsenoside의 복합적 이용 방법으로 비만세포에서의 효능을 검증하였으므로, 향후 각 sub-class 별로 효과적인 추출방법을 구축함으로서 인삼 또는 홍삼의 이용 방안 확대에 기여할 수 있을 것으로 기대한다.
- 이에 반해 인삼추출물을 전처리 한 경우 compound 48/80을 처리하였을 때 히스타민의 유리가 유의하게 감소되어 대조군과 유사한 결과를 보였다. 이는 인삼추출물의 전처리가 비만세포의 히스타민 유리를 억제한 것으로 판단되며 이는 향후 부작용이 낮으면서도 알러지성 질환을 효과적으로 조절하는데 이용될 수 있는 가능성을 제시하여 주고 있다.
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