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문제 정의
- 본 연구에서는 최근에 널리 활용되는 프로테오믹스 기술을 활용하여 칼슘함량이 증가된 새송이버섯과 일반 새송이버섯에서 단백질 발현의 변화를 조사하였다. 또한 현저한 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정함으로써 새송이버섯 칼슘강화의 기작규명에 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 본 연구에서는 최근에 널리 활용되는 프로테오믹스 기술을 활용하여 칼슘함량이 증가된 새송이버섯과 일반 새송이버섯에서 단백질 발현의 변화를 조사하였다. 또한 현저한 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정함으로써 새송이버섯 칼슘강화의 기작규명에 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 본 연구에서는 프로테오믹스 기술을 활용하여 칼슘함량이 증가된 새송이버섯과 일반 새송이 버섯에서 단백질 발현의 변화를 조사하였다. 또한 현저한 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정함으로써 새송이버섯 칼슘강화의 기작규명에 기초자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 5% indole-3-acetic acid(IAA)를 첨가하여 다시 15분간 equilibration 시켰다. Equilibration된 strip은 Ettan DALTsix Larger Vertical electrophoresis system(Amersharm Pharmacia Biotech)을 이용하여 12% gel에서 80 V로 1시간 전기영동을 하고 120 V로 12시간 동안 전기영동을 실시하여 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 전기영동 후 3% phosphoric acid, 50% ethanol에서 30분간 fixing 후 물을 이용하여 gel을 깨끗이 씻어주고 다시 34% methanol, 3% phosphoric acid, 17% ammonium sulfate에서 1시간 동안 equilibration시키고 coomassie brilliant blue(0.
- 2에 나타내었다. IEF 과정은 24 cm IPG strip(pH 3-10) 범위에서 수행하였다. 15 Kda에서 100 Kda 사이에 존재하는 60% 정도의 spot은 산성 pI를 가지며 나머지 40% 정도의 spot은 염기성 영역에 나타났다.
- 이때 단백질 시료는 600 g을 사용하였으며 sample buffer 즉, lysis solution을 포함한 전체 부피가 340 L가 되도록 하여 IPGphore strip holder에 dry strip과 단백질 시료를 넣고 20℃에서 12시간 동안 IPGphor IEF system(Amersharm Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 rehydration 단계를 수행하였다. Rehydration 후염을 제거하였으며, IEF는 500 V로 1시간, 1,000 V로 1시간, 4,000V로 2시간, 8,000 V로 18시간을 수행하여 총 153,500 Vhr을 수행하였다. IEF 후 SDS-PAGE 수행을 위해 equilibration buffer [1.
- UMAX PowerLook 1120 scanner(UMAX Technologies, Inc. Dallas, TX, USA)를 이용하여 destain을 마친 gel의 이미지를 스캐닝해서 TIFF 파일 형태로 저장하였다. 저장된 이미지는 PDQuest software(version 7.
- 0, Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid spots의 intensity로 평준화(normalization) 하였으며, 칼슘이 첨가된 새송이버섯 단백질 발현 변화를 비교하기 위해 PDQuest를 이용하여 비교되는 두 gel 상의 spot을 동일하게 match시킨 뒤 각 spot에 대하여 intensity를 비교 분석하였다. 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현 변화를 보여주는 단백질을 spot으로 선정하였다.
- 시료는 −20℃에서 냉동보관하였다. 버섯 분말은 buffer [20 mM TrisHCl(pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA), 1 mM phenyl methane sulfonyl fluoride(PMSF), 1 mM dithiothreitol(DTT), 1% Triton X-100]을 이용하여 균질화를 수행하였다. 그리고 50% trichloroacetic acid를 이용하여 침전시켰다.
- 버섯으로부터 분리된 단백질 시료를 IEF(isoelectric focusing)와 2-dimensional electrophoresis를 통하여 분리하였다. 일차 IEF를 위하여 IPG strip은 24 cm pH 3-10을 이용하였다.
- 본 연구에 사용된 새송이버섯의 칼슘함량을 확인하기 위하여 새송이버섯의 칼슘원으로서 Ca-phosphate를 톱밥배지 무게에 대하여 1.0% 농도로 첨가한 후 균주를 접종하고 일반적인 새송이버섯의 배양환경 및 생육환경을 준수하여 자실체를 얻은 후 칼슘함량을 Fig. 1에 나타내었다. 배지에 칼슘원을 첨가하지 않은 대조구의 경우 새송이버섯의 칼슘 함량은 76.
- 새송이버섯과 칼슘이 첨가된 새송이버섯의 단백질 발현의 차이를 관찰하기 위해 이차원 전기영동을 수행하였다. 이미지 분석은 PDQuest 2-Dimension software(Bio-Rad)을 이용하였다.
- 접종된 톱밥배지를 23℃(습도 80% 이상)의 암실에서 25일간 균사를 배양한 다음 생육실로 옮겨 발아를 유도하였으며, 자실체의 생육조건을 맞추어 주며 자실체로 생육시켰다. 생산된 자실체는 무작위 추출하여 칼슘함량을 측정하고 2차원 전기영동을 위한 시료로 사용하였다. 새송이버섯 자실체에 함유된 칼슘함량은 원자흡광분광 광도법(17)으로 정량하였다.
- edu)을 이용하였다. 이때 database는 PubMed(www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)와 Swiss-Prot/TrEMBL(http://au.expasy.org/sport)의 정보를 바탕으로 존재하고 있는 위치에 따라 분류하였다. MS-FIT에서 database를 이용하여 검색할 때 species는 모든 종을 대상으로 선택하고 mass tolerance는 ±100 ppm 이하로 선택하여 이용하였다.
- Equilibration된 strip은 Ettan DALTsix Larger Vertical electrophoresis system(Amersharm Pharmacia Biotech)을 이용하여 12% gel에서 80 V로 1시간 전기영동을 하고 120 V로 12시간 동안 전기영동을 실시하여 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 전기영동 후 3% phosphoric acid, 50% ethanol에서 30분간 fixing 후 물을 이용하여 gel을 깨끗이 씻어주고 다시 34% methanol, 3% phosphoric acid, 17% ammonium sulfate에서 1시간 동안 equilibration시키고 coomassie brilliant blue(0.02% CBB-G250, 3% phosphoric acid, 17% ammonium sulfate, 34% ethanol)을 이용하여 stain한 뒤 이를 물을 이용하여 destain하였다.
- 접종된 톱밥배지를 23℃(습도 80% 이상)의 암실에서 25일간 균사를 배양한 다음 생육실로 옮겨 발아를 유도하였으며, 자실체의 생육조건을 맞추어 주며 자실체로 생육시켰다.
- 액체 배양을 위한 접종원의 준비는 250 mL 삼각플라스크에 50 mL의 potato dextrose broth를 조제하여 평판배양된 새송이버섯 균사체를 접종하고 5일간 배양한 다음, 배양액을 균질기로 균질화하여 접종원으로 사용하였다. 칼슘강화 새송이버섯의 제조를 위해 칼슘원으로 Ca-phosphate(CaHPO42H2O)를 1.0% 첨가한 후 배지를 100℃에서 4시간 동안 멸균하고 여기에 미리 배양된 균사체를 접종하였다. 접종된 톱밥배지를 23℃(습도 80% 이상)의 암실에서 25일간 균사를 배양한 다음 생육실로 옮겨 발아를 유도하였으며, 자실체의 생육조건을 맞추어 주며 자실체로 생육시켰다.
- 대부분의 spot이 10% 미만의 sequence coverage를 가졌다. 확인된 단백질은 2-D gel 상에서 분자량과 pI 값을 이용하여 입증하였다. 10개의 확인된 단백질은 8개의 단백질은 발현이 증가하는 것으로 나타났으며 2개의 단백질은 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
대상 데이터
- MS-FIT에서 database를 이용하여 검색할 때 species는 모든 종을 대상으로 선택하고 mass tolerance는 ±100 ppm 이하로 선택하여 이용하였다.
- 각 spot의 quantity는 total valid spots의 intensity로 평준화(normalization) 하였으며, 칼슘이 첨가된 새송이버섯 단백질 발현 변화를 비교하기 위해 PDQuest를 이용하여 비교되는 두 gel 상의 spot을 동일하게 match시킨 뒤 각 spot에 대하여 intensity를 비교 분석하였다. 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현 변화를 보여주는 단백질을 spot으로 선정하였다.
- 본 실험에서는 농촌진흥청 농업과학기술원 응용미생물학과에서 분양받은 Pleurotus eryngii NIAST 2302를 potato dextrose agar(PDA)에서 2개월 간격으로 계대배양하여 사용하였다. 액체 배양을 위한 접종원의 준비는 250 mL 삼각플라스크에 50 mL의 potato dextrose broth를 조제하여 평판배양된 새송이버섯 균사체를 접종하고 5일간 배양한 다음, 배양액을 균질기로 균질화하여 접종원으로 사용하였다.
- 새송이버섯과 칼슘이 첨가된 새송이버섯은 세척 후 냉동건조하고 액체 질소를 이용하여 분말화하여 시료로 사용하였다. 시료는 −20℃에서 냉동보관하였다.
데이터처리
- Dallas, TX, USA)를 이용하여 destain을 마친 gel의 이미지를 스캐닝해서 TIFF 파일 형태로 저장하였다. 저장된 이미지는 PDQuest software(version 7.0, Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid spots의 intensity로 평준화(normalization) 하였으며, 칼슘이 첨가된 새송이버섯 단백질 발현 변화를 비교하기 위해 PDQuest를 이용하여 비교되는 두 gel 상의 spot을 동일하게 match시킨 뒤 각 spot에 대하여 intensity를 비교 분석하였다.
이론/모형
- Peptide fingerprinting은 검색 engine인 MS-FIT(Protein Prospector v 4.0.4, http://prospector.ucsf.edu)을 이용하였다. 이때 database는 PubMed(www.
- 생산된 자실체는 무작위 추출하여 칼슘함량을 측정하고 2차원 전기영동을 위한 시료로 사용하였다. 새송이버섯 자실체에 함유된 칼슘함량은 원자흡광분광 광도법(17)으로 정량하였다.
- 새송이버섯과 칼슘이 첨가된 새송이버섯의 단백질 발현의 차이를 관찰하기 위해 이차원 전기영동을 수행하였다. 이미지 분석은 PDQuest 2-Dimension software(Bio-Rad)을 이용하였다. 이미지 분석 결과 약 800여개의 spot을 확인할 수 있었다.
성능/효과
- 확인된 단백질은 2-D gel 상에서 분자량과 pI 값을 이용하여 입증하였다. 10개의 확인된 단백질은 8개의 단백질은 발현이 증가하는 것으로 나타났으며 2개의 단백질은 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 즉, 동정된 10개의 단백질들 중 putative transcriptional regulator mtlR, arginyl-tRNA synthetase, glucose inhibited division protein A, calcium-dependent protein kinase 4, APT synthase subunit A, glutamate 5-kinase(Gamma-glutamyl kinase), probable fold bifunctional protein 및 2,3-bisphosphoglycerate dependent phosphoglycerate mutase 2는 칼슘강화 새송이버섯에서 함량이 증가하는 것으로 확인된 반면 α-centractin(Centractin)과 thiazole biosynthesis protein의 함량은 칼슘강화 새송이버섯에서 감소하는 것으로 확인되었다.
- 2-D gel의 단백질 spot을 trypsin으로 digestion하고 matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight(Maldi-Tof)를 통해 분석한 결과 700여 개의 spot이 발현의 차이를 보였고 그 중 두 배 이상의 발현변화를 보이는 spot은 30여 개가 있었다. 이들 spot 중 20개의 spot에 대한 질량 값을 얻고 database를 이용하여 단백질 동정을 수행한 결과 10개의 spot에 대한 단백질 동정을 할 수 있었다.
- Glutamate 5-phosphate를 형성하기 위해 glutamate에 인산기가 이동하도록 촉매하는 역할을 수행하는 glutamate 5-kinase는 칼슘강화 새송이버섯에서 함량이 5.2배 증가하는 것으로 확인되었다. Bifunctional protein fold는 칼슘강화 새송이버섯에서 함량이 4.
- 대부분의 단백질은 세포질에 있는 것으로 나타났으나 APT synthase subunit A는 미토콘도리아에 위치하며 α-centractin은 세포질, 세포골격, 중심체(centrosome)에 위치한다. 또한 동정된 단백질은 PudMed와 Swiss-Prot/TrEMBL의 정보를 바탕으로 생리학적 기능을 확인할 수 있었다. 칼슘함량이 강화된 새송이버섯에서 2.
- 배지에 칼슘원을 첨가하지 않은 대조구의 경우 새송이버섯의 칼슘 함량은 76.7±8.1 mg%를 나타내었으며, Ca-phosphate를 1.0% 첨가한 구에서는 290.4±9.4 mg%로 대조구에 비해 칼슘 함량이 3.8배 정도 증가함을 확인할 수 있었다.
- 또한 현저한 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정함으로써 새송이버섯 칼슘강화의 기작규명에 기초자료를 제공하고자 하였다. 새송이버섯의 단백질 패턴을 확인한 결과 15 Kda에서 100 Kda 사이에 존재하는 60% 정도의 spot은 산성 pI를 가지며 나머지 40% 정도의 spot은 염기성 영역에 나타났다. 100 Kda 이상에서는 polypeptide spot이 거의 나타나지 않았다.
- 2-D gel의 단백질 spot을 trypsin으로 digestion하고 matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight(Maldi-Tof)를 통해 분석한 결과 700여 개의 spot이 발현의 차이를 보였고 그 중 두 배 이상의 발현변화를 보이는 spot은 30여 개가 있었다. 이들 spot 중 20개의 spot에 대한 질량 값을 얻고 database를 이용하여 단백질 동정을 수행한 결과 10개의 spot에 대한 단백질 동정을 할 수 있었다. Table 1은 칼슘이 첨가된 배지의 새송이버섯에서 발현이 증가되거나 감소되어 차이를 보인 단백질을 나타내었다.
- 이미지 분석은 PDQuest 2-Dimension software(Bio-Rad)을 이용하였다. 이미지 분석 결과 약 800여개의 spot을 확인할 수 있었다. 일반 새송이버섯과 칼슘이 첨가된 새송이버섯의 단백질 발현 양상을 이차원 전기영동으로 분석한 결과는 Fig.
- 즉, 동정된 10개의 단백질들 중 putative transcriptional regulator mtlR, arginyl-tRNA synthetase, glucose inhibited division protein A, calcium-dependent protein kinase 4, APT synthase subunit A, glutamate 5-kinase(Gamma-glutamyl kinase), probable fold bifunctional protein 및 2,3-bisphosphoglycerate dependent phosphoglycerate mutase 2는 칼슘강화 새송이버섯에서 함량이 증가하는 것으로 확인된 반면 α-centractin(Centractin)과 thiazole biosynthesis protein의 함량은 칼슘강화 새송이버섯에서 감소하는 것으로 확인되었다.
- 또한 동정된 단백질은 PudMed와 Swiss-Prot/TrEMBL의 정보를 바탕으로 생리학적 기능을 확인할 수 있었다. 칼슘함량이 강화된 새송이버섯에서 2.3배 증가하는 경향을 보인 putative transcriptional regulator mtlR은 세포질에 위치하고 있으며 마니톨(mannitol) phosphoenol pyruvate-dependent sugar phosphotransferase system(PTS)의 조절을 관여하는 단백질인 것으로 확인되었다. Arginyl-tRNA synthetase은 칼슘강화 새송이버섯에서 4.
후속연구
- 10개의 확인된 단백질은 8개의 단백질은 발현이 증가하는 것으로 나타났으며 2개의 단백질은 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 동정된 단백질들의 기능을 고찰한 결과 새송이버섯의 칼슘강화기작을 규명하는데 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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