RAW264.7 Macrophage Cell에서 녹차씨껍질 에틸아세테이트 분획의 염증억제 효과 및 기전 연구 Suppressive Effect of Green Tea Seed Coat Ethyl Acetate Fraction on Inflammation and Its Mechanism in RAW264.7 Macrophage Cell원문보기
본 연구는 녹차씨껍질 분획 추출물 중 염증 저해능이 강력한 EtOAC분획을 선정하여 대식세포주인 RAW264.7 macrophage cell에서 항염증효과의 기전을 생화학적, 분자학적수준에서 분석하고자 하였다. 녹차씨껍질 추출물 100 mg당 총 페놀함량은 EtOAC분획에서 가장 높은 수준이었으며 EtOH추출물>PE분획>BuOH분획과 $H_2O$분획의 순으로 나타났다. 또한 EtOAC분획의 NO 억제능이 가장 강한 것으로 나타나, EtOAC분획의 polyphenol을 분석한 결과 EGC ($1146.5{\pm}11.01\;{\mu}g/g$)> tannic acid($967.0{\pm}32.24\;{\mu}g/g$)> EC ($70.9{\pm}4.39\;{\mu}g/g$)> gallic acid($947.6{\pm}1.03\;{\mu}g/g$)> caffeic acid($37.7{\pm}1.46\;{\mu}g/g$)> ECG($35.5{\pm}3.19\;{\mu}g/g$)> EGCG($15.5{\pm}0.09\;{\mu}g/g$)의 순으로 나타났다. 녹차씨껍질 EtOAC분획이 RAW264.7 macrophage cell에서 LPS 처리에 의한 산화적 스트레스로 발생되는 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시키며($IC_{50}$: $80.11\;{\mu}g/mL$) $PGE_2$의 생성을 억제하였다. 염증생성 전사인자인 iNOS의 유전자 발현은 농도 의존적으로 억제시켰으나 COX-2의 단백질 발현에는 영향을 미치지 않았다. 녹차씨껍질 EtOAC분획은 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시켜 산화적 스트레스를 경감시키는 역할을 하며 항산화효소계인 catalase, GSH-red 및 Mn-SOD 활성의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 핵에서의 p65 농도는 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리한 군에서 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 녹차씨껍질 EtOAC분획은 NF-${\kappa}B$ 활성을 억제함으로써 iNOS 단백질 발현을 억제하여 NO의 생성을 감소시키고 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시키며, 항산화 효소계를 활성화시켜 세포내 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 LPS 자극에 의한 염증반응을 지연하거나 억제하는 것으로 사료된다.
본 연구는 녹차씨껍질 분획 추출물 중 염증 저해능이 강력한 EtOAC분획을 선정하여 대식세포주인 RAW264.7 macrophage cell에서 항염증효과의 기전을 생화학적, 분자학적수준에서 분석하고자 하였다. 녹차씨껍질 추출물 100 mg당 총 페놀함량은 EtOAC분획에서 가장 높은 수준이었으며 EtOH추출물>PE분획>BuOH분획과 $H_2O$분획의 순으로 나타났다. 또한 EtOAC분획의 NO 억제능이 가장 강한 것으로 나타나, EtOAC분획의 polyphenol을 분석한 결과 EGC ($1146.5{\pm}11.01\;{\mu}g/g$)> tannic acid($967.0{\pm}32.24\;{\mu}g/g$)> EC ($70.9{\pm}4.39\;{\mu}g/g$)> gallic acid($947.6{\pm}1.03\;{\mu}g/g$)> caffeic acid($37.7{\pm}1.46\;{\mu}g/g$)> ECG($35.5{\pm}3.19\;{\mu}g/g$)> EGCG($15.5{\pm}0.09\;{\mu}g/g$)의 순으로 나타났다. 녹차씨껍질 EtOAC분획이 RAW264.7 macrophage cell에서 LPS 처리에 의한 산화적 스트레스로 발생되는 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시키며($IC_{50}$: $80.11\;{\mu}g/mL$) $PGE_2$의 생성을 억제하였다. 염증생성 전사인자인 iNOS의 유전자 발현은 농도 의존적으로 억제시켰으나 COX-2의 단백질 발현에는 영향을 미치지 않았다. 녹차씨껍질 EtOAC분획은 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시켜 산화적 스트레스를 경감시키는 역할을 하며 항산화효소계인 catalase, GSH-red 및 Mn-SOD 활성의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 핵에서의 p65 농도는 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리한 군에서 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 녹차씨껍질 EtOAC분획은 NF-${\kappa}B$ 활성을 억제함으로써 iNOS 단백질 발현을 억제하여 NO의 생성을 감소시키고 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시키며, 항산화 효소계를 활성화시켜 세포내 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 LPS 자극에 의한 염증반응을 지연하거나 억제하는 것으로 사료된다.
Green tea seed coat (GTSC) was extracted with 100% ethanol for 4 hr and then fractionated with petroleum ether (PE), ethyl acetate (EtOAC) and butanol (BuOH). The EtOAC fraction showed the highest level in total phenol contents and the lowest level in nitric oxide (NO) production in LPS-stimulated R...
Green tea seed coat (GTSC) was extracted with 100% ethanol for 4 hr and then fractionated with petroleum ether (PE), ethyl acetate (EtOAC) and butanol (BuOH). The EtOAC fraction showed the highest level in total phenol contents and the lowest level in nitric oxide (NO) production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cell. Thus, this study was carried out to investigate the anti-inflammatory and its mechanisms of GTSC EtOAC fraction in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cell. GTSC EtOAC fraction contained EGC ($1146.48{\pm}11.01\;{\mu}g/g$), tannic acid ($966.99{\pm}32.24\;{\mu}g/g$), EC ($70.88{\pm}4.39\;{\mu}g/g$), gallic acid ($947.61{\pm}1.03\;{\mu}g/g$), caffeic acid ($37.69{\pm}1.46\;{\mu}g/g$), ECG ($35.46{\pm}3.19\;{\mu}g/g$), and EGCG ($15.53{\pm}0.09\;{\mu}g/g$) when analyzed by HPLC. NO production was significantly (p<0.05) suppressed in a dose-dependent manner with an $IC_{50}$ of $80.11\;{\mu}g$/mL. Also prostaglandin $E_2$ level was also inhibited in a dose-dependent manner. Moreover, iNOS protein expression was suppressed in dose-dependent manner but COX-2 gene expression was not affected. Total antioxidant capacity and glutathione (GSH) levels were enhanced more than the LPS-control. Expressions of antioxidative enzymes including catalase, GSH-reductase and Mn-SOD were elevated compared to LPS-control. Nuclear p65 level was decreased in the GTSC EtOAC fraction in a dose-dependent manner. These results indicate that GTSC EtOAC fraction inhibit oxidative stress and inflammatory responses through elevated GSH levels, antioxidative enzymes expressions and suppression of iNOS expression via NF-${\kappa}B$ down-regulation.
Green tea seed coat (GTSC) was extracted with 100% ethanol for 4 hr and then fractionated with petroleum ether (PE), ethyl acetate (EtOAC) and butanol (BuOH). The EtOAC fraction showed the highest level in total phenol contents and the lowest level in nitric oxide (NO) production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cell. Thus, this study was carried out to investigate the anti-inflammatory and its mechanisms of GTSC EtOAC fraction in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cell. GTSC EtOAC fraction contained EGC ($1146.48{\pm}11.01\;{\mu}g/g$), tannic acid ($966.99{\pm}32.24\;{\mu}g/g$), EC ($70.88{\pm}4.39\;{\mu}g/g$), gallic acid ($947.61{\pm}1.03\;{\mu}g/g$), caffeic acid ($37.69{\pm}1.46\;{\mu}g/g$), ECG ($35.46{\pm}3.19\;{\mu}g/g$), and EGCG ($15.53{\pm}0.09\;{\mu}g/g$) when analyzed by HPLC. NO production was significantly (p<0.05) suppressed in a dose-dependent manner with an $IC_{50}$ of $80.11\;{\mu}g$/mL. Also prostaglandin $E_2$ level was also inhibited in a dose-dependent manner. Moreover, iNOS protein expression was suppressed in dose-dependent manner but COX-2 gene expression was not affected. Total antioxidant capacity and glutathione (GSH) levels were enhanced more than the LPS-control. Expressions of antioxidative enzymes including catalase, GSH-reductase and Mn-SOD were elevated compared to LPS-control. Nuclear p65 level was decreased in the GTSC EtOAC fraction in a dose-dependent manner. These results indicate that GTSC EtOAC fraction inhibit oxidative stress and inflammatory responses through elevated GSH levels, antioxidative enzymes expressions and suppression of iNOS expression via NF-${\kappa}B$ down-regulation.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 녹차씨껍질 분획 추출물의 항염증 활성을 비교하고 염증 저해능이 가장 강력한 분획 추출물을 선정하여 RAW264.7 macrophage cell에서 항염증 및 항산화효과의 기전을 생화학적, 분자적 수준에서 분석하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 총 페놀함량과 NO 억제능이 가장 강한 EtOAC분획을 선정하여 항염증 효과의 기전과 생리활성물질 농도를 조사하였다.
본 연구는 녹차씨껍질 분획 추출물 중 염증 저해능이 강력한 EtOAC분획을 선정하여 대식세포주인 RAW264.7 macrophage cell에서 항염증효과의 기전을 생화학적, 분자학적 수준에서 분석하고자 하였다. 녹차씨껍질 추출물 100 mg당 총 페놀함량은 EtOAC분획에서 가장 높은 수준이었으며 EtOH추출물>PE분획>BuOH분획과 H2O분획의 순으로 나타났다.
가설 설정
The levels of NF-κB localization in cells was determined with anti-p65 antibody. B: All signals were normalized to protein levels of the control protein, actin, and expressed as a ratio. The data shown are representative of triplicate experiments.
제안 방법
PGE2 생성량: PGE2 생성 저해 효과는 PGE2 assay kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 ELISA 분석을 하였다.
글루타치온 함량: 항산화 영양소인 gluthathione(GSH) 함량은 Tietze의 방법(19)을 다소 수정하여 측정하였다. 배지를 제거한 후 ice-cold PBS로 3회 세척한 다음 PBS 1 mL을 가하여 세포를 긁어 suspend한 후 eppendorf tube에 담아 cell count하여 일정량의 세포를 취해 ice bath내에서 sonicate(2×5 sec)를 사용하여 세포를 파쇄 하였다.
녹차씨껍질 분획추출물 조제는 EtOH 추출물 10 g을 증류수 500 mL을 가해 용해시킨 후 석유에테르(PE) 500 mL을 가하여 혼합한 후 PE분획인 위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다(PE분획). 남은 물층에 에틸아세 테이트(EtOAC) 500 mL을 가하여 혼합한 후 EtOAC분획인위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다(EtOAC분획). 남은 물층에 부탄올(BuOH) 500 mL을 가하여 혼합한 후 BuOH분획인 위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였으며(BuOH분획) 남은 물층은 H2O분획으로 사용하였다(Fig.
녹차씨껍질 분말의 10배(w/v)의 95% 에탄올을 가해 80±5℃에서 4시간 동안 환류 추출하여 감압여과한 후 evaporator를 사용하여 건고시켜 에탄올(EtOH) 추출물을 조제하였다.
녹차씨껍질 분획추출물 조제는 EtOH 추출물 10 g을 증류수 500 mL을 가해 용해시킨 후 석유에테르(PE) 500 mL을 가하여 혼합한 후 PE분획인 위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다(PE분획). 남은 물층에 에틸아세 테이트(EtOAC) 500 mL을 가하여 혼합한 후 EtOAC분획인위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다(EtOAC분획).
배지를 제거한 후 ice-cold PBS로 3회 세척한 다음 PBS 1 mL을 가하여 세포를 긁어 suspend한 후 eppendorf tube에 담아 cell count하여 일정량의 세포를 취해 ice bath내에서 sonicate(2×5 sec)를 사용하여 세포를 파쇄 하였다.
일차항체로 4℃에서 overnight hybridization한 후 비결합항체를 제거하고, 이차항체로 실온에서 1시간 동안 hybridization 하였다. 비결합항체를 제거한 후, western blotting chemiluminescence luminol reagent(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며 quantity one software(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 정량하였다. 본 실험에서 사용한 primary antibody(catalase antibody, GSH-red antibody, Mn-SOD antibody, Abcam)와 염증 관련 단백질 발현을 결정하기 위한 primary antibody(iNOS antibody, COX-2 antibody, actin antibody)는 Santacruz Biotechnology Inc.
세포를 24-well plate(4×105 cells/well)와 100 mm dish(5×106 cells/dish)에 주입하여 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 후, 농도별로 조제한 시료를 처리하여 2시간 배양한 후 산화적 손상을 유발하기 위해 LPS(1 μg/mL)를 첨가하고 20시간 배양하여 실험에 사용하였다.
, Hercules, CA, USA)에 90분간 blotting하고 5% nonfat dry milk에 넣고 실온에서 1시간 동안 blocking하였다. 일차항체로 4℃에서 overnight hybridization한 후 비결합항체를 제거하고, 이차항체로 실온에서 1시간 동안 hybridization 하였다. 비결합항체를 제거한 후, western blotting chemiluminescence luminol reagent(Santa Cruz Biotechnology Inc.
즉, 각 추출물 200 μL에 50% Folin-Ciocalteu reagent 1 mL과 7.5% Na2CO3 용액 800 μL을 가하고 암소에서 45분간 방치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.
파쇄 후 원심분리(4500 rpm, 10 min)하여 상등액 400 μL에 100 μL 5% SSA와 섞어 4500 rpm에서 5분간 원심분리 하여 GSH 함량을 분석하였다.
9) 30 μL를 첨가하여 잘 혼합한 후 원심분리(15,000×g, 30 min)한 후 상등액을 취해 핵 추출물로 사용하였다. 핵단백질의 발현은 p65 rabbit mAb(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 사용하여 위의 방법과 동일한 방법으로 확인하였다.
대상 데이터
RAW264.7 macrophage cell은 ATCC(TIB-71, Rockville, MD, USA)에서 구입하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 10% FBS와 2 mM L-glutamine이 첨가된 DMEM에 배양하였다. 세포를 24-well plate(4×105 cells/well)와 100 mm dish(5×106 cells/dish)에 주입하여 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 후, 농도별로 조제한 시료를 처리하여 2시간 배양한 후 산화적 손상을 유발하기 위해 LPS(1 μg/mL)를 첨가하고 20시간 배양하여 실험에 사용하였다.
본 연구에서 사용한 녹차씨껍질은 2009년 경남 화동소재 일송제다에서 구입하여 사용하였다. 녹차씨껍질(green tea seed coat, GTSC)은 녹차씨를 둘러싸고 있는 가장 바깥부분으로 깨끗하게 세척한 후 50±5℃에서 3일간 열풍 건조하여 40 mesh로 분쇄하였다.
제품을, 내부표준물질인 actin(43 kDa, sc-1616, 1:1,000)과 이차항체로 사용한 goat antimouse immunoglobulin G(1:2,000)은 Santa Cruz Biotechnology Inc. 제품을 각각 사용하였다.
5% Na2CO3 용액 800 μL을 가하고 암소에서 45분간 방치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 농도별로 조제하여 사용하였다.
데이터처리
통계분석은 SPSS software(Version 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석하였으며 모든 결과는 mean±SE로 표시하였고 각 군 간의 유의성은 one-way ANOVA와 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
Nitric oxide 생성량: Nitric oxide(NO) 생성 정도는 Green 등의 방법(17)으로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 nitrite 양을 측정하여 결정하였다. 즉, 100 μL의 배지 상등액에 50 μL의 1% sulphanilamide(in 5% phosphoric acid)와 50μL의 0.
Western blot analysis: 세포 추출 상등액을 Bradford법(20)으로 분석하여 단백질 정량 후 단백질 농도를 결정하였다. Protein sample 30 μg을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시한 후 polyvinylidene difluoride membrane(Bio-Rad Laboratories Inc.
녹차씨껍질 추출물의 총 페놀함량은 Folin-Dennis법(15)으로 측정하였다. 즉, 각 추출물 200 μL에 50% Folin-Ciocalteu reagent 1 mL과 7.
녹차씨껍질의 EtOAC분획이 NO와 PGE2 생성 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 미치는 영향을 western blot으로 확인하였다. Fig.
단백질 분리: 세포로부터 단백질을 분리하는 과정은 PROPREPTM protein extract solution(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) 방법에 의해 수행하였다. 100 mm dish (5×106 cells/dish)의 cell culture plate로부터 배양액을 제거하고 미리 준비해 둔 ice-cold PBS(pH 7.
세포 생존율은 MTT 방법(16)으로 분석하였다. 즉, 24 well의 배지를 제거하고, 1 mg/mL 농도가 되도록 3-4,5- dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)를 첨가한 후, 4시간 동안 배양하였다.
총항산화능: 총 항산화능은 Erel(18)의 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazaline-6-sulfonic acid)(ABTS) radical cation decolorization assay로 분석하여 mM trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)로 표시하였다.
성능/효과
Catalase 발현은 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC분획 75 μg/mL 이상 처리 시 유의적으로(p<0.05) 단백질 발현을 상승시키는 것으로 나타났다.
각 추출물을 100μg 농도로 처리 시 LPS 대조군에 비해 EtOH 추출물, PE분획 및 EtOAC분획에서 현저하게 낮은 수준이었으나 BuOH분획과 H2O분획은 LPS 대조군과 유사한 수준이었다. EtOAC분획에서의 NO 생성능은 EtOH 추출물과 PE분획에 비해 현저하게 낮은 수준으로 EtOAC분획이 NO 억제능이 가장 강한 것으로 나타났다. Kim과 Park(23)은 북강활의 에틸아세테이트분획은 LPS로 자극한 RAW264.
Fig. 2에서 보듯이 녹차씨껍질 추출물 100 mg당 총 페놀 함량은 EtOAC분획(7.31±0.28 mg)에서 가장 높은 수준이었으며 EtOH추출물(5.89±0.16 mg)> PE분획(3.12±0.17 mg)> BuOH분획(1.44±0.08 mg)과 H2O분획(1.19±0.03 mg)의 순으로 나타나 EtOAC분획에서 현저하게 높은 수준으로 나타났다.
Fig. 7에서 보는 바와 같이 NO 생성과 관계있는 iNOS의 단백질 발현은 LPS 대조군에 비해 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였으며 처리농도 100 μg/mL 이상 처리 시에는 untreated군과 유사한 수준을 보였다.
Glutathione-reductase(GSH-red) 발현은 녹차씨껍질 EtOAC분획을 75 μg/mL 농도로 처리하였을 때 현저하게 증가하여 가장 높은 수준을 보였으나 125 μg/mL 이상의 농도에서는 농도의존적인 효과를 보이지 않았다.
HPLC를 사용하여 분석한 녹차씨껍질 추출물의 폴리페놀 함량은 Table 2에서 보는 바와 같이 EGC(1146.5±11.01 μg/g)> tannic acid(967.0±32.24 μg/g)> EC(70.9±4.39 μg/g)> gallic acid(47.6±1.03 μg/g)> caffeic acid(37.7±1.46 μg/g)> ECG(35.5±3.19 μg/g)> EGCG(15.5±0.09 μg/g)의 순으로 검출되었다.
Glutathione-reductase(GSH-red) 발현은 녹차씨껍질 EtOAC분획을 75 μg/mL 농도로 처리하였을 때 현저하게 증가하여 가장 높은 수준을 보였으나 125 μg/mL 이상의 농도에서는 농도의존적인 효과를 보이지 않았다. Mn-SOD 발현 정도는 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC층을 처리한 모든 군에서 현저하게 증가하였으며, 농도의존성을 나타내었다. 유리산소는 SOD에 의해 H2O2와 O-2로, H2O2는 다시 glutathione-peroxidase(GSH-px)와 catalase의 작용에 의해 H2O로 배설됨으로써 SOD, catalase 및 GSH-px는 유리산소의 독으로부터 생체를 보호하는 매우 중요한 효소로 알려져 있다(45).
RAW264.7 macrophage cell에서 LPS로 유발된 산화적 스트레스에 의한 염증생성물질인 PGE2 수준은 녹차씨껍질 EtOAC층을 50 μg/mL 이상의 농도에서 LPS 대조군에 비해 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었으며 IC50값은 268.55 μg/mL이었다(Fig. 6).
각 추출물을 100μg 농도로 처리 시 LPS 대조군에 비해 EtOH 추출물, PE분획 및 EtOAC분획에서 현저하게 낮은 수준이었으나 BuOH분획과 H2O분획은 LPS 대조군과 유사한 수준이었다.
각각의 회수율은 EtOH 추출물 10 g당 EtOAC분획 3.365 g>PE분획 2.499 g>BuOH분획 2.355 g>H2O분획 0.668 g의 순으로 EtOAC 분획의 회수율이 가장 높은 수준이었다.
염증생성 전사인자인 iNOS의 유전자 발현은 농도 의존적으로 억제시켰으나 COX-2의 단백질 발현에는 영향을 미치지 않았다. 녹차씨껍질 EtOAC분획은 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시켜 산화적 스트레스를 경감시키는 역할을 하며 항산화효소계인 catalase, GSH-red 및 Mn-SOD 활성의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 핵에서의 p65 농도는 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리한 군에서 현저하게 낮은 것으로 나타났다.
항산화 영양소인 GSH 수준은 LPS로 산화적 스트레스를 유발한 대조군에서 산화적 스트레스를 유발하지 않은 untreated군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리 시 control군에 비해 모든 군에서 현저하게 증가되었으며 EtOAC층의 처리 농도가 높을수록 GSH 수준도 증가하였다(Fig. 8B). 녹차에는 폴리페놀성 화합물인 카테킨을 비롯한 다수의 성분이 함유되어 있어 여러 가지 약리작용이 뛰어나며(41), 항산화효과가 뛰어나 생체 내·외의 stress에 의해 발생되는 유리기를 제거하는 기능이 있다고 알려져 있다(42).
녹차씨껍질 EtOAC분획의 세포독성을 세포 생존율로 확인한 결과 Fig. 5와 같이 본 연구에서 처리한 농도 수준 0～125 μg/mL에서는 세포 생존율이 영향을 미치지 않아 녹차씨껍질 EtOAC분획은 세포 독성을 가지지 않는 것으로 나타났다.
8과 같다. 녹차씨껍질 EtOAC분획의 총 항산화능(Fig. 8A)은 control군에 비해 유의적으로 높은 수준으로 나타났으나 농도의존적인 효과는 보이지 않았다. 항산화 영양소인 GSH 수준은 LPS로 산화적 스트레스를 유발한 대조군에서 산화적 스트레스를 유발하지 않은 untreated군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
녹차씨껍질 추출물 100 mg당 총 페놀함량은 EtOAC분획에서 가장 높은 수준이었으며 EtOH추출물>PE분획>BuOH분획과 H2O분획의 순으로 나타났다.
LPS는 nitric oxide(NO)를 생산하는 내독소로 LPS 투여로 유발된 산화적 스트레스에서 생성된 자유 라디칼인 NO는 superoxide와 반응하여 peroxynitrite를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히는 것으로 알려져 있다. 따라서 녹차씨껍질 EtOAC층은 항산화 효소계 활성과 GSH 수준을 증가시켜 NO와 같은 자유라디칼을 소거하여 LPS에 의한 산화적 스트레스를 억제하는 것으로 사료된다. 체내에서 GSH는 GSH-red에 의해 GSH의 산화된 형태인 GSSG로부터 재생산되어질 수 있으며(48), GSH의 증가는 GSH-px 활성 증가를 유도하는 것으로 알려져 있다.
PG는 모두 8종으로 알려져 있으며, PGE2는 PG 합성효소에 의해 PGH2가 합성될 때 형성되며(34) 염증성질환을 포함한 다양한 생체반응에 있어서도 세포분열이나 증식에 영향을 줌으로써 각종 질병의 유발과 진행에 관여한다(35). 따라서 본 연구에서 녹차씨껍질 EtOAC층은 NO생성 억제뿐만 아니라 PGE2의 수준을 저해시켜 염증생성을 조절하는 것으로 보인다.
또한 EtOAC분획의 NO 억제능이 가장 강한 것으로 나타나, EtOAC분획의 polyphenol을 분석한 결과 EGC (1146.5±11.01 μg/g)> tannic acid(967.0±32.24 μg/g)> EC (70.9±4.39 μg/g)> gallic acid(947.6±1.03 μg/g)> caffeic acid(37.7±1.46 μg/g)> ECG(35.5±3.19 μg/g)> EGCG(15.5±0.09 μg/g)의 순으로 나타났다.
본 연구에서는 녹차씨껍질 EtOAC분획에는 모든 종류의 catechin들이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었으며 녹차잎에 비해 catechin류의 함량이 낮은 수준이나 녹차잎에 비해 많은 양을 얻을 수 있는 점을 고려할 때 경제성이 있는 자원이라 할 수 있다.
본 연구에서는 녹차씨껍질 EtOAC분획이 iNOS의 유전자 발현을 억제하여 NO 생성을 저해하나 COX-2의 단백질 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
녹차의 항산화 작용에 대한 연구로는 Nakayama 등(44)의 연구에서 카테킨의 폴리페놀 구조들이 hydrogen peroxide (H2O2)에 의한 cytotoxicity를 억제하는 효과가 있으며 지질과산화 초기단계에서 singlet oxygen과 유리기 제거 역할로 플라보노이드가 효과적이라고 하였다. 본 연구에서도 녹차씨껍질 EtOAC층에 상당한 양의 카테킨과 phenol이 함유되어 있음을 확인하였으며, 이것이 LPS로 자극된 RAW264.7 macrophage cell에서 항산화능을 높이는 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 녹차씨껍질 EtOAC 추출물에 의해 GSH 함량이 증가하는 것은 LPS 자극에 의해 항산화 기능이 향상됨을 보여주는 것이며, LPS에 의한 산화적 스트레스를 저하하는 효과가 있는 것으로 판단된다.
체내에서 GSH는 GSH-red에 의해 GSH의 산화된 형태인 GSSG로부터 재생산되어질 수 있으며(48), GSH의 증가는 GSH-px 활성 증가를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구의 결과에서 녹차씨껍질 EtOAC분획이 LPS로 인한 산화적 스트레스에 대한 방어 작용으로 항산화 효소계 활성과 GSHred 단백질 발현을 증가시켜 GSH의 수준을 증가시키고 따라서 내독소인 LPS에 의한 산화적 스트레스를 저하시켜 세포를 보호하는 효과를 가지는 것으로 사료된다.
5 μg/mL(31)로 보고하였다. 본 연구의 결과와 비교 시 녹차씨껍질 EtOAC분획의 IC50값은 클로렐라보다는 높은 수준이었으나 염증억제에 효과가 있는 것으로 알려진 민들레 메탄올 추출물과는 유사한 수준이었고 유사하였고 민들레 열수 추출물보다는 낮은 수준으로 나타났다.
7 macrophage cell에서 항산화능을 높이는 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 녹차씨껍질 EtOAC 추출물에 의해 GSH 함량이 증가하는 것은 LPS 자극에 의해 항산화 기능이 향상됨을 보여주는 것이며, LPS에 의한 산화적 스트레스를 저하하는 효과가 있는 것으로 판단된다.
이상의 결과에서, 녹차씨껍질 EtOAC분획은 NF-κB 활성을 억제함으로써 iNOS 단백질 발현을 억제하여 NO의 생성을 감소시키고 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시키며, 항산화 효소계를 활성화시켜 세포내 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 LPS 자극에 의한 염증반응을 지연하거나 억제하는 것으로 사료된다.
8A)은 control군에 비해 유의적으로 높은 수준으로 나타났으나 농도의존적인 효과는 보이지 않았다. 항산화 영양소인 GSH 수준은 LPS로 산화적 스트레스를 유발한 대조군에서 산화적 스트레스를 유발하지 않은 untreated군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리 시 control군에 비해 모든 군에서 현저하게 증가되었으며 EtOAC층의 처리 농도가 높을수록 GSH 수준도 증가하였다(Fig.
10에서 보는 바와 같다. 핵에서의 p65 농도는 LPS 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리한 군에서 농도 의존적으로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 많은 세포에서 NF-κB는 세포질에서 핵으로의 다양한 신호 전달에 관여하는 redox-sensitive transcription factor 로(49) 세포질 속에서 p50, p65, IκB subunit의 trimer로 발견 되고, 산화적 스트레스에 의해 IκB가 분해되면 p50/p65 heterodimer가 핵 속으로 이동하여 연속적인 DNA 결합을 초래하는 것으로 알려져 있다(50).
녹차씨껍질 EtOAC분획은 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시켜 산화적 스트레스를 경감시키는 역할을 하며 항산화효소계인 catalase, GSH-red 및 Mn-SOD 활성의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 핵에서의 p65 농도는 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리한 군에서 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 녹차씨껍질 EtOAC분획은 NF-κB 활성을 억제함으로써 iNOS 단백질 발현을 억제하여 NO의 생성을 감소시키고 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시키며, 항산화 효소계를 활성화시켜 세포내 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 LPS 자극에 의한 염증반응을 지연하거나 억제하는 것으로 사료된다.
후속연구
그러므로 NF-κB 활성 억제를 통해 염증성 매개물을 감소시키면 다양한 염증 관련 질환을 예방할 수 있을 것이라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증이란?
염증은 조직의 손상을 비롯한 외부로부터의 자극 등 다양한 감염원에 대한 체내 반응 중 하나로서 국소혈관과 다양한 면역세포가 유기적인 상호작용을 하게 된다(2,3). 이 과정에서 대식세포와 같은 염증세포들이 활성화되면서 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2), tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) 등 다량의 염증 매개 인자를 분비하게 된다(4).
염증성 매개물의 과잉 생산이 야기시키는 질병은?
대식세포에서 생성된 염증성 매개물들은 박테리아 내독소인 lipopolysaccharide(LPS)와 같은 면역 자극제 등에 노출될 경우 많은 염증 조직에서 발견되며, 그들의 mRNA 발현 또한 증가하게 된다. 이러한 염증성 매개물의 과잉 생산은 류마티스 관절염, 죽상동맥경화, 만성 간염 등많은 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다(6). Nuclear factor kappaB(NF-κB)는 cytokines, LPS와 산화적 스트레스 등을 포함한 여러 가지 외부 자극에 반응하여 활성화되어 핵으로 이동되고 면역과 염증반응을 포함한 여러 가지 target gene의 발현을 조절한다(7).
Nuclear factor kappaB 활성억제를 통해 염증성 매개물을 감소시키면 예상되는 효과는?
즉, NF-κB는 세포질 속에서 p50과 p65의 heterodimer와 방해 단백질인 IκB와 함께 불활성형으로 존재하다가 활성 산소종, LPS, cytokine 같은 염증성 자극에 의해 IκB kinase가 활성화되어 IκB가 분해되면 p50과 p65의 heterodimer 형태로 활성화되어 핵으로 이동하여 염증반응을 유도하는 cytokine, iNOS, COX-2, adhesion molecule인 vascular cell adhesion molecule-1과 intercellular cell adhesion molecule-1의 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(8-10). 그러므로 NF-κB 활성억제를 통해 염증성 매개물을 감소시키면 다양한 염증 관련질환을 예방할 수 있을 것이라 사료되고, 이러한 물질을 천연물에서 찾으려는 시도가 많아지고 있다. 최근 건강에 관한 많은 관심으로 녹차에 관한 연구는 많으나 녹차씨 껍질에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
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