팥(Phaseolus angularis) 열수 추출물의 산화적 DNA와 세포 손상 억제 효과 Inhibitory Effect of Red Bean (Phaseolus angularis) Hot Water Extracts on Oxidative DNA and Cell Damage원문보기
본 연구에서는 열수 팥 추출물이 hydroxyl 라디칼에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항산화활성과 DNA 및 세포의 산화적 손상 억제 효과를 조사하였다. 팥 열수 추출물의 DPPH 라디칼과 hydroxyl 라디칼의 제거능은 다소 낮았으나, $Fe^{2+}$-chelating과 과산화수소 제거효과는 높게 나타나 활성산소의 생성을 억제하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 또한 팥 열수 추출물의 in vitro DNA cleavage, DNA migration 및 H2AX의 인산화비 억제활성은 높은 활성을 보여주고 있어 라디칼에 의한 DNA 손상 억제에 효과적으로 작용하였다. 또한 지질과산화와 p21의 발현율을 통해 세포의 산화적 손상에 미치는 영향을 살펴보면 지질과산화 억제능과 p21의 발현율에 매우 효과적으로 작용하고 있어 라디칼에 의한 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 것으로 생각된다.
본 연구에서는 열수 팥 추출물이 hydroxyl 라디칼에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항산화활성과 DNA 및 세포의 산화적 손상 억제 효과를 조사하였다. 팥 열수 추출물의 DPPH 라디칼과 hydroxyl 라디칼의 제거능은 다소 낮았으나, $Fe^{2+}$-chelating과 과산화수소 제거효과는 높게 나타나 활성산소의 생성을 억제하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 또한 팥 열수 추출물의 in vitro DNA cleavage, DNA migration 및 H2AX의 인산화비 억제활성은 높은 활성을 보여주고 있어 라디칼에 의한 DNA 손상 억제에 효과적으로 작용하였다. 또한 지질과산화와 p21의 발현율을 통해 세포의 산화적 손상에 미치는 영향을 살펴보면 지질과산화 억제능과 p21의 발현율에 매우 효과적으로 작용하고 있어 라디칼에 의한 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 것으로 생각된다.
In this study, we evaluated the protective effects of the hot water extract from red bean (Phaseolus angularis) against oxidative DNA and cell damage induced by hydroxyl radical. The antioxidant activities were evaluated by hydroxyl radical and hydrogen peroxide scavenging assay, and $Fe^{2+}$<...
In this study, we evaluated the protective effects of the hot water extract from red bean (Phaseolus angularis) against oxidative DNA and cell damage induced by hydroxyl radical. The antioxidant activities were evaluated by hydroxyl radical and hydrogen peroxide scavenging assay, and $Fe^{2+}$-chelating assay. Although the extract with hot water didn't scavenge the hydroxyl radical, it removed and chelated hydrogen peroxide and ferrous iron necessary for the induction of hydroxyl radical by 71% and 64% at 200 ${\mu}g/ml$, respectively. Its protective effect on oxidative DNA damage was carried using ${\Psi}$X-174 RF I plasmid DNA comparing the conversion level of supercoiled form of the plasmid DNA into open-circular form and linear form and the expression level of phospho-H2AX in NIH 3T3 cells. In ${\Psi}$X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay, it inhibited oxidative DNA damage by 96% at 200 ${\mu}g/ml$. Also, it decreased the expression of phospho-H2AX by 50.1% at 200 ${\mu}g/ml$. Its protective effect against oxidative cell damage was measured by MTT assay and the expression level of p21 protein in NIH 3T3 cells. In MTT assay for the protective effect against the oxidative cell damage, it inhibited the oxidative cell death and the abnormal cell growth induced by hydroxyl radical. Also, it inhibited p21 protein expression by 98% at 200 ${\mu}g/ml$. In conclusion, the results of the present studies indicate that hot water extract from red bean exhibits antioxidant properties and inhibit oxidative DNA damage and the cell death caused by hydroxyl radical.
In this study, we evaluated the protective effects of the hot water extract from red bean (Phaseolus angularis) against oxidative DNA and cell damage induced by hydroxyl radical. The antioxidant activities were evaluated by hydroxyl radical and hydrogen peroxide scavenging assay, and $Fe^{2+}$-chelating assay. Although the extract with hot water didn't scavenge the hydroxyl radical, it removed and chelated hydrogen peroxide and ferrous iron necessary for the induction of hydroxyl radical by 71% and 64% at 200 ${\mu}g/ml$, respectively. Its protective effect on oxidative DNA damage was carried using ${\Psi}$X-174 RF I plasmid DNA comparing the conversion level of supercoiled form of the plasmid DNA into open-circular form and linear form and the expression level of phospho-H2AX in NIH 3T3 cells. In ${\Psi}$X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay, it inhibited oxidative DNA damage by 96% at 200 ${\mu}g/ml$. Also, it decreased the expression of phospho-H2AX by 50.1% at 200 ${\mu}g/ml$. Its protective effect against oxidative cell damage was measured by MTT assay and the expression level of p21 protein in NIH 3T3 cells. In MTT assay for the protective effect against the oxidative cell damage, it inhibited the oxidative cell death and the abnormal cell growth induced by hydroxyl radical. Also, it inhibited p21 protein expression by 98% at 200 ${\mu}g/ml$. In conclusion, the results of the present studies indicate that hot water extract from red bean exhibits antioxidant properties and inhibit oxidative DNA damage and the cell death caused by hydroxyl radical.
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문제 정의
따라서 산화적 스트레스와 관련된 여러 가지 질환을 예방하기 위하여 활성산소의 발생을 감소시키기 위한 천연 생리활성 물질을 개발하려는 것은 중요한 연구분야이다. 따라서 본 연구에서는 팥 열수 추출물 내 천연 성분의 항산화 활성 및 DNA와 세포의 손상 억제 활성을 알아보았다.
본 연구에서는 열수 팥 추출물이 hydroxyl 라디칼에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항산화활성과 DNA 및 세포의 산화적 손상 억제 효과를 조사하였다. 팥 열수 추출물의 DPPH 라디칼과 hydroxyl 라디칼의 제거능은 다소 낮았으나, Fe2+-chelating과 과산화수소 제거효과는 높게 나타나 활성산소의 생성을 억제하는 데 효과적인 것으로 확인되었다.
, 2003). 본 연구에서는 팥 유래 천연 성분의 고기능성 소재 활용을 위한 생화학 및 분자적 차원의 작용기전을 규명하고자 팥 열수 추출물의 항산화능 및 산화적으로 손상을 받는 DNA와 세포에 대한 억제 효과에 대해 조사하였다.
제안 방법
H2AX 단백질 발현 확인을 확인하기 위하여 sample을 처리한 NIH 3T3 세포로부터 lysis buffer(50 mM tris– HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 ㎎/ml aprotinin, 10 ㎎/ml leupeptin, 5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF] and 1 mM DTT)를 이용하여 단백질을 추출하여 PVDF membrane에 transfer 하였다.
Hydroxyl 라디칼과 hydrogen peroxide 소거능 및 Fe2+-chelating 활성은 증류수를 처리한 대조군과 비교하여 계산하였다.
NIH 3T3 세포(2×105 cells/ml)에 시료와 hydroxyl 라디칼을 처리하고 세포는 회수하여 1.15% KCl로 homogenization 시킨 후 0.2 ml sodium dodecyl sulfate(8.1%), 1.5 ml acetic acid(20%, pH 3.5) 그리고 1.5 mlthiobarbituric acid(0.8%)를 첨가하여 고온에서 2시간 동안 반응시켰다.
transfer 후 membrane에 H2AX antibody와 dilution buffer(5% BSA, 1×TBST)를 1:1000으로 하여 4℃에서 반응시킨 후 2차 HRP-linked antibody를 처리하여 H2AX 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
농도별 sample(DMSO에 4 ㎎/ml로 희석) 과 300 μM DPPH 에탄올을 30분간 반응한 후 추출물의 농도에 따라 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포의 비정상적 증식을 저해하는 것으로 알려져 있는 p21 단백질은 세포주기 상 G1 기에서 암세포의 증식을 억제하는 가장 중요한 세포 주기조절 인자 중 하나이다(Morgan, 1995). 따라서 팥 열수 추출물의 산화적 세포 손상에 대한 억제 활성을 조사하기 위해 p21 단백질 발현율을 분석하였다. 본 연구에서 무처리 대조군에 비해 Fe2+와 H2O2만 처리한 라디칼 처리군의 p21 단백질 발현율은 36.
농도별 sample(DMSO에 4 ㎎/ml로 희석) 과 300 μM DPPH 에탄올을 30분간 반응한 후 추출물의 농도에 따라 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료에 따른 DPPH 소거능은 DMSO 처리 대조군과 비교하여 DPPH 라디칼을 소거하는 시료의 농도로 계산하였다.
따라서 이러한 산화적 스트레스를 방어하는 항산화능은 호기성 생물의 노화와 질병에 관련되어 매우 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 측면에서 팥 열수 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여 추출물의 농도에 따른 DPPH 유리 라디칼 및 hydroxyl 라디칼 제거능을 측정하였다. 팥 열수 추출물의 DPPH 유리 라디칼 제거능은 0.
팥 열수 추출물의 산화적 DNA 손상 억제력을 조사하기 위하여 우선 팥 열수 추출물이 ΨX-174 RF I plasmid DNA 손상에 미치는 영향을 조사하였다.
팥 열수 추출물의 산화적 DNA 손상 억제력을 평가하기 위해 ΨX-174 RF I plasmid DNA를 이용하여 in vitro DNA cleavage와 DNA migration 분석을 실시하였다.
팥 열수 추출물의 산화적 세포 손상 억제력을 조사하기 위하여 팥 열수 추출물에 대한 MTT 분석을 실시하였다. NIH 3T3 세포(5 ×103 cell/well)은 농도별 시료를 처리하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, hydroxyl 라디칼을 처리하고 50 μl의 MTT solution(1 mg/ml)을 각 well에 넣어 4시간 반응시켰다.
팥 열수 추출물이 hydroxyl 라디칼에 의한 DNA의 인산화에 미치는 영향을 알아보기 위해 H2AX의 인산화비를 분석하였다. H2AX 인산화는 각종 DNA 손상에 의해 노출된 후 나타나는 단백질로(Rogakou et al.
팥 열수 추출물이 활성 산소에 의해 야기되는 세포 손상에 미치는 영향을 알아보기 위해 우선 MTT 분석을 통한 팥 추출물의 세포 독성을 확인하였다. NIH 3T3 세포를 대상으로 세포 생존율을 측정한 결과 Fe2+와 H2O2만 처리한 라디칼 처리군은 무처리 대조군에 비해 세포의 생존율이 54.
ΨX-174 RF I plasmid DNA와 농도별 시료를 처리하여 hydroxyl 라디칼과 혼합하였다. 혼합한 시료는 37℃에서 30분 동안 반응 시킨 후, 50% glycerol(v/v), 40 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue을 첨가하여 reaction stop buffer를 만들어 1% agarose gel로 전기영동 후 분석하였다.
NIH 3T3 세포(2×106 cells/well) 팥 열수 추출물을 처리하고 각각의 처리별 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 상등액을 제거한 후 lysis buffer와 proteinase K를 첨가하여 약 1시간 동안 반응시키고, RNase와 DNA sample buffer를 첨가하여 2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
대상 데이터
ΨX-174 RF I plasmid는 New England BioLabs(County Road Ipswich, MA)에서 구입하였고, Western-blot에 사용된 Anti-body는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (CA, USA)에서 구입하였다.
NIH 3T3 세포는 한국세포주은행(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양받았고, 세포의 배양을 위해 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)와 fetal bovine serum(FBS), phosphate buffered saline(PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA) 로부터 구입하였다.
본 연구에 사용한 팥(Phaseolus angularis)은 경북 안동시 농협에서 구입하여 사용하였다. NIH 3T3 세포는 한국세포주은행(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양받았고, 세포의 배양을 위해 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)와 fetal bovine serum(FBS), phosphate buffered saline(PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA) 로부터 구입하였다.
데이터처리
모든 실험은 독립적으로 5회 이상 반복적으로 이루어졌으며 결과에 대한 통계처리는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 평균치간의 유의성은 Student’s t-test를 이용한 후 P 값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
DNA migration 분석은 Cho(2008)의 방법에 따라 실시하였다. NIH 3T3 세포(2×106 cells/well) 팥 열수 추출물을 처리하고 각각의 처리별 세포를 회수하였다.
DPPH 라디칼 소거능은 Hsu 등(2006)의 방법을 이용하여 조사하였다. 농도별 sample(DMSO에 4 ㎎/ml로 희석) 과 300 μM DPPH 에탄올을 30분간 반응한 후 추출물의 농도에 따라 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Hydrogen peroxide 소거능은 Pick와 Keisari(1980)의 방법에 준하여 실시하였다. 7.
Hydroxyl 라디칼 소거활성은 Smirnoff와 Cumbes(1989)의 방법에 따라 측정하였다. 1.
Lipid peroxidation 분석은 Kang 등(2008)의 방법에 따라 시행하였다. NIH 3T3 세포(2×105 cells/ml)에 시료와 hydroxyl 라디칼을 처리하고 세포는 회수하여 1.
p21 단백질의 발현을 확인하기 위하여 시료와 hydroxyl 라디칼을 처리한 NIH 3T3 세포는 trypsin-EDTA로 세포를 회수하여 단백질 정량 후 western-blot 분석 방법에 의해 p21 단백질의 발현을 확인하였다.
성능/효과
NIH 3T3 세포를 대상으로 세포 생존율을 측정한 결과 Fe2+와 H2O2만 처리한 라디칼 처리군은 무처리 대조군에 비해 세포의 생존율이 54.7% 로 급격히 감소하였으나, 팥 열수 추출물과 라디칼을 함께 처리하였을 때에는 200 μg/ml 농도에서 97.0%로 나타나 대조군과 유사한 세포 생존율을 보였다(Fig. 8).
또한 팥 열수 추출물의 in vitro DNA cleavage, DNA migration 및 H2AX의 인산화비 억제활성은 높은 활성을 보여주고 있어 라디칼에 의한 DNA 손상 억제에 효과적으로 작용하였다. 또한 지질과산화와 p21의 발현율을 통해 세포의 산화적 손상에 미치는 영향을 살펴보면 지질과산화 억제능과 p21의 발현율에 매우 효과적으로 작용하고 있어 라디칼에 의한 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 것으로 생각된다.
또한 팥 열수 추출물의 DNA migration을 분석해 보면 DNA tail 이동도는 무처리 대조군에 비해 라디칼 처리군에서 매우 증가되는 경향을 보이지만, 이러한 조건에서 팥 열수 추출물을 농도별로 처리하였을 경우 DNA tail은 농도가 높아짐에 따라 점차적으로 감소하여 고농도에서 무처리 대조군과 유사한 이동도를 나타내었다(Fig. 6). 최근 연구에서 천궁(Cnidium officinale)의 80% 에탄올 추출물의 경우 1.
본 연구에서 무처리 대조군에 비해 Fe2+와 H2O2만 처리한 라디칼 처리군의 p21 단백질 발현율은 36.8%을 나타냈으나 팥 열수 추출물과 라디칼을 함께 처리하였을 때에는 처리농도가 높아짐에 따라 발현율도 점차 증가하여 1.6μg/ml에서 42.6%, 8 μg/ml에서 50.6%, 40 μg/ml에서 약 90.3%, 200 μg/ml에서 93.6%로 확인되어 매우 높은 활성을 나타내었다(Fig. 10).
DNA에 유발된 산화적 손상의 축적은 정상세포를 형질전환 세포로 전환시키는 발암 개시점으로 작용하기 때문에 항산화능에 있어 DNA의 산화적 손상에 대한 억제력은 매우 중요하다(Vuillaume, 1987). 본 연구에서 무처리 대조군의 plasmid DNA는 손상 받지 않은 super coiled(SC) 형태로 확인되었으나, Fe2+와 H2O2만 처리한 라디칼 처리군에서는 활성산소에 의한 DNA 분절화로 인해 open circular (OC) 형태로 전환되었다. 이러한 조건에서 팥 열수 추출물과 라디칼을 함께 처리한 실험군에서는 SC 형태에서 OC 형태로의 전환을 농도 의존적으로 억제하여 1.
본 연구에서 팥 열수 추출물은 200 μg/ml에서 약 50%의 인산화비 억제율을 보이고 있기 때문에 DNA의 인산화를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
본 연구에서 팥 열수 추출물의 Fe2+-chelating 효과는 0.32 μg/ml에서 4.0%, 1.6 μg/ml에서 21.6%, 8 μg/ml에서 38.8%, 40 μg/ml에서 60.2%, 200 μg/ml에서 71.0%의 효과를 보였으며(Fig. 3), 과산화수소 제거능도 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하여 200 μg/ml의 농도에서 약 67.3%의 제거능이 나타났다(Fig. 4).
, 2009). 본 연구에서도 팥 열수 추출물은 plasmid DNA의 산화적 손상 억제능과 DNA tail 이동도를 감소시키는 것으로 보아 활성산소에 의한 DNA의 분절화를 억제하는데 효과적으로 작용하는 것으로 생각된다.
본 연구에서도 팥 열수 추출물은 지질과산화 억제율이 200 μg/ml에서 91.2%로 확인되어 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 감소시키는 데 높은 효과로 작용할 것으로 생각된다.
이러한 조건에서 팥 열수 추출물과 라디칼을 함께 처리한 실험군에서는 SC 형태에서 OC 형태로의 전환을 농도 의존적으로 억제하여 1.6 μg/ml에서 약 16.9%, 8 μg/ml에서 약 36.01%, 40 μg/ml에서 약 90.4%, 그리고 200 μg/ml에서 약 92.3%로 나타났다(Fig. 5).
이와 더불어 지질과산화 분석을 통하여 팥 열수 추출물이 hydroxyl 라디칼에 의한 과산화물의 생성에 미치는 영향을 조사하여 본 결과, 무처리 대조군에 비하여 라디칼 처리군의 지질과산화 억제 효과는 8.1%의 낮은 수치를 보였다. 반면 이러한 조건에서 팥 열수 추출물의 지질과산화 억제 효과는 1.
본 연구에서는 열수 팥 추출물이 hydroxyl 라디칼에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항산화활성과 DNA 및 세포의 산화적 손상 억제 효과를 조사하였다. 팥 열수 추출물의 DPPH 라디칼과 hydroxyl 라디칼의 제거능은 다소 낮았으나, Fe2+-chelating과 과산화수소 제거효과는 높게 나타나 활성산소의 생성을 억제하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 또한 팥 열수 추출물의 in vitro DNA cleavage, DNA migration 및 H2AX의 인산화비 억제활성은 높은 활성을 보여주고 있어 라디칼에 의한 DNA 손상 억제에 효과적으로 작용하였다.
팥 열수 추출물의 DPPH 유리 라디칼 제거능은 0.32 μg/ml에서 10.2%, 1.6 μg/ml에서 44.0%, 8 μg/ml 에서 52.2%, 40 μg/ml에서 57.6%, 200 μg/ml에서는 65.9%의 유리 라디칼 제거능을 나타내었으며(Fig. 1), hydroxyl 라디칼 제거능의 분석 결과 0.32, 1.6, 8, 40, 200 μg/ml의 농도에서 각 5.0%, 19.3%, 21.8%, 25.7%, 39.1%의 라디칼 제거 활성을 보였다(Fig. 2).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
천연 항산화성 물질에는 어떤 것들이 있는가?
, 2009). 따라서 활성산소를 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 효소계열의 예방적 항산화제인 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase 등과 천연 항산화제인 tocopherol, 비타민 C, carotechin, glutathione 및 합성 항산화제인 butylated hydroxytoluene(BHT), butylated hydroxyanisole(BHA), troxol-C를 포함한 많은 항산화제가 개발되어 연구 보고되었다(Hatano, 1995; Masaki et al., 1995).
체내 항산화효소에는 어떤 것들이 있는가?
, 2007). 그러나 생체에 존재하는 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase 등과 같은 항산화효소는 세포 활동 중 생성되는 활성산소의 유리기를 제거함으로써 산화-항산화의 균형을 유지시켜 줌으로서 산화적 스트레스로부터 생체를 보호하고 있다(Ji, 1993). 이 외에도 활성산소를 소거할 수 있는 화합물 또는 과산화물 생성 억제 물질과 같은 항산화제들은 활성산소로 인한 산화적 손상으로부터 세포를 보호함으로써 산화스트레스에 의해 유발되는 질병의 예방 또는 치료 효과를 나타내고 있다(Kim et al.
합성 항산화제에는 어떤 것들이 있는가?
, 2009). 따라서 활성산소를 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 효소계열의 예방적 항산화제인 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase 등과 천연 항산화제인 tocopherol, 비타민 C, carotechin, glutathione 및 합성 항산화제인 butylated hydroxytoluene(BHT), butylated hydroxyanisole(BHA), troxol-C를 포함한 많은 항산화제가 개발되어 연구 보고되었다(Hatano, 1995; Masaki et al., 1995).
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