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문제 정의
- 그러나 RAPD 방법을 이용하여 기내 배양된 Cymbidium 식물속의 변이성 분석에 관한 국내 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 실험에서는 Cymbidium속 식물의 종간 관계인 춘란과 한란의 근경을 기내에서 장기간 배양할 때 발생할 수 있는 변이성을 RAPD 수준에서 탐색함으로써 기내배양 중 발생하는 변이빈도를 구명하고, 기내 배양계를 이용한 돌연변이 연구의 기초자료를 작성하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
- 추출된 DNA는 0.8% agarose gel에서 전기 영동하여 밴드를 확인하였고, Nanodrop Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Netherlands)를 이용하여 DNA농도를 측정하였다.
- , 1998). 증식된 근경은 MS배지에 malt extract 4 g/L, potato starch 3.5 g/L, active carbon 0.2 g/L, NAA 1.0 mg/L, BA 0.1 mg/L를 첨가하고, 멸균 전 pH 5.8로 적정한 배지를 이용하여 8주 간격으로 8년간 계대배양을 실시하여 4~5 cm 길이의 춘란과 한란 근경 각 30개체를 DNA 추출에 이용하였다. 배양조건은 25 ± 2℃로 유지되는 배양실에서 20 mol · m-2 · sec-1 광도로 16시간/일 조명하면서 배양하였다.
- 3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl2]를 총 25 ㎕로 하여 혼합하였다. PCR 조건은 Genamp PCR System 2700(Applied Biosystems, UK)을 이용하여 94℃에서 4분간 초기 변성시킨 후 94℃에서 1분, 37℃에서 1분, 72℃에서 2분을 40회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 7분간 반응시킨 후 반응을 종료하였다. PCR한 증폭산물 12 ㎕를 1.
- PCR 조건은 Genamp PCR System 2700(Applied Biosystems, UK)을 이용하여 94℃에서 4분간 초기 변성시킨 후 94℃에서 1분, 37℃에서 1분, 72℃에서 2분을 40회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 7분간 반응시킨 후 반응을 종료하였다. PCR한 증폭산물 12 ㎕를 1.5% agarose gel에 loading하여 전기영동(50V, 60분)한 후 EtBr 염색하고, Gel Doc XR(Bio-rad, USA)에서 주요 밴드를 확인하였다. 실험의 재현성을 위해 2회 반복 실험하여 증폭된 DNA 단편을 자료로 취하였다.
- 5% agarose gel에 loading하여 전기영동(50V, 60분)한 후 EtBr 염색하고, Gel Doc XR(Bio-rad, USA)에서 주요 밴드를 확인하였다. 실험의 재현성을 위해 2회 반복 실험하여 증폭된 DNA 단편을 자료로 취하였다.
- 장기간 기내 배양한 배양체의 유전적 안정성을 검토하고자 25개의 primer를 이용하여 춘란과 한란의 근경에 대한 RAPD 분석을 수행한 결과는 다음과 같다.
- 24개의 다형성 밴드가 관찰되었다(Table 2). 한란의 개체 특이적 증폭 산물로 5개 (OPB-14, OPB-16, OPC-15, OPC-16, OPD-07) primer 에서 5개체의 시료(No. 3, 5, 8, 10, 15)에 대하여 8개의 특이적인 밴드가 관찰되었으며 7개의 개체특이적 밴드를 제시하였다(Fig. 2). 검출된 밴드는 300~1300 bp 범위였다.
- 기내에서 장기간 배양된 근경의 변이 정도를 RAPD 수준에서 파악하여 육종적 측면에서 활용하고자 유전적 유사도 지수를 산출하고 군집분석을 실시하여 개체군간, 그리고 품종간 변이 정도를 비교하였다.
- 기내 배양된 Cymbidium속 춘란과 한란의 근경을 대상으로 장기배양에 따른 변이성을 비교하기 위하여 RAPD 분석을 실시하였다. 춘란은 총 151개 DNA 밴드 중 40개의 다형성 밴드가 증폭되어 다형성 비율은 26.
대상 데이터
- 식물 재료로는 Cymbidium속 춘란(Cymbidium goeringii Lindley)과 한란(Cymbidium kanran Makino) 2종류를 공시하였다. 난의 근경을 유도하기 위하여 춘란과 한란의 종자를 무균으로 발아시켜서 유도된 근경이 5 cm 정도 크기로 자랐을 때 2~3 cm 길이로 분리하여 MS배지(Murashige and Skoog, 1962)에 NAA 2.
데이터처리
- RAPD로 분석된 DNA 밴드 양상은 이진수를 이용하여 밴드가 있으면 (1), 없으면 (0)으로 data를 표시하여 통계 프로그램에 입력하였다. 분석에 이용된 통계프로그램은 SPSS V.12(SPSS Inc., USA)로서 단순일치계수(simple-matching coefficient)로 유전적 유사도지수를 산출하였고, 군집분석은 평균연결법(Average linkage method)으로 실시하였다.
이론/모형
- DNA 추출은 CTAB법(Fang et al., 1992)으로 실시하였다. 추출된 DNA는 0.
- 기내에서 장기간 배양한 춘란과 한란 근경의 변이성 분석을 위해 Bae 등(2003)의 결과에서 12개 primer와 예비 실험 결과 재현성과 다형성이 우수한 13개 primer를 추가로 선발하여 총 25개의 random primer(Operon Technologies, USA)를 사용하였다(Table 1). PCR을 위한 반응액은 주형 DNA 25 ng, primer 10 pmol, Taq polymerase 1 unit(Intron), dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 0.
성능/효과
- 4%의 다형성을 보였다(Table 1). 각 primer 별 증폭된 DNA 절편의 수는 최소 3개(OPD-10, OPE-07)에서 최대 8개(OPB-14, OPC-05, OPD-03, OPD-07, OPE-03)로 한 primer 당 평균 밴드수는 6.04개 였다. 다형성 밴드의 수는 1개(OPC-05, OPD-10, OPD-13, OPD-18, OPE-07, OPG-18)에서 최대 4개(OPB-14, OPC-10, OPC-16, OPD-03, OPG-14)로 primer 당 평균 1.
- 04개 였다. 다형성 밴드의 수는 1개(OPC-05, OPD-10, OPD-13, OPD-18, OPE-07, OPG-18)에서 최대 4개(OPB-14, OPC-10, OPC-16, OPD-03, OPG-14)로 primer 당 평균 1.6개의 다형성 밴드가 검출되었다. 그러나 7개 primer(OPA-01, OPA-18, OPB-06, OPB-16, OPD-11, OPE-03, OPE-15)에서는 모두 같은 밴드 패턴을 가졌다(Table 1).
- 2개로 나타났다. 8개 primer(OPD-03, OPD-08, OPD-10, OPD-12, OPD-13, OPE-03, OPE-07, OPE-15)에서는 모두 같은 밴드 패턴을 나타내었고, 각 primer 당 다형성 밴드의 수는 1개(OPA-01, OPB-11, OPD-18, OPG-18) 에서 최대 11개(OPC-15)로 평균 2.24개의 다형성 밴드가 관찰되었다(Table 2). 한란의 개체 특이적 증폭 산물로 5개 (OPB-14, OPB-16, OPC-15, OPC-16, OPD-07) primer 에서 5개체의 시료(No.
- 춘란과 한란 모두 Cymbidium 원종 계통의 RAPD 분석결과 다형성이 99%인 점(Choi, 2001)과 Cymbidium 품종간 RAPD 절편의 다형성이 78%인 결과(Obara and Kako, 1998) 보다 낮게 나타난 결과이다. 특히 자가 수분하여 획득한 종자에서 유래한 한국춘란의 유묘 46개체 분석에서 나타난 다형성인 97.8% (Kim, 2004) 보다 본 실험에서 RAPD 절편 다형성이 낮게 나타난 것으로 보아 본 연구의 장기간 기내 배양하는 동안 유도되는 변이빈도는 교배종간 및 계통 간에 존재하는 변이빈도에는 이르지 못한다는 것을 알 수 있다.
- RAPD에서 획득한 DNA 밴드 자료를 토대로 단순 일치 계수(Simple-matching coefficient)를 사용하여 유전적 유사도 지수를 분석한 결과, 춘란 30개체 간의 유전적 유사도 지수는 최저 0.868(No. 4번과 30번 사이)에서 최대 0.987(No. 1번과 7번, 5번과 6번 사이)사이로 춘란 30개체의 유전적 유사도 평균은 0.931이었다(Table 3). 한란에서 30개체간 유전적 유사도 지수는 최저 0.
- 평균연결법(Average Linkage Method)으로 군집분석을 실시하여 개체를 분류한 결과(Fig. 3, Fig. 4), 유전적 유사도 지수 0.900에서 춘란은 1개 그룹과 독립적으로 존재하는 2개체(4번, 8번 개체)가 나뉘어졌으며, 군집된 개체들의 유전적 유사도는 0.919~0.987이었다(Fig. 3). 한란은 1개 그룹과 그룹에 속하지 못한 6개체(3번, 8번, 12번, 14번, 15번, 16번, 개체)로 나뉘어졌으며 군집된 개체들의 유전적 유사도는 0.
- 기내 배양된 Cymbidium속 춘란과 한란의 근경을 대상으로 장기배양에 따른 변이성을 비교하기 위하여 RAPD 분석을 실시하였다. 춘란은 총 151개 DNA 밴드 중 40개의 다형성 밴드가 증폭되어 다형성 비율은 26.4%였으며, 한란은 총 155개 밴드 중 56개의 다형성 밴드가 증폭되어 36.1%의 다형성 비율을 나타내었다. 단순일치 계수(simplematching coefficient)를 사용하여 유전적 유사도 지수를 분석한 결과, 춘란의 개체간의 유전적 유사도 지수는 0.
- 1%의 다형성 비율을 나타내었다. 단순일치 계수(simplematching coefficient)를 사용하여 유전적 유사도 지수를 분석한 결과, 춘란의 개체간의 유전적 유사도 지수는 0.825~ 1.00 사이로 평균 0.944였다. 한란의 개체간 유전적 유사도 지수는 0.
- 913이었다. 군집분석결과 춘란은 유전적 유사도 지수 0.841과 0.837에서 1개의 그룹과 유집되지 않는 2개체로 나누어졌으며 한란보다 단순하게 유집되었다. 이와 같이 생장조절제가 첨가된 기내 배지에서 장기간 배양된 Cymbidium 근경은 유전적 다형성을 나타냈으며, 유전적 유사지수도 다소 낮게 나타났다.
- 837에서 1개의 그룹과 유집되지 않는 2개체로 나누어졌으며 한란보다 단순하게 유집되었다. 이와 같이 생장조절제가 첨가된 기내 배지에서 장기간 배양된 Cymbidium 근경은 유전적 다형성을 나타냈으며, 유전적 유사지수도 다소 낮게 나타났다. 이 결과는 추후 여러 가지 변이원을 이용한 자원식물개 발과 품종육성의 기초자료로 활용될 것으로 기대된다.
후속연구
- , 2007). 따라서 본 연구에서 개체 특이적 밴드를 나타낸 primer는 춘란과 한란의 기내배양 개체에서 변이 관련 마커로 활용될 수 있으므로 변이성 특이 마커의 개발이 기대된다.
- 이상의 분석에서 나타난 바와 같이 다른 개체와 비교하여 높은 유전적 변이를 가진 개체를 선발해 간다면 기내 배양을 이용한 돌연변이육종 측면에서도 활용이 기대된다(Lee et al., 1998; Broertjes and Van Harten, 1988). 또한 기내 배양계를 이용하여 변이유도를 단시간 내에 극대화하기 위해서는 장기간기내 배양을 통해서 체세포변이를 유발 하는 것뿐만 아니라(Parani et al.
- 이와 같이 생장조절제가 첨가된 기내 배지에서 장기간 배양된 Cymbidium 근경은 유전적 다형성을 나타냈으며, 유전적 유사지수도 다소 낮게 나타났다. 이 결과는 추후 여러 가지 변이원을 이용한 자원식물개 발과 품종육성의 기초자료로 활용될 것으로 기대된다.
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