난백에 함유된 lysozyme은 용균작용을 하며 ovalbumin은 면역계에서 항원으로써 역할을 한다. 난백분석에는 일반적으로 전기영동, 겔 투과 크로마토그래피, reversed-phase HPLC(RP-HPLC)를 사용하는데 신속한 분석을 위해 RPHPLC가 사용된다. HPLC 컬럼으로 C18 컬럼(Agilent, USA)을 사용하였다. 최적의 분리조건을 찾기 위해 이동상의 조성과 온도를 변화하였고 용량인자, 분리도를 계산하여 그 값을 비교하였다. 등용매 용리에서 acetonitrile(ACN), distilled ater(DW), trifluoroacetic acid(TFA)의 이동상 부피비를 30/70/0.1~60/40/0.1로 ACN 부피비를 10%씩 증가시키며 실험하였고 이 때 온도는 $20^{\circ}C$이었다. 기울기 용리에서는 ACN과 증류수의 비율을 20분 동안 10/90~60/40으로 증가시켰고 20, 30, $40^{\circ}C$의 온도변화를 주었다. 등용매 용리에서 이동상 조성이 50/50/0.1일 때 세 개의 피크로 분리되었고 개의 피크 중 첫 번째 피크가 lysozyme, 세 번째 피크가 ovalbumin임을 확인하였다. 기울기 용리에서는 온도가 $30^{\circ}C$일 때 네 개의 피크가 나왔으며 네 개의 피크 중 첫 번째 피크가 lysozyme, 세 번째 피크가 ovalbumin임을 확인하였다.
난백에 함유된 lysozyme은 용균작용을 하며 ovalbumin은 면역계에서 항원으로써 역할을 한다. 난백분석에는 일반적으로 전기영동, 겔 투과 크로마토그래피, reversed-phase HPLC(RP-HPLC)를 사용하는데 신속한 분석을 위해 RPHPLC가 사용된다. HPLC 컬럼으로 C18 컬럼(Agilent, USA)을 사용하였다. 최적의 분리조건을 찾기 위해 이동상의 조성과 온도를 변화하였고 용량인자, 분리도를 계산하여 그 값을 비교하였다. 등용매 용리에서 acetonitrile(ACN), distilled ater(DW), trifluoroacetic acid(TFA)의 이동상 부피비를 30/70/0.1~60/40/0.1로 ACN 부피비를 10%씩 증가시키며 실험하였고 이 때 온도는 $20^{\circ}C$이었다. 기울기 용리에서는 ACN과 증류수의 비율을 20분 동안 10/90~60/40으로 증가시켰고 20, 30, $40^{\circ}C$의 온도변화를 주었다. 등용매 용리에서 이동상 조성이 50/50/0.1일 때 세 개의 피크로 분리되었고 개의 피크 중 첫 번째 피크가 lysozyme, 세 번째 피크가 ovalbumin임을 확인하였다. 기울기 용리에서는 온도가 $30^{\circ}C$일 때 네 개의 피크가 나왔으며 네 개의 피크 중 첫 번째 피크가 lysozyme, 세 번째 피크가 ovalbumin임을 확인하였다.
Lysozyme in egg white functions as bacteriolysis agent and ovalbumin plays a role as antigen in immune system. Egg white analysis methods usually include electrophoresis, gel permeation chromatography and reversed-phase HPLC(RP-HPLC). Among them, RP-HPLC was selected for rapid analysis and C18 colum...
Lysozyme in egg white functions as bacteriolysis agent and ovalbumin plays a role as antigen in immune system. Egg white analysis methods usually include electrophoresis, gel permeation chromatography and reversed-phase HPLC(RP-HPLC). Among them, RP-HPLC was selected for rapid analysis and C18 column(Agilent, USA) was used as HPLC column. Optimum conditions were searched by changing mobile phase and temperature. Capacity factor and resolution were calculated and compared for various elution conditions. In the isocratic elution, mobile phase volume ratio was changed from 30/70/0.1 to 60/40/0.1(Acetonitrile(ACN)/Distilled water(DW)/Trifluoroacetic acid(TFA)). ACN composition was increased by 10% and temperature was set as $20^{\circ}C$. In the gradient elution, ACN/DW ratio was changed from 10/90 to 60/40 during 20 minute and temperature was varied as 20, 30 and $40^{\circ}C$. In the isocratic elution, three peaks were separated at 50/50/0.1. Lysozyme and ovalbumin were confirmed as first and third peak in three peaks respectively. In the gradient elution, four peaks were separated at $30^{\circ}C$. Lysozyme and ovalbumin were confirmed as first peak and third peak in four peaks respectively.
Lysozyme in egg white functions as bacteriolysis agent and ovalbumin plays a role as antigen in immune system. Egg white analysis methods usually include electrophoresis, gel permeation chromatography and reversed-phase HPLC(RP-HPLC). Among them, RP-HPLC was selected for rapid analysis and C18 column(Agilent, USA) was used as HPLC column. Optimum conditions were searched by changing mobile phase and temperature. Capacity factor and resolution were calculated and compared for various elution conditions. In the isocratic elution, mobile phase volume ratio was changed from 30/70/0.1 to 60/40/0.1(Acetonitrile(ACN)/Distilled water(DW)/Trifluoroacetic acid(TFA)). ACN composition was increased by 10% and temperature was set as $20^{\circ}C$. In the gradient elution, ACN/DW ratio was changed from 10/90 to 60/40 during 20 minute and temperature was varied as 20, 30 and $40^{\circ}C$. In the isocratic elution, three peaks were separated at 50/50/0.1. Lysozyme and ovalbumin were confirmed as first and third peak in three peaks respectively. In the gradient elution, four peaks were separated at $30^{\circ}C$. Lysozyme and ovalbumin were confirmed as first peak and third peak in four peaks respectively.
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문제 정의
난백의 분리를 위해 RP-HPLC를 사용하여 난백 내의 ovalbumin 과 lysozyme의 분석 특성을 알아보는 것을 목표로 실험을 수행하였다. 이동상의 조성을 등용매 용리로 변화를 주어 최적의 이동상 조건을 찾고 이 조건을 통해서 기울기 용리를 선택하여 난백을 분석하였다.
제안 방법
HPLC를 이용하여 용리방법에 따라 난백을 분석하였다. 등용매 용리에서 ACN/DW/TFA의 조성이 50/50/0.
기울기용리 실험도 마찬가지로 난백시료의 첫 번째 피크에서 lysozyme을 확인할 수 있었고 ovalbumin 표준품 피크는 시료의 세 번째 피크와 일치하였다. 그리고 크로마토그램을 피크별로 분석해보았다. Nau 등 [1이의 기울기 용리 실험에서는 C4 컬럼으로 난백시료의 농도 50g/L, 유량 1 ml/min, 샘플 주입량 20 μ L, UV detector의 파장을 280 nm로하고 ACN/DW/TFA 부피조성을 6분 동안 10/90/0.
6x250 mm, Agilent, USA)을 사용하였고 기울기 용리에서는 등용매 용리의펌프 대신 SP930D(Younglin, Korea) 2대와 gradient mixer(Gradient mixer, BIO-RAD, USA)가 사용되었다. 기울기 용리에서 온도변화를 주기 위해 column heater(HPLC column heater, BIO-RAD, US A)를사용하였다.
두 가지 용리 방법에서 좋은 분리도를 나타낸 등용매 용리와 기울기용리 조건에서 난백시료의 크로마토그램을 lysozyme과 ovalbumin 표준품과 비교해 보았다. Fig.
Eppendorf, Germany) 를 사용하였다. 등용매 용리를 위한 HPLC로 펌프 (Beckman 110B Solvent Delivery Module, Beckman, USA), 자외선 검출기 (783A, Applied Biosystems, USA), 데이터 수집 장치 (Autochro Data Module, Younglin, Korea), 데이터 수집 소프트웨어 (Autochro 2000, Younglin, Korea), C18 column(4.6x250 mm, Agilent, USA)을 사용하였고 기울기 용리에서는 등용매 용리의펌프 대신 SP930D(Younglin, Korea) 2대와 gradient mixer(Gradient mixer, BIO-RAD, USA)가 사용되었다. 기울기 용리에서 온도변화를 주기 위해 column heater(HPLC column heater, BIO-RAD, US A)를사용하였다.
등용매 용리에서 ACN의 부피조성에 따른 용량인자 값과 기울기용리에서 각 온도에 대한 용량인자 값을 구하기 위해 MTBE를 sample로 하여 t0를 구하였다. 등용매 용리에서 换, t°, k', 日의 값을 계산하여 Table 2에 나타내었고 기울기 용리에서 각 온도에 따른 tR, t0, k', Re 값을 Table 3 에 나타내었다.
이동상의 조성을 등용매 용리로 변화를 주어 최적의 이동상 조건을 찾고 이 조건을 통해서 기울기 용리를 선택하여 난백을 분석하였다. 그리고 기울기 용리에서 컬럼의 온도변화를 주어 온도에 따른 영향을 확인하였다.
Table 1의 조건에서 컬럼의 온도를 column heater (HPLC column heater, BIO-RAD, USA)를 사용.하여 20, 30, 40 oC 로 조절하였다.
22 gm 주사기 필터 (Advantec, Toyo, Japan), 이동상을 여과하기 위해 막 필터 (GVPP, Millipore, USA)를 사용하였다. 표준품으로는 lysozyme(Sigma, L6876-5G, USA), ovalbumin(Sigma, A5378-5G, USA)을 사용하였다. 그리고 불감 시간을 즉정하기 위해 Methyl tertiary butyl ether(J.
성능/효과
3에 나타내었다. (a)에서 3개의 피크를 확인하였으며 (b)에서는 (a)의 두 번째 피크와 세 번째 이후에 끌린 부분이 선명해지며 전체적으로 4 개의 피크가 확인되었으며 세 온도 조건 중 분리도가 가장 좋았다. (c)는 (b)의 그래프 개형과 비슷했지만 두 번째 피크와 네 번째 피크의 intensity가 감소하였으며 세 번째 피크의 intensity가 (c)의 세 번째 피크보다 증가하였다.
이는 단백질의 활성온도인 35 oC와비슷하여 적정온도에서 분리가 잘 된 것을 알 수 있다. 30 oC 일 때 크로마토그램에서의 표준품 비교에서 첫 번째 피크는 lysozyme, 세 번째 피크가 ovalbumin임을 알 수 있었다.
Fig. 6의 분리도 비교에서는 R12(첫 번째, 두 번째 피크에 대한 분리도)와 R23(두 번째, 세번째 피크에 대한 분리도)。] 50/50/0.1 이동상 조성에서 가장 큰 값을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 기울기 용리의 경우 Table 3에서 온도가 20 oC 에서 40 oC로 증가함에 따라 용량인자의 값이 감소함을 알 수 있었다.
기울기 용리에서는 20분의 구배 시간에 따라 이동상 조성이 서서히 변화되어 난백시료의 각 성분이 이동상에 따라 단계적으로 분리되었다. 그러므로 분석시간은 증가하였지만 등용매 용리에서 겹쳐졌던 피크가 기울기 용리에서는 추가적으로 분리되어 분리도가 높아졌음을 알 수 있었다.
이 조성에서 lysozyme, ovalbumin 표준품을 비교하여 크로마토그램의 첫 번째 피크에서 lysozyme, 세 번째 피크에서 ovalbumin을 확인할 수 있었다. 기울기 용리에서는 10/90~60/40의 이동상 구배범위로 20, 30, 40 oC의 온도변화를 준 결과 온도 조건 중 30 oC에서 분리도가 좋았다. 이는 단백질의 활성온도인 35 oC와비슷하여 적정온도에서 분리가 잘 된 것을 알 수 있다.
1 이동상 조건에서 분리도가 가장 큰 것을 확인할 수 있었다. 기울기 용리에서는 온도가 높을수록 이동상의 점성이 줄어듦에 따라 용출력이증가해 그 결과 용량인자 값이 감소함을 알 수 있었으며 온도조건 중 30 oC 에서 분리도 값이 가장 크게 나타났다.
있었다. 두 경우 모두 lysozyme 위치의 피크에서는 lysozyme 뿐만 아니라 ovomucoid, ovoinhibitor, ovoglobulins, ovoflavoprotein의 난백 단백질들이 포함된 것을 예상할 수 있었고 ovalbumine 강한 소수성으로 인하여 크로마토그램의 후반부에 용출됨을 알 수 있었다.
등용매 용리의 경우 ACN 부피조성이 증가할수록 이동상의 용 출력이 커져 용량인자 값이 감소하는 경향을 보였으며 50/50/0.1 이동상 조건에서 분리도가 가장 큰 것을 확인할 수 있었다. 기울기 용리에서는 온도가 높을수록 이동상의 점성이 줄어듦에 따라 용출력이증가해 그 결과 용량인자 값이 감소함을 알 수 있었으며 온도조건 중 30 oC 에서 분리도 값이 가장 크게 나타났다.
5(a) 에서 난백시료의 각 피크의 체류 시간이 2분 12초, 2분 30초, 2분 46초이었으며 표준품 lysozyme과 ovalbumin의 체류시간은 각각 2분 12초, 2분 50초이었다. 따라서 시료의 첫 번째 피크는 lysozyme, 세 번째 피크는 ovalbumin임을 확인할 수 있었다. Fig.
기울기 용리의 경우 Table 3에서 온도가 20 oC 에서 40 oC로 증가함에 따라 용량인자의 값이 감소함을 알 수 있었다. 용량인자를 통해 용출력은 30 oC와 40 oC가 거의 차이가 없었으며 Fig. 7의 분리도 비교에서 30 oC가 분리도가 가장 큰 값을 나타내어 30 oC가 최적조건임을 알 수 있었다.
1일 때 난백시료의 분리가 잘 되었다. 이 조성에서 lysozyme, ovalbumin 표준품을 비교하여 크로마토그램의 첫 번째 피크에서 lysozyme, 세 번째 피크에서 ovalbumin을 확인할 수 있었다. 기울기 용리에서는 10/90~60/40의 이동상 구배범위로 20, 30, 40 oC의 온도변화를 준 결과 온도 조건 중 30 oC에서 분리도가 좋았다.
05로 변화시켜 가면서 시료를 분석하였다. 크로마토그램에서 뚜렷한 일곱 개의 피크가 확인되었으며 lysozyme, ovotransferrin, ovalbumin, ovomucoid, avidin, ovoglobulins 표준품 피크와 비교해 본 결과 각 피크는 ovomucoid, ovoglobulins, lysozyme, avidin, ovotransferrin, ovalbumin, ovalbumin 순서로 확인되었다. 그 중 세 번째 피크가 lysozyme, 여섯 번째, 일곱 번째 피크가 ovalbumin이었다.
참고문헌 (11)
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