The aim of the present study is to investigate the anti-inflammatory effect of a Rice Bran Ethanol Extract (RBE). Inflammation, such as a bacterial infection in vivo metabolites, such as external stimuli or internal stimuli to the defense mechanisms of the biological tissue a variety of intracellula...
The aim of the present study is to investigate the anti-inflammatory effect of a Rice Bran Ethanol Extract (RBE). Inflammation, such as a bacterial infection in vivo metabolites, such as external stimuli or internal stimuli to the defense mechanisms of the biological tissue a variety of intracellular regulatory factors deulin inflammatory TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6, IL-8, such as proinflammatory cytokines, prostagrandin, lysosomal enzyme, free radicals are involved in a variety of mediators. The present study was designed to determine the effect of the RBE on pro-inflammatory factors such as NO, iNOS expression and TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6 in lipopolysaccharide (LPS) - stimulated RAW264.7 macrophages cells. The cell toxicity was determined by MTS assay. To evaluate of anti-inflammatory effect of RBE, amount of NO was measured using the NO detection kit and the iNOS expression was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). And proinflammatory cytokines were measured by ELISA kit. As a result, the RBE reduced NO, iNOS expression and TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6 production without cytotoxicity. Our results suggest that the RBE may have an anti-inflammatory property through suppressing inflammatory mediator productions and appears to be useful as an anti-inflammatory material.
The aim of the present study is to investigate the anti-inflammatory effect of a Rice Bran Ethanol Extract (RBE). Inflammation, such as a bacterial infection in vivo metabolites, such as external stimuli or internal stimuli to the defense mechanisms of the biological tissue a variety of intracellular regulatory factors deulin inflammatory TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6, IL-8, such as proinflammatory cytokines, prostagrandin, lysosomal enzyme, free radicals are involved in a variety of mediators. The present study was designed to determine the effect of the RBE on pro-inflammatory factors such as NO, iNOS expression and TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6 in lipopolysaccharide (LPS) - stimulated RAW264.7 macrophages cells. The cell toxicity was determined by MTS assay. To evaluate of anti-inflammatory effect of RBE, amount of NO was measured using the NO detection kit and the iNOS expression was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). And proinflammatory cytokines were measured by ELISA kit. As a result, the RBE reduced NO, iNOS expression and TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6 production without cytotoxicity. Our results suggest that the RBE may have an anti-inflammatory property through suppressing inflammatory mediator productions and appears to be useful as an anti-inflammatory material.
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문제 정의
이에 RAW264.7 세포에서 NO의 생성, iNOS의 발현정도와 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL1β, IL-6의 생성량 등을 조사하여 미강에탄올추출물의 항염성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
27) iNOS는 세포내에 존재하지 않으나 일단 자극에 의해 유도가 되면 NO를 생성하며 생성된 NO는 혈관확장, 세포독성, 조직손상과 같은 작용을 하며 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.28) LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포로부터 생성되는 NO 의 합성효소인 iNOS의 유전자 발현에 대한 Rice Bran Ethanol Extract의 효과를 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과(Fig.
1% Triton X-100), 250 µM dNTP, 1U Tag polymerase를 혼합한 후 denaturation을 위해 94℃에서 45초,annealing을 위해 55~60℃에서 45초 및 extension을 위해 72℃에서 60초 조건으로 30 cycles을 수행하였다. PCR 반응의 표준대조구로 GAPDH를 사용하였다(Table I). 이후 증폭된 DNA산물을 1.
RAW264.7 세포를 96 well plate에 1.0×105 cells/well이 되도록 분주하고 18시간 동안 배양한 후 Rice Bran Ethanol Extract를 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml 전 처리하고 1시간 후에 LPS 10 µg/ml 처리한 후 24시간 동안 배양하여 세포배양액을 얻은 다음 배양액에 함유된 TNF-α, IL-1β, IL-6을 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
RAW264.7 세포에서 발현되는 iNOS의 유전자발현에 대한 Rice Bran Ethanol Extract의 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행 하였다. 먼저 RAW264.
Rice Bran Ethanol Extract의 세포독성을 보기 위하여 RAW264.7 대식세포에 Rice Bran Ethanol Extract을 농도 의존적(10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml)으로 처리한 후 MTS assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다.
배양액과 동량의 Griess Reagent를 가하고 10분간 상온에서 반응시킨 후 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
7 세포만 배양한 대조군에서 NO의 농도는 매우 낮게 측정되었으며, LPS를 처리한 군에서 NO의 농도는 현저히 증가되었다. 그러나 Rice Bran Ethanol Extract을 처리한 실험군은 NO 생성이 유의성 있게 억제 되었으며, RAW264.7 세포를 LPS로 처리 시 iNOS 유전자가 발현되어 NO를 생성하게 되므로 iNOS 유전자 발현에 미치는 영향을 평가 하였다. LPS 처리시 iNOS 유전자 발현이 유의하게 증가 되었으나, Rice Bran Ethanol Extract을 전 처리한 실험군에서 iNOS 유전자의 발현이 감소하였다.
기능성소재로 활용할 수 있는 Rice Bran Ethanol Extract에 대한 항염성과 그 면역기전에 대한 기초적인 생리 활성을 측정하였다. 실험결과 실험에 사용된 Rice Bran Ethanol Extract은 세포독성을 나타내지 않았다.
, Japan)에서 도정하여 제공받은 즉시 시료로 사용하였다. 미강 100 g을 99.9% 에탄올 1 l를 가하여 40℃에서 4시간씩, 3회 추출한 후 회전진공농축(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)한 후, 동결건조하여 5.7 g의 미강추출물을 얻었다.
분리된 RNA를 QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
PCR 반응의 표준대조구로 GAPDH를 사용하였다(Table I). 이후 증폭된 DNA산물을 1.5% agarose gel를 사용하여 100 volt에서 30분간 전기영동하여 UV에서 관찰하였다.
합성된 cDNA 에 대한 PCR을 수행하기 위해 cDNA 1 µg에 Table I의 primers (sense, anti-sense) 1 µl 및 10×buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 µM dNTP, 1U Tag polymerase를 혼합한 후 denaturation을 위해 94℃에서 45초,annealing을 위해 55~60℃에서 45초 및 extension을 위해 72℃에서 60초 조건으로 30 cycles을 수행하였다.
대상 데이터
Total RNA를 분리시 Easy Blue®시약(iNtRON Biotechnology, Korea) 사용하였고, QuantiTect® Reverse Transcription Kit(Qiagen, USA)를 구입하여 cDNA를 합성에 사용하였다.
본 실험에 사용한 시료는 2009년 전남순천에서 생산된 일미벼를 2010년 8월 순천미곡처리장(MC-90A, Wakayama Co. Ltd., Japan)에서 도정하여 제공받은 즉시 시료로 사용하였다. 미강 100 g을 99.
세포 배양액인 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 과 fetal bovine serum(FBS), streptomycin-penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사(Grand Island, USA), Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA), Cell Titer 96® AQueous One Solution(MTS)은 Promega사(Madison, USA)에서 구입하여 사용하였다.
기능성소재로 활용할 수 있는 Rice Bran Ethanol Extract에 대한 항염성과 그 면역기전에 대한 기초적인 생리 활성을 측정하였다. 실험결과 실험에 사용된 Rice Bran Ethanol Extract은 세포독성을 나타내지 않았다. 세포 독성이 없음을 확인 한 후 LPS로 처리한 RAW264.
실험에 사용한 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM) 배지를 사용하였다.
데이터처리
실험결과는 평균±표준오차(Mean±S.E.)로 계산하였고, 각 군간의 유의성 검증은 students' t-test를 사용하였다.
이론/모형
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Wang 등20)의 방법에 따라 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. RAW264.
Rice Bran Ethanol Extract의 세포에 대한 독성은 Desai19) 등의 방법에 준하여 측정하였다. 세포 독성 측정은 5-(3- caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetrazolium inner salt(MTS) assay 방법으로 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTS 가 formazan으로 전환되는 것을 측정한다.
등의 방법에 준하여 측정하였다. 세포 독성 측정은 5-(3- caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetrazolium inner salt(MTS) assay 방법으로 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTS 가 formazan으로 전환되는 것을 측정한다. 96 well plate에 1.
염증성 사이토카인은 염증을 나타내는 중요한 지표로 Rice Bran Ethanol Extract이 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 RAW264.7 세포에 LPS 10 µg/ml 단독 처리 또는 LPS와 Rice Bran Ethanol Extract을 농도 의존적으로 처리한 후 배지에 생성된 TNF-α, IL1β, IL-6의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
성능/효과
1) 미강은 양질의 단백질과 식이섬유 및 각종비타민, 미네랄을 함유하고 있으며, phytic acid, γ-oryzanol, α-tocopherol, α-tocotrienol 과 같은 항산화물질 등 다양한 생리활성물질들을 가지고 있다.
IL-1β, IL-6의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 농도 의존적으로 감소하는 경향은 보였으나 유의성은 없었다.
7 세포를 LPS로 처리 시 iNOS 유전자가 발현되어 NO를 생성하게 되므로 iNOS 유전자 발현에 미치는 영향을 평가 하였다. LPS 처리시 iNOS 유전자 발현이 유의하게 증가 되었으나, Rice Bran Ethanol Extract을 전 처리한 실험군에서 iNOS 유전자의 발현이 감소하였다. Rice Bran Ethanol Extract에 의한 iNOS 유전자의 발현 억제는 NO 생성억제를 유도하였음을 의미한다.
LPS에 의해 유도되는 IL-1β, IL-6의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과(Fig. 5, 6), 농도 의존적으로 감소하는 경향은 보였으나 유의성은 없었다.
LPS에 의해 유도되는 TNF-α 생성에 미치는 영향을 조사한 결과(Fig. 4), 농도 의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었으며 특히 1000 µg/ml 에서는 유의한 수준이었다.
Proinflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 LPS를 처리한 군에서 TNF-α의 분비가 현저하게 증가되었으나 Rice Bran Ethanol Extract를 처리한 군에서는 유의한 억제를 나타냈다.
Results of the experiments were the mean values of three independent experiments (SD=bars) and asterisks indicate the significant differences (*: p<0.05 compared to LPS).
Results of the experiments were the mean values of three independent experiments and asterisks indicate the significant differences (*: p<0.05 compared to LPS; **: p<0.01 compared to LPS).
Results of three independent experiments were averaged mean value of three independent experiments (SD=bars), and asterisks indicate significantly different from treatment with LPS alone (*: p<0.05 compared to LPS).
Rice Bran Ethanol Extract을 처리한 실험군은 농도 의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었으며 1000 µg/ml에서 유의한 억제를 보였다.
그 결과(Fig. 3), RAW264.7 세포만 배양한 대조군에서는 iNOS의 유전자발현이 나타나지 않았으나 LPS 10 µg/ml를 처리한 군에서는 iNOS의 유전자 발현이 대조군에 비하여 현저히 증가하였다.
실험결과 실험에 사용된 Rice Bran Ethanol Extract은 세포독성을 나타내지 않았다. 세포 독성이 없음을 확인 한 후 LPS로 처리한 RAW264.7 세포에서 Rice Bran Ethanol Extract 의 NO 생성억제를 평가한 결과 RAW264.7 세포만 배양한 대조군에서 NO의 농도는 매우 낮게 측정되었으며, LPS를 처리한 군에서 NO의 농도는 현저히 증가되었다. 그러나 Rice Bran Ethanol Extract을 처리한 실험군은 NO 생성이 유의성 있게 억제 되었으며, RAW264.
7 대식세포에 Rice Bran Ethanol Extract을 농도 의존적(10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml)으로 처리한 후 MTS assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다. 실험 결과 cell viability 가 101.8%, 102.4%, 102.7%, 106.7%로 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 1). 이는 Rice Bran Ethanol Extract이 보여주는 항염 효과가 세포 생존율의 감소가 아닌 시료의 약리활성으로 사료된다.
염증 유발물질로 사용되는 LPS를 이용하여 RAW264.7 세포의 NO 생성에 대한 Rice Bran Ethanol Extract의 효과를 측정한 결과(Fig. 2), RAW264.7 세포만 배양한 대조군에서 NO의 농도는 매우 낮게 측정되었으나, LPS를 처리한 군에서 NO의 농도는 현저히 증가되었다. Rice Bran Ethanol Extract을 처리한 실험군은 농도 의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었으며 1000 µg/ml에서 유의한 억제를 보였다.
7세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성억제, iNOS 유전자의 발현을 억제시켰으며, proinflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비량도 억제시켰다. 이러한 실험 결과들은 기능성소재로 사용되고 있는 Rice Bran Ethanol Extract의 항염성과 그 면역기전에 대한 기초적인 생리 활성을 객관적으로 입증한 것으로 사료된다.
이상과 같은 결과로 Rice Bran Ethanol Extract은 RAW264.7세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성억제, iNOS 유전자의 발현을 억제시켰으며, proinflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비량도 억제시켰다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
미강이란?
쌀(Oryza sativa L.)은 우리나라의 주곡 작물로 인체활동에 필요한 다양한 영양분을 공급하며, 미강은 현미를 백미로 도정할때 얻어지는 부산물로 쌀의 영양분 95%를 가지고 있다.1) 미강은 양질의 단백질과 식이섬유 및 각종비타민, 미네랄을 함유하고 있으며, phytic acid, γ-oryzanol, α-tocopherol, α-tocotrienol 과 같은 항산화물질 등 다양한 생리활성물질들을 가지고 있다.
미강은 어떤 성분들을 가지고 있는가?
)은 우리나라의 주곡 작물로 인체활동에 필요한 다양한 영양분을 공급하며, 미강은 현미를 백미로 도정할때 얻어지는 부산물로 쌀의 영양분 95%를 가지고 있다.1) 미강은 양질의 단백질과 식이섬유 및 각종비타민, 미네랄을 함유하고 있으며, phytic acid, γ-oryzanol, α-tocopherol, α-tocotrienol 과 같은 항산화물질 등 다양한 생리활성물질들을 가지고 있다.2)이들 성분들은 혈중 콜레스테롤을 저하시켜 만성질환의 예방에 효과가 있음을 보고되었으며,3) HepG2 간암세포주와 자궁경부암 세포주에서 tocotrienol이 암세포 증식을 억제하여 항암활성을 나타내었으며,4) 항산화효과5,6)와 혈압상승억제 효과7,8) 등 다양한 생리적 기능에 대한 연구가 보고되어왔다.
마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 어디에서 배양하였는가?
7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM) 배지를 사용하였다. 세포는 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
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