[논문]다양한 페놀성 물질과 Folin-Ciocalteu 시약의 반응성에 미치는 영향 요인 평가

홍정일; 김현정; 김지윤

doi:10.3746/jkfn.2011.40.2.205

[국내논문] 다양한 페놀성 물질과 Folin-Ciocalteu 시약의 반응성에 미치는 영향 요인 평가
Factors Affecting Reactivity of Various Phenolic Compounds with the Folin-Ciocalteu Reagent 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.40 no.2, 2011년, pp.205 - 213

홍정일 (서울여자대학교 식품과학부) , 김현정 (서울여자대학교 식품과학부) , 김지윤 (서울여자대학교 식품과학부)

초록
AI-Helper

본 연구에서는 F-C시약을 이용한 페놀성 물질의 정량방법에서 다양한 종류의 페놀성 성분들의 반응특성 및 반응영향요인들을 분석하였다. 정량방법 중 $Na_2CO_3$를 선처리는 F-C시약을 먼저 처리하는 방법에 비해 대부분 페놀성 물질들의 발색반응도 감소를 야기하였으며, 특히 -OH 밀도가 높은 galloyl group을 가진 gallic acid 및 EGCG 등의 성분이 두드러진 감소를 나타내었다. F-C시약과 $Na_2CO_3$를 동시에 처리하는 경우 F-C시약을 선처리 하는 경우에 비해 각 페놀성 물질의 반응성이 약간 감소되는 경향을 나타내었다. 그 원인은 페놀성 물질들이 산성인 F-C시약에서보다 $Na_2CO_3$ 용액의 알칼리 환경에서 화학적으로 불안정하기 때문이며, pH 7.4 및 9의 환경에서 페놀성 물질로부터 생성된 산화물들은 F-C시약과의 반응성이 약화됨을 확인하였다. 이 과정중에 같이 형성된 $H_2O_2$는 F-C와의 반응에 직접적인 영향을 미치지 않았다. FeA와 SiA와 같은 monophenol류는 방법의 차이에 따라 큰 반응성의 변화를 나타내지 않았으며, 발색도는 느리지만 꾸준히 증가하는 kinetics 패턴을 보였다. 실제 시료에의 적용을 위해 연잎 추출물을 제조하고 각 정량방법에 대한 반응도 차이를 조사한 결과, 역시 $Na_2CO_3$ 처리환경에서 현저한 발색반응도 저하를 나타내었다. 보다 정확한 페놀성 물질의 정량을 위해 적절한 표준물질의 선택 및 정량 방법 등에 대한 표준화가 필요할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The Folin-Ciocalteu (F-C) reagent has been extensively used for quantifying total phenolic contents in many different types of food materials. Since several different procedures of the assay methods using the F-C reagent have been applied, we investigated changes in reactivity of various phenolic compounds with the F-C reagent under three different assay conditions and factors affecting reactivity. Among 10 standard compounds tested, compounds with high hydroxyl density (number of -OH/molecular weight) showed a largely different response according to addition sequence of the F-C reagent or $Na_2CO_3$. Preincubation in $Na_2CO_3$ significantly reduced the reactivity of the phenolic compounds bearing galloyl moiety (e.g. gallic acid, tannic acid, and epigallocatechin-3-gallate) with the F-C reagent, while monophenol compounds including ferulic acid and sinapinic acid were more stable as compared to diphenols. There was little change in response to the F-C reagent of all phenolic compounds incubated in acidic pH; their reactivity except ferulic acid was reduced significantly when incubated in neutral or alkaline pH. Changes in reactivity of gallic acid incubated in $Na_2CO_3$ or neutral/alkaline pH conditions were the most prominent. $H_2O_2$ generated from phenolic compounds did not affect the reaction with the F-C reagents. The present results suggest that reactivity of different phenolic compounds with F-C reagent was affected considerably by different procedures of the assay, and the total phenolic contents could be fluctuated according to standard compounds and assay scheme.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 F-C시약을 이용한 페놀성 물질의 정량방법에서 다양한 종류의 페놀성 성분들의 반응특성 및 반응영향요인들을 분석하였다. 정량방법 중 Na₂CO₃를 선처리는 F-C시약을 먼저 처리하는 방법에 비해 대부분 페놀성 물질들의 발색반응도 감소를 야기하였으며, 특히 -OH 밀도가 높은 galloyl group을 가진 gallic acid 및 EGCG 등의 성분이 두드러진 감소를 나타내었다.
F-C시약을 이용한 정량은 페놀성 물질이 공통적으로 가지고 있는 이러한 환원성 성질을 이용한 것이다. 본 연구에서는 기존에 보고된 서로 다른 정량 방법 하에서 다양한 구조의 페놀성 물질에 대한 반응성 변화를 조사하였다. 사용된 물질은 페놀산 구조로서 하나의 -OH를 가진 ferulic acid (FeA)와 sinapinic acid(SiA), 2개의 -OH를 가진 caffeic acid(CaA)와 DHC, 3개의 -OH를 가진 페놀성 물질의 표준 물질로 가장 널리 이용되는 gallic acid(GA)와 그 중합체인 tannic acid(TA), flavonoid류로서 flavan 3-ol 형태의 (+)-catechine(Ctc)과 EGCG, flavonol류의 quercetin(Qct)이었다(Fig.
지금까지 F-C시약을 이용한 페놀물질의 정량에 있어서 다양한 간섭물질과 요인들이 연구된 바 있으나, 연구자들에 의해 변형된 다양한 정량방법 간에 페놀성 물질들이 나타내는 반응성의 차이에 대해서는 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 총 페놀성 물질에 대해 신속하게 다량의 시료를 정량할 수 있는 microplate법을 응용하여(18), gallic acid를 포함한 10여종 페놀성 물질들의 각 조건 하에서 반응성 차이 및 반응영향인자 등을 조사하였고, 시료 중의 페놀물질 정량 시오차를 줄이기 위한 적정 처리방법 및 표준물질의 조건 등에 대한 관련 자료를 제시하고자 하였다.

제안 방법

Reaction kinetics of different phenolic compounds under Folin-Dennis analysis. Each phenolic compound was analyzed by the Method 1 and time-dependent color development was monitored. Based on abs.
F-C시약을 이용한 총 폴리페놀 함량 정량방법으로 선행 연구 또는 식품첨가물 공전 등에서 빈번하게 차이를 보이는 F-C시약과 Na₂CO₃용액의 처리순서 및 시간에 따라 다음 3가지의 scheme으로 나누어 측정하였다. Method 1(F-C시약 선처리 방법)(8,10,20,21): 증류수 또는 pH 완충용액에 녹인 시료 80μL에 50% F-C시약 20μL을 첨가하여 5분간 방치한 후, 2% Na₂CO₃용액 100μL을 가하였다.
Method 1(F-C시약 선처리 방법)(8,10,20,21): 증류수 또는 pH 완충용액에 녹인 시료 80μL에 50% F-C시약 20μL을 첨가하여 5분간 방치한 후, 2% Na2CO3용액 100μL을 가하였다.
Method 1과 2의 정량법에서 페놀성 물질들의 반응성 차이는 F-C시약의 강산성 및 Na₂CO₃용액의 강알칼리 조건의 서로 다른 pH에 노출되었을 때의 화학안정성 차이에 근거한 것으로 판단되어, 각 물질의 pH별 저장시간에 따른 발색반응도 변화를 분석하였다. 각 페놀성 물질들을 pH 3, citrate buffer에 저장한 후 총 페놀량을 Method 1에 의해 분석한 결과, 24시간 저장시간 내에 반응성 변화는 거의 나타나지 않았다(Fig.
Method 3(F-C 시약/ Na2CO3 동시처리 방법)(27-31): 각 시료 80 μL에 50% F-C시약 20 μL를 가한 후 즉시 100 μL 2% Na2CO3 용액을 차례로 첨가하거나(Method 3.1), 2% Na2CO3용액과 50% F-C시약을 위의 비율대로 혼합 후 시료 80μL에 첨가하여(Method 3.2), 각각 상온에서 30분간 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다.
각 표준물질을 0.1 M pH 3 citrate buffer, 0.1 M pH 7.4 phosphate buffer 및 0.1 M pH 9 Tris buffer에 녹여 37℃에서 시간을 달리하여 저장 후, 위에 기술한 각각의 정량 방법에 따라 반응성을 측정하였다. 이때 물질들의 산화정도는 405 nm에서의 갈색화합물의 생성도로 측정하였다.
이는 페놀성 물질들이 Method 1과 2의 반응조건에서 각각 강산성 또는 강알칼리 조건에 일정시간 노출된다는 것을 의미하며, 이 과정 중에 페놀성 물질의 다양한 화학적 변화가 초래되어 전체적인 반응도에 영향을 미칠 것으로 예상되었다. 따라서 F-C시약이나 Na₂CO₃를 시료에 첨가한 후 다양한 incubation 시간들을 적용하고, 각종 페놀성 물질들의 반응성 변화를 조사하였다.
Folin-Dennis 정량에서 청자색의 발색은 비교적 알칼리 조건에서 페놀성 물질에 의한 F-C시약의 phosphomolybdic/phosphotungstic acid complex로의 전자공여에 의해 나타난다. 따라서 페놀성 물질의 전자공여 패턴에 따라 발색양상에 차이가 날 것으로 예상되어, 시간별 청자색 발색의 kinetics를 조사하였다. Fig.
하지만 상당수의 문헌에서 변화된 방법들이 보고되고 있는데 대표적인 차이를 보이는 것이 Na₂CO₃용액을 시료와 먼저 혼합하여 균질화하고 일정시간 후 F-C시약을 처리하는 방법(Method 2; 7,22-26)이고, 또는 F-C시약과 Na₂CO₃를 동시에 처리하는 방법들(Method 3; 27-31)도 발견되고 있다. 본 연구에서는 이상의 방법들을 응용한 F-C시약과 Na₂CO₃간 첨가순서에 차이를 두어 각종 페놀성 물질들의 반응성 차이를 조사하였고 그 결과를 Table 1과 Fig. 2에 나타내었다. F-C시약 선처리 방법(Method 1)을 적용하였을 경우, EGCG가 가장 높은 시료무게당 발색도(slope 1)를 보였으며 CaA와 GA도 상대적으로 높은 반응성을 나타내었다(시료 무게당 반응발색도 slope 기준).
서로 다른 scheme의 Folin-Dennis 정량방법이 실제 추출물 시료에서 어떠한 차이를 나타내는가 알아보기 위하여, 연잎 열수 추출물을 제조하여 조사하였다. F-C시약을 선처리하는 Method 1에 의한 결과는 Na₂CO₃를 먼저 처리하는 Method 2에 비해 40% 정도 높은 발색반응도를 나타내었으며, 동시에 처리하는 경우에 F-C시약에 이어 바로 Na₂CO₃를 처리하는 경우가 섞어 처리하는 경우보다 반응성이 컸다 (Fig.
우선 Method 1 방법에 따라 F-C시약을 먼저 첨가하고 3분부터 120분까지 incubation한 후 Na₂CO₃용액을 반응시켜 각 물질의 반응성 변화를 측정하였다. FeA나 DHC는 60분, 120 분으로 F-C시약과의 반응시간을 연장시켰을 때 10% 이내에서 반응성이 약간 감소하였으며, GA나 TA에서는 반응시간에 따른 유의적 차이는 나타나지 않았다(Fig.
한편 페놀성 물질의 특성상 산성에서는 비교적 안정하여 F-C시약 자체에 의한 반응성은 크게 변하지 않는 것으로 나타났다. 이와 같이 Method 2의 조건에서는Na₂CO₃와의 우선적인 조우에 의해 강알칼리 환경이 조성되고 따라서 ring 구조물들의 다양한 modification이 발생할 것으로 예상되는 바, ring 구조상 methoxy group을 가진 비페놀성 물질에서 methoxy group의 유리에 의한 F-C 시약과 반응할 수 있는 페놀성 물질로의 전환 여부를 조사하였다. Method 2에 따라 CiA와 그 유도체인 methoxy CiA, dimethoxy 및 trimethoxy CiA에 Na₂CO₃용액을 선처리 한 후 F-C시약과의 반응성을 측정한 결과, 청자색으로의 발색은 거의 나타나지 않았으며 농도에 따른 증가현상도 없었다 (Fig.
2), 각각 상온에서 30분간 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. 한편 Na₂CO₃용액과 F-C시약의 첨가시간 차이가 시료의 반응성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 각 시약과 표준시료를 먼저 혼합하여 시간을 달리하여 저장하고, F-C시약 또는 Na₂CO₃을 해당 반응혼합물에 가하여 30분간 반응시킨 후, 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 반응조건에서의 pH는 Thermo Orion pH meter(420A, Beverly, MA, USA)로 측정하였다.
이때 물질들의 산화정도는 405 nm에서의 갈색화합물의 생성도로 측정하였다. 한편 pH 7.4 phosphate buffer에서 24시간 저장한 시료에 15 unit/mL superoxide dismutase(SOD)와 30 unit/mL catalase를 첨가하고, 동일한 조건에서 SOD/catalase를 첨가하지 않은 시료 와의 반응성 차이를 Method 1에 의해 측정하였다.
1). 한편 비페놀성 물질로서 cinnamic acid(CiA)와 methoxy cinamic acid류 등의 반응성도 조사하였다.
한편 폴리페놀성 물질의 산화에 의해서 H2O2를 비롯한 활성산소종이 발생하는데, 본 실험에서도 pH 7.4에서 24시간 저장 시 400μM CaA와 FeA는 약 50～60 μM, 100 μM EGCG로부터는 약 100 μM의 H2O2가 생성됨을 확인하였고(data not shown), 생성된 H2O2가 F-C시약과의 반응성에 미치는 영향을 조사하였다.

대상 데이터

, Yangju, Korea)에 저장하여 사용하였다. 미지시료로 사용된 연잎 열수 추출물은 전보의 보고에 따라 제조하였다(19). 이외에 사용된 시약은 Sigma-Aldrich 제품 및 일반특급시약을 사용하였다.
본 연구에서는 기존에 보고된 서로 다른 정량 방법 하에서 다양한 구조의 페놀성 물질에 대한 반응성 변화를 조사하였다. 사용된 물질은 페놀산 구조로서 하나의 -OH를 가진 ferulic acid (FeA)와 sinapinic acid(SiA), 2개의 -OH를 가진 caffeic acid(CaA)와 DHC, 3개의 -OH를 가진 페놀성 물질의 표준 물질로 가장 널리 이용되는 gallic acid(GA)와 그 중합체인 tannic acid(TA), flavonoid류로서 flavan 3-ol 형태의 (+)-catechine(Ctc)과 EGCG, flavonol류의 quercetin(Qct)이었다(Fig. 1). 한편 비페놀성 물질로서 cinnamic acid(CiA)와 methoxy cinamic acid류 등의 반응성도 조사하였다.

데이터처리

Different letters indicate a significant difference (p<0.01) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test.
모든 측정값은 3회 이상 분석하여 평균±표준편차로 나타내었고, 실험결과 간의 유의차 분석은 Student’s t-test 또는 One-way ANOVA와 Tukey’s HSD test를 실시하여 99%의 유의수준에서 검정하였다.

이론/모형

6. Effects of H₂O₂ and EDTA on reactivity of different phenolic compounds in Folin-Dennis assay. The phenolic compounds were incubated in pH 7.

성능/효과

서로 다른 scheme의 Folin-Dennis 정량방법이 실제 추출물 시료에서 어떠한 차이를 나타내는가 알아보기 위하여, 연잎 열수 추출물을 제조하여 조사하였다. F-C시약을 선처리하는 Method 1에 의한 결과는 Na₂CO₃를 먼저 처리하는 Method 2에 비해 40% 정도 높은 발색반응도를 나타내었으며, 동시에 처리하는 경우에 F-C시약에 이어 바로 Na₂CO₃를 처리하는 경우가 섞어 처리하는 경우보다 반응성이 컸다 (Fig. 8A). 한편 F-C시약 또는 Na₂CO₃용액을 가한 후 60분까지 처리시간을 달리하여 연잎 시료의 발색도 변화를 본 결과, F-C시약의 처리시간에 따른 반응성의 차이는 없었으나, Na₂CO₃ 용액을 먼저 처리한 시료에 있어서는 즉시 현저 하게 반응성을 상실하였으며, 시간의 경과에 따라 발색도가 낮아지는 경향을 나타내었다(Fig.
용액을 반응시켜 각 물질의 반응성 변화를 측정하였다. FeA나 DHC는 60분, 120 분으로 F-C시약과의 반응시간을 연장시켰을 때 10% 이내에서 반응성이 약간 감소하였으며, GA나 TA에서는 반응시간에 따른 유의적 차이는 나타나지 않았다(Fig. 4B). 하지만 Method 2에 의한 Na₂CO₃를 먼저 첨가하는 조건에서, 대부분 페놀성 물질들은 Na₂CO₃의 처리시간 증가에 따라 현저하게 발색반응도가 감소하였으며, 특히 GA와 TA의 감소가 두드러졌다.
이 과정 중에 같이 형성된 H₂O₂는 F-C와의 반응에 직접적인 영향을 미치지 않았다. FeA와 SiA와 같은 monophenol류는 방법의 차이에 따라 큰 반응성의 변화를 나타내지 않았으며, 발색도는 느리지만 꾸준히 증가하는 kinetics 패턴을 보였다. 실제 시료에의 적용을 위해 연잎 추출물을 제조하고 각 정량방법에 대한 반응도 차이를 조사한 결과, 역시 Na₂CO₃ 처리환경에서 현저한 발색반응도 저하를 나타내었다.
7A는 Method 1의 정량조건에서 각 페놀성 물질에 대한 시간별 청자색 발색도의 변화를 각물질에 대해 120분간 반응 시 발색도를 1로 기준한 상대적 수치로 나타낸 것이다. GA, TA 및 EGCG 등의 galloyl group을 가진 물질들이 10분 이내에 신속한 발색을 나타낸 반면, Qct과 SiA, CaA, DHC 등의 phenolic acid류는 상대적으로 초기발색반응이 더디게 나타났다(Fig. 7A). 반응시간을 구간별로 나누어 발색진행도를 비교한 결과, SiA와 FeA는 60～120분 사이에도 상당한 반응성을 나타내어 초기 5～10분 사이 반응속도의 약 30～40%를 유지하며 꾸준하게 진행됨을 알 수 있었다.
이와 같이 Method 2의 조건에서는Na₂CO₃와의 우선적인 조우에 의해 강알칼리 환경이 조성되고 따라서 ring 구조물들의 다양한 modification이 발생할 것으로 예상되는 바, ring 구조상 methoxy group을 가진 비페놀성 물질에서 methoxy group의 유리에 의한 F-C 시약과 반응할 수 있는 페놀성 물질로의 전환 여부를 조사하였다. Method 2에 따라 CiA와 그 유도체인 methoxy CiA, dimethoxy 및 trimethoxy CiA에 Na₂CO₃용액을 선처리 한 후 F-C시약과의 반응성을 측정한 결과, 청자색으로의 발색은 거의 나타나지 않았으며 농도에 따른 증가현상도 없었다 (Fig. 4D). 따라서 Method 2의 조건에서 비페놀성 CiA유도체들의 변형에 의한 페놀성 화합물로의 전환은 일어나지 않는 것으로 보인다.
4 정도를 나타내었다. Na₂CO₃(2%)용액은 강알칼리 조건을 조성하여 증류수 상의 시료와 혼합 시 pH 11.5 정도가 되었으며, 최종적으로 시료, F-C시약, Na₂CO₃가 모두 첨가된 후의 pH는 약 7이었다 (Fig. 4A). 이는 페놀성 물질들이 Method 1과 2의 반응조건에서 각각 강산성 또는 강알칼리 조건에 일정시간 노출된다는 것을 의미하며, 이 과정 중에 페놀성 물질의 다양한 화학적 변화가 초래되어 전체적인 반응도에 영향을 미칠 것으로 예상되었다.
분자내 ring구조의 -OH기수를 분자량으로 나눈 hydroxyl No. density와 시료 무게당 발색반응성(slope) 간의 상관관계를 분석해 보았을 때, Method 1에 의한 회귀상수는 0.564 정도로 약한 양의 상관관계를 보였으나, Method 2에 의한 분석에서는 -0.867(Qct 제외)로 비교적 높은 부의 상관관계를 나타내었다(Fig. 3). 이 결과는 Method 2를 적용했을 때 분자상의 -OH 밀도의 증가에 따라 반응성이 감소하여 이들을 표준물질로 사용할 경우 시료 중 페놀함량이 높게 나타날 수 있으며, 시료 중에 이와 같은 물질들이 많이 함유된 경우 상대적으로 저평가될 수 있음을 의미한다.
5A). 각 물질들을 pH 7.4, phosphate buffer에 저장하였을 때, 4시간 이내 저장시료에서 발색반응성의 급격한 변화는 나타나지 않았으며, EGCG와 GA의 발색도는 각각 19 및 23% 감소하였다. 하지만 8시간 저장시료에서는 현저한 변화를 보여 GA와 DHC는 각각 80와 57% 발색도가 저하되었으며, EGCG와 CaA도 40% 가량의 감소를 보였다 (Fig.
용액의 강알칼리 조건의 서로 다른 pH에 노출되었을 때의 화학안정성 차이에 근거한 것으로 판단되어, 각 물질의 pH별 저장시간에 따른 발색반응도 변화를 분석하였다. 각 페놀성 물질들을 pH 3, citrate buffer에 저장한 후 총 페놀량을 Method 1에 의해 분석한 결과, 24시간 저장시간 내에 반응성 변화는 거의 나타나지 않았다(Fig. 5A). 각 물질들을 pH 7.
구조상으로 볼 때 FeA와 SiA 등 monophenol류는 정량방법에 따른 반응성의 차이를 거의 보이지 않았으나, ring에 -OH의 밀도가 높은 galloyl group을 가진 물질들이 비교적 차이를 나타내었다. 분자내 ring구조의 -OH기수를 분자량으로 나눈 hydroxyl No.
일반적으로 페놀성 물질, 특히 폴리페놀성 물질들의 산화에 의해서 갈색의 산화물들이 생성되는 것으로 알려져 있는데(32), 이를 확인하기 위하여 각 시료물질의 산화과정의 진행을 405 nm에서 흡광도로 측정하였다. 그 결과, pH 3에서 저장한 시료에서는 갈색도의 증가를 나타내지 않아 산화가 진행되지 않은 것으로 사료되며(data not shown), pH 7.4에서는 FeA를 제외한 모든 물질에 있어서 갈색도가 증가하였고, 특히 GA, EGCG 및 TA가 현저한 증가를 보였다(Fig. 5D).
F-C시약과 Na₂CO₃를 동시에 처리하는 경우 F-C시약을 선처리하는 경우에 비해 각 페놀성 물질의 반응성이 약간 감소되는 경향을 나타내었다. 그 원인은 페놀성 물질들이 산성인 F-C시약에서보다 Na₂CO₃ 용액의 알칼리 환경에서 화학적으로 불안정하기 때문이며, pH 7.4 및 9의 환경에서 페놀성 물질로부터 생성된 산화물들은 F-C시약과의 반응성이 약화됨을 확인하였다. 이 과정 중에 같이 형성된 H₂O₂는 F-C와의 반응에 직접적인 영향을 미치지 않았다.
7A). 반응시간을 구간별로 나누어 발색진행도를 비교한 결과, SiA와 FeA는 60～120분 사이에도 상당한 반응성을 나타내어 초기 5～10분 사이 반응속도의 약 30～40%를 유지하며 꾸준하게 진행됨을 알 수 있었다. 반면 다른 시료들은 60분 이내에 대부분의 발색이 진행되며 이후의 반응은 미미한 것으로 나타났다(Fig.
용액과 반응 중 만나게 된다. 사용된 50%(1 N) F-C시약은 pH 1 이하의 강한 산성이었으며, 본실험조건에서 각 시료의 첨가 시 pH 1.4 정도를 나타내었다. Na₂CO₃(2%)용액은 강알칼리 조건을 조성하여 증류수 상의 시료와 혼합 시 pH 11.
FeA와 SiA와 같은 monophenol류는 방법의 차이에 따라 큰 반응성의 변화를 나타내지 않았으며, 발색도는 느리지만 꾸준히 증가하는 kinetics 패턴을 보였다. 실제 시료에의 적용을 위해 연잎 추출물을 제조하고 각 정량방법에 대한 반응도 차이를 조사한 결과, 역시 Na₂CO₃ 처리환경에서 현저한 발색반응도 저하를 나타내었다. 보다 정확한 페놀성 물질의 정량을 위해 적절한 표준물질의 선택 및 정량 방법 등에 대한 표준화가 필요할 것으로 사료된다.
3). 이 결과는 Method 2를 적용했을 때 분자상의 -OH 밀도의 증가에 따라 반응성이 감소하여 이들을 표준물질로 사용할 경우 시료 중 페놀함량이 높게 나타날 수 있으며, 시료 중에 이와 같은 물질들이 많이 함유된 경우 상대적으로 저평가될 수 있음을 의미한다.
FeA는 8시간 저장 시 오히려 15% 정도 색도가 증가하였으나 24시간 저장 시까지 큰 변화를 나타내지 않았다. 이들을 pH 9, Tris buffer에 저장하였을 때, FeA를 제외한 대부분의 시료에서 4시간 이내에 급격한 반응성 감소현상을 보였으며 GA의 변화가 가장 현저하게 나타났다(Fig. 5C). 하지만 이들의 발색도는 저장시간에 따라 지속적으로 감소하지는 않았으며, 시료에 따라 감소와 증가를 보이는 유동적 결과를 나타내었다.
7B). 이상의 결과는 각 페놀성 물질의 pH별 안정도와 관련이 있는 것으로 사료되며, 중성 이상의 pH 조건에서 비교적 안정한 monophenol류 물질은 반응이 느리지만 꾸준히 진행되는 양상을 보이는 반면, galloyl group을 함유한 화합물의 경우 신속하게 반응이 일어나고 쉽게 불안정화 되는 것으로 보인다.
4C). 이상의 결과에서 Na₂CO₃의 선첨가 및 반응시간의 연장에 의해 대다수 페놀성 물질들의 반응성이 현저하게 저하되는 것을 알 수 있으며, 이는 Na₂CO₃와 반응 시 강알칼리 조건에서 페놀성 물질들의 화학안정성이 감소되기 때문으로 보인다. 특히 ring 구조상 ortho-diphenol이나 galloyl moiety를 가진 물질은 Na₂CO₃존재 하에 빠른 속도로 산화되어, F-C시약과의 반응성이 약한 quinone류 등의 산화물을 생성하는 것으로 사료된다.
본 연구에서는 F-C시약을 이용한 페놀성 물질의 정량방법에서 다양한 종류의 페놀성 성분들의 반응특성 및 반응영향요인들을 분석하였다. 정량방법 중 Na₂CO₃를 선처리는 F-C시약을 먼저 처리하는 방법에 비해 대부분 페놀성 물질들의 발색반응도 감소를 야기하였으며, 특히 -OH 밀도가 높은 galloyl group을 가진 gallic acid 및 EGCG 등의 성분이 두드러진 감소를 나타내었다. F-C시약과 Na₂CO₃를 동시에 처리하는 경우 F-C시약을 선처리하는 경우에 비해 각 페놀성 물질의 반응성이 약간 감소되는 경향을 나타내었다.
4, phosphate buffer에 저장하였을 때, 4시간 이내 저장시료에서 발색반응성의 급격한 변화는 나타나지 않았으며, EGCG와 GA의 발색도는 각각 19 및 23% 감소하였다. 하지만 8시간 저장시료에서는 현저한 변화를 보여 GA와 DHC는 각각 80와 57% 발색도가 저하되었으며, EGCG와 CaA도 40% 가량의 감소를 보였다 (Fig. 5B). FeA는 8시간 저장 시 오히려 15% 정도 색도가 증가하였으나 24시간 저장 시까지 큰 변화를 나타내지 않았다.
8A). 한편 F-C시약 또는 Na₂CO₃용액을 가한 후 60분까지 처리시간을 달리하여 연잎 시료의 발색도 변화를 본 결과, F-C시약의 처리시간에 따른 반응성의 차이는 없었으나, Na₂CO₃ 용액을 먼저 처리한 시료에 있어서는 즉시 현저 하게 반응성을 상실하였으며, 시간의 경과에 따라 발색도가 낮아지는 경향을 나타내었다(Fig. 8B). 이는 연잎 중 상당량의 페놀성 물질들이 Na₂CO₃에 노출되는 즉시 파괴되어 F-C 시약과의 반응성을 상실했기 때문이며, Method 1과 Method 2 사이의 반응성 차이가 큰 시료일수록 ring의 -OH의 밀도가 높은 화합물이 많이 포함된 시료로 예측된다.
특히 ring 구조상 ortho-diphenol이나 galloyl moiety를 가진 물질은 Na₂CO₃존재 하에 빠른 속도로 산화되어, F-C시약과의 반응성이 약한 quinone류 등의 산화물을 생성하는 것으로 사료된다. 한편 페놀성 물질의 특성상 산성에서는 비교적 안정하여 F-C시약 자체에 의한 반응성은 크게 변하지 않는 것으로 나타났다. 이와 같이 Method 2의 조건에서는Na₂CO₃와의 우선적인 조우에 의해 강알칼리 환경이 조성되고 따라서 ring 구조물들의 다양한 modification이 발생할 것으로 예상되는 바, ring 구조상 methoxy group을 가진 비페놀성 물질에서 methoxy group의 유리에 의한 F-C 시약과 반응할 수 있는 페놀성 물질로의 전환 여부를 조사하였다.
활성산소종을 거의 생성하지 않는 FeA에 200 μM의 H2O2를 인위로 첨가하였을 때에도 반응의 차이가 없었으며, H2O2 자체도 F-C시약과의 반응에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig.6B).
Monophenol ring 구조를 가진 FeA와 SiA는 다른 물질에 비해 낮은 반응성을 나타내 었으며 CiA는 반응하지 않았다. 흥미롭게도 Na₂CO₃ 선처리 방법(Method 2)에서 FeA, SiA와 quercetin을 제외한 대부분 물질의 반응성이 현저히 감소하였으며 특징적으로 Method 1에서 높은 반응성을 나타내었던 EGCG와 GA의 F-C시약과의 반응성은 급격하게 감소하여, slope를 기준하여 각각 74 및 61%의 감소를 보였다(Table 1). 따라서 EGCG를 표준물질로 사용한 경우, 두 방법 간에 동일한 발색정도를 나타낸 시료에 대해 총 페놀함량은 무려 3.

후속연구

실제 시료에의 적용을 위해 연잎 추출물을 제조하고 각 정량방법에 대한 반응도 차이를 조사한 결과, 역시 Na₂CO₃ 처리환경에서 현저한 발색반응도 저하를 나타내었다. 보다 정확한 페놀성 물질의 정량을 위해 적절한 표준물질의 선택 및 정량 방법 등에 대한 표준화가 필요할 것으로 사료된다.
이는 연잎 중 상당량의 페놀성 물질들이 Na₂CO₃에 노출되는 즉시 파괴되어 F-C 시약과의 반응성을 상실했기 때문이며, Method 1과 Method 2 사이의 반응성 차이가 큰 시료일수록 ring의 -OH의 밀도가 높은 화합물이 많이 포함된 시료로 예측된다. 이상의 결과는 Na₂CO₃가 -OH 밀도가 높은 galloyl moiety를 가진 물질을 포함하여 대부분의 페놀성 물질들의 화학안정성이 크게 영향을 미치고, 현재 사용되는 여러 scheme의 정량방법에 의해 이들의 반응성이 현저하게 변화되며, 보다 정확한 총 페놀성 물질의 정량을 위해서 이러한 요인들이 신중하게 고려되어야 할 것을 시사한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	현재까지 기능성식품 연구는 어떤 목적으로 진행되어 왔는가?	현재까지 상당수의 기능성식품 연구는 천연식품소재로부터 추출물을 제조하고 그 가운데 생리활성을 가진 물질의 분리와 동정에 목적을 두고 진행되어 왔다. 일반적으로 추출 물질의 1차적 생리활성 검정을 위해 다양한 화학적 산화제를 이용한 전자공여능 또는 항산화능 측정 등의 방법이 가장 빈번하게 사용되고 있으며 이와 같은 활성검증 시스템을 기반으로 하여 발굴되는 물질 중에는 페놀성 화합물이 상당수를 점유하고 있다(1,2).
	추출 물질의 1차적 생리활성 검정을 위한 방법은 무엇이 있는가?	현재까지 상당수의 기능성식품 연구는 천연식품소재로부터 추출물을 제조하고 그 가운데 생리활성을 가진 물질의 분리와 동정에 목적을 두고 진행되어 왔다. 일반적으로 추출 물질의 1차적 생리활성 검정을 위해 다양한 화학적 산화제를 이용한 전자공여능 또는 항산화능 측정 등의 방법이 가장 빈번하게 사용되고 있으며 이와 같은 활성검증 시스템을 기반으로 하여 발굴되는 물질 중에는 페놀성 화합물이 상당수를 점유하고 있다(1,2). 이러한 식이 페놀성 화합물들은 항산화 효과 외에도 다양한 생리활성으로 인하여(3-5) 식품의 연구 분야뿐만 아니라 이를 소재로 이용하는 관련 산업분야에 관심의 대상이 되어왔다.
	페놀성 물질의 함량 측정방법은 무엇이 있으며 어떤 성질을 이용하는 것인가?	따라서 다양한 식이소재 및 그 추출물 등에 대한 연구에서 페놀성 물질의 함량 측정이 일반적으로 진행되고 있으며(6), 각종 식품첨가물 등의 규격에도 중요한 기준이 되고 있다(7,8). 페놀성 물질의 정량방법으로 Folin-Denis 방법(9,10),Prussian blue assay(11) 및 Löwenthal 방법(12) 등이 있는데 이들은 페놀성 물질의 일반적인 oxidation-reduction 성질을 이용한 방법이다. 이중 Folin-Ciocalteu(F-C)시약을 이용하는 Folin-Denis 방법이 실험자들에게 있어서 가장 널리 이용되고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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