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문제 정의
- 본 연구는 형개연교탕 추출물의 iNOS mRNA 발현 억제를 조사하기 위해 RAW 264.7 macrophages에 LPS를 처리하였는데, 그람음성세균의 세포벽 성분인 LPS는 강력한 면역시스템 활성화 물질로서 국소염증, 항체생성 및 심한 감염의 경우에는 패혈성쇼크를 유발한다고 보고되었다30). 이러한 LPS분자는 CD14와 결합하고, PKC와 PKA와 같은 신호전달체계를 활성화시키는 것으로 알려져 있다30-2).
- 이에 저자는 형개연교탕의 항산화작용과 항염증 효과를 관찰하기 위하여 RAW 264.7 세포를 이용하여 NF-κB 활성억제를 통한 항염증효과(iNOS 발현)를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- RT-PCRkit(Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 IKK와 iNOS primer를 PCR machine으로 반응시켰다(TableⅡ). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- RAW 264.7macrophages- 5×105 cells/well을 6well에 plating 하고 12시간 후에 lipopolysaccharide(1 ㎍/㎖, Sigma)를 2시간 처리하여 NF-κB 활성을 유도한 후 형개연교탕추출물 0.25, 0.5, 1.0 그리고 2.0 ㎎/㎖를 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양하였다.
- 배양 후 수거한 RNA를 trizol reagent(Sigma)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer (introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCRkit(Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 IKK와 iNOS primer를 PCR machine으로 반응시켰다(TableⅡ). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다.
- 형개연교탕(Hyunggaeyungyo-tang) 2첩을 증류수 500 ㎖에 넣고 2시간동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ㎖으로 감압 ․ 농축한 후 동결 건조한 것을 사용하였고, MTT assay 결과 형개연교탕 추출물 10 ㎎/㎖까지는 세포생존율의 변화가 일어나지 않아 0.25, 0.5, 1.0 그리고 2.0 ㎎/㎖를 첨가량으로 결정하였다.
- 세포는 37℃, 5% CO2 incubator(Sanyo, Japan)에서 10% Fetal Bovine Serum(Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Welgin, Korea)을 사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin(Sigma, USA), 100 ㎍/㎖ streptomycin(Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다.
- 유전자 발현의 relative intensity의 수치화를 위해 Image pro Plus(Media Cybernetic, USA)를 이용한 영상분석을 실시하였다. 유의성은 ANOVA test(SPSS17, SPSS.
- PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- 항산화능력을 측정하기 위해 Riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하였다. 우선 photocell에 40 mM buffer 2.
- 형개연교탕의 iNOS 생성 억제을 통한 항염증효과를 살펴본 본 연구는 RAW 264.7 세포에서 IKK mRNA와 iNOS mRNA 발현 변화를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
대상 데이터
- 세포는 37℃, 5% CO2 incubator(Sanyo, Japan)에서 10% Fetal Bovine Serum(Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Welgin, Korea)을 사용하여 배양하였다.
- 실험에 사용한 마우스의 RAW264.7 cell은 KCLB(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다.세포는 37℃, 5% CO2 incubator(Sanyo, Japan)에서 10% Fetal Bovine Serum(Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Welgin, Korea)을 사용하여 배양하였다.
데이터처리
- 유의성은 ANOVA test(SPSS17, SPSS. USA)를 통해 확인하였고, p < 0.05의 경우 유의성을 인정하였다.
- Abs 560nm에서 autozero를 잡고 light box에서 1분동안 조사한 후 흡광도를 측정하였다. 이 작업을 10번 반복하여 평균값을 계산하였다.
이론/모형
- 형개연교탕이 NF-κB 활성에 관여하는 IκB kinase(IKK)와 염증효소인 induce nitric oxide synthase(iNOS)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄반응법(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다.
성능/효과
- 1. 형개연교탕 추출물의 항산화 효율은 농도 의존적으로 증가하였다.
- 2. 형개연교탕은 RAW 264.7 세포에서 농도의존적으로 IKK mRNA와 iNOS mRNA의 발현을 억제하였다.
- LPS 자극에 의한 RAW 264.7 세포에서의 IKK mRNA 발현은 증가하였는데, 형개연교탕 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 즉, LPS 자극시 발현되는 IKK mRNA 발현량에 비해 0.
- CD14는 단핵구와 호중구에서 잘 발현되는 55-kDa의 glycosylphosphatidylinositol-anchored protein으로 LPS 수용체라고 알려져 있으며, LPS와 강하게 결합한다33). LPS 처리 후 RAW 264.7 macrophages에서의 iNOS 발현은 증가하지만, 형개연교탕 추출물 처리시 iNOS 발현은 감소되었다. 이는 형개연교탕 추출물이 NF-kB 활성을 억제한 결과로서, 형개연교탕 추출물은 IkB kinase(IKK) 활성을 감소시키며 이는 NF-kB/Rel의 억제자인 IkB의 인산화 유도 감소로 이어져 NF-kB/Rel는 불활성상태 남게 되어 생쥐 iNOS 유전자의 TATA box 앞쪽 55bp와 917bp 위치의 NF-kB /Rel 결합부위34)에 결합하여 전사 유도해야 할 NF-kB/Rel 감소에 의해 iNOS 발현 감소가 유도된 것으로 사료되며, IKK mRNA 발현도 형개연교탕 추출물에 대해 농도 의존적으로 감소하였다.
- 또한 산화스트레스에 의한 NF-κB p65, p-IKB 그리고 iNOS 증가도 감소되었다.
- 우수한 항산화능이 있는 형개연교탕의 투여는 점막손상을 완화시켰는데, 산호성백혈구 수 감소, Substance P 생성 감소 그리고 MIP-2 생성 감소 등이 관찰되었다. 또한 산화스트레스에 의한 NF-κB p65, p-IKB 그리고 iNOS 증가도 감소되었다.
- 7 macrophages에서의 iNOS 발현은 증가하지만, 형개연교탕 추출물 처리시 iNOS 발현은 감소되었다. 이는 형개연교탕 추출물이 NF-kB 활성을 억제한 결과로서, 형개연교탕 추출물은 IkB kinase(IKK) 활성을 감소시키며 이는 NF-kB/Rel의 억제자인 IkB의 인산화 유도 감소로 이어져 NF-kB/Rel는 불활성상태 남게 되어 생쥐 iNOS 유전자의 TATA box 앞쪽 55bp와 917bp 위치의 NF-kB /Rel 결합부위34)에 결합하여 전사 유도해야 할 NF-kB/Rel 감소에 의해 iNOS 발현 감소가 유도된 것으로 사료되며, IKK mRNA 발현도 형개연교탕 추출물에 대해 농도 의존적으로 감소하였다.
- 이상의 결과로 iNOS mRNA 발현 억제능이 있는 형개연교탕은 NF-κB 활성 조절을 통한 iNOS생성억제로 항염증작용을 일으켜 점막 손상을 완화시키는 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로 형개연교탕은 과도한 산화스트레스 조절을 통해 전사인자 NF-κB 활성 억제를 통한 항염증작용으로 점막의 손상을 완화시키는 것으로 생각된다.
- 7 세포에서의 IKK mRNA 발현은 증가하였는데, 형개연교탕 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 즉, LPS 자극시 발현되는 IKK mRNA 발현량에 비해 0.25 ㎎/㎖에서 1.0%, 0.5 ㎎/㎖서 31.8%, 1.0 ㎎/㎖에서 70.8%, 2.0 ㎎/㎖에서 96.7%가 감소하였다(Fig. 2).
- 7 세포에서의 iNOS mRNA 발현은 증가하였는데, 형개연교탕 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 즉, LPS 자극시 발현되는 iNOS mRNA 발현량에 비해 0.25 ㎎/㎖에서 9.7%, 0.5 ㎎/㎖서 24%, 1.0 ㎎/㎖에서 51.9%, 2.0 ㎎/㎖에서 67.4%가 감소하였다(Fig. 2).
- 형개연교탕 추출물의 항산화 효율은 1 ㎎/㎖에서 17 ± 1.6%, 2 ㎎/㎖에서 35 ± 1.9%, 4 ㎎/㎖에서 43 ± 2.1%, 6 ㎎/㎖에서 54 ± 2.7%, 8 ㎎/㎖에서 64 ± 2.3%, 10 ㎎/㎖에서 71 ± 2.3%로 농도-의존적으로 증가하였다(Fig. 1).
후속연구
- 본 연구를 통해 각종 염증성, 알레르기성의 호흡기 질환에서 항균, 항염증 작용을 목적으로 형개연교탕을 응용할수 있을 것으로 생각된다.
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