[논문]항암 바이러스 치료제의 보고유전자로써 반딧불이 루시퍼레이즈의 인체 내 안전성에 대한 연구

홍영미; 윤웅희; 이유라; 김수지; 다니엘 엔가비레; 바드리낫 나라야나사미; 메포세 사하 시헬레 오넬라; 김명희; 조은아; 이보라; 황태호

doi:10.5352/jls.2021.31.11.1028

항암 바이러스 치료제의 보고유전자로써 반딧불이 루시퍼레이즈의 인체 내 안전성에 대한 연구
Study on the Safety of Firefly Luciferase in Human as a Transient Reporter Gene of Oncolytic Virotherapy 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.11, 2021년, pp.1028 - 1036

홍영미 (부산대학교 의과대학 양산부산대병원 간센터) , 윤웅희 ((주)바이오녹스) , 이유라 ((주)바이오녹스) , 김수지 ((주)바이오녹스) , 다니엘 엔가비레 ((주)바이오녹스) , 바드리낫 나라야나사미 (부산대학교 의과대학 의과학연구소(MRC)) , 메포세 사하 시헬레 오넬라 (부산대학교 의과대학 의과학연구소(MRC)) , 김명희 ((주)바이오녹스) , 조은아 ((주)바이오녹스) , 이보라 ((주)바이오녹스) , 황태호 (부산대학교 의과대학 양산부산대병원 간센터)

초록
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반딧불이 루시퍼레이즈(FLuc)는 유전자나 바이러스 치료제에 있어서 효과적인 표적으로 이용될 수 있다. 하지만, 외래 물질이라는 것과 acyl-CoA와의 유사성으로 인하여 FLuc의 임상적 적용은 아직까지 이뤄지지 않았다. 본 연구에서, 우리는 FLuc의 안전성을 보여주기 위한 목적으로 일련의 전임상 실험과 인체실험을 수행했다. 우선, FLuc의 세포막 투과성을 점검하기 위해 FLuc 유전자를 담지한 OTS-412와 FLuc 재조합 단백질을 이용했다. OTS-412를 다양한 세포에 감염시켰을 때, FLuc의 활성은 세포 용해물에서만 관찰됐고, 세포를 배양한 배지에서는 관찰되지 않았다. 재조합 단백질 역시 세포막을 투과하지 못했다. 동물실험에서도 이와 유사한 결과가 관찰됐다. VX-2 종양세포에 처리된 토끼에 OTS-412를 처리했을 때, FLuc의 활성은 오직 종양조직에서만 발견됐고, 다른 장기나 혈액에서는 관찰되지 않았다. FLuc의 인체 반응성을 조사하기 위해 각기 다른 장기에서 유래된 세포 용해물을 FLuc에 반응시켰으나 아무런 활성이 관찰되지 않았다. 마지막으로, FLuc 재조합 단백질을 인체에 정맥주사 방식으로 투여했다. FLuc는 혈액에서 20에서 30분의 반감기를 가지고 분해됐으며, 주사한지 1시간 30분 후에는 검출되지 않았다. 또한, 혈장 샘플이 지방산과 반응을 보이지 않았다. FLuc의 접종 전과 후의 결과를 비교했을 때에도 임상적으로 유의미한 변화가 없었다. 따라서, 본 연구는 FLuc의 안전성에 대한 우려를 종합적으로 불식시킨다.

Abstract ▼ AI-Helper

Firefly luciferase (FLuc) can function as an efficient marker in the gene and viral therapies. Nonetheless, its clinical translation has been unaccomplished with the concerns on its exogenous nature and the similarity with human fatty acyl-CoA synthetase. In this study, we aimed to show safety of FLuc by conducting a set of preclinical experiments and a human use. Initially, FLuc permeability across the plasma membrane was investigated by delivering the FLuc-carrying viral vector, OTS-412, or the FLuc recombinant protein. After in vitro infection of OTS-412 into different cancer cell lines, FLuc activity was detected only in the cell lysates, but not in culture media. In addition, recombinant FLuc protein further showed the impermeability against the plasma membrane. Similar result was also observed in the in vivo experiment. After being injected into the VX2 tumor-bearing rabbit, the FLuc exclusively resided within the tumor tissue without being detected in the blood plasma or other organs. Human cancer cell lines originated from various organs were lysed and treated to the FLuc, and none of the human substrates was reactive against the FLuc. As a final step, FLuc recombinant protein was intravenously injected into a human. The luciferase was degraded with the half-life of 20 to 30 minutes in blood, and was untraceable from 1.5 hr after the injection. In addition, the blood plasma was nonresponsive against the fatty acids. Hematological analysis was also comparable between the pre- and post-injection. Altogether, our study collectively demonstrates the safety of the firefly luciferase.

주제어

표/그림 (11)

그림 Fig. 1. Extracellular FLuc release of OTS-412 infected cancer cell. Schematic of OTS-412 infection into tumor cell (A), various concentration of OTS-412 infected in Hela cell. Cell supernatant and pellet after OTS-412 infection collected at 24 hr, 48 hr, 72 hr. Luciferase activity of supernatant and cell pellet measured in OTS-412 infected tumor cell (B).
그림 Fig. 2. rFLuc uptake into tumor cell and FLuc activity in various cell lysate. Schematic of rFLuc uptake procedure in tumor cell (A). 0.1 μg of rFLuc was added into culture media, and the luciferase activity of cell pellet was measured after 1 hr, 4 hr, and 24 hr (B). Luciferase activity test of various organ cell pellet. There is no similar substrate of FLuc in various organ cell pellet (C).
그림 Fig. 3. FLuc activity of mOTS-412 (OTS-412 with HU) injected VX2 rabbit model. FLuc activity of mOTS-412 injected VX2 rabbit serum (A), major tissue lysates (B), and immunofluorescence staining of A27 for mOTS-412 biodistribution (C).
그림 Fig. 4. FLuc activity in human plasma and WBC. FLuc activity measured in human plasma and WBC lysate at 5 min, 30 min, 1.5 hr, 2 hr, 2.5 hr, post-1.5 hr, post-20 hr after rFLuc injection (A). Visible observation of FLuc activity in human plasma as time course (B).
그림 Fig. 5. Activity of acyl-CoA-Synthetase in human plasma and WBC acly-CoA-Synthetase activity measured in human plasma and WBC lysate at 5 min, 30 min, 1.5 hr, 2 hr, 2.5 hr, post-1.5 hr, post-20 hr after rFLuc injection.
표 Table 1. The vital signs of pre/post rFLuc infusion
그림 Fig. 6. Hematology and chemistry changes in human blood after rFLuc infusion. The Changes of hematology (A) and biochemistry (B) ratio after rFLuc infusion. There were no hematology and biochemistry changes in pre and post infusion (* not clinically significant, NCS).
표 Table 2. Hematology result comparison of pre and post rFLuc protein injection
표 Table 3. Hemato-chemistry result comparison of pre and post rFLuc protein injection
표 Table 4. Blood coagulation test in human blood after rFLuc infusion
표 Table 5. Urine test after rFLuc infusion

AI 본문요약
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제안 방법

FLuc가 혈액 내 존재 시 인체 안전성을 확인하기 위하여 생물학적 활성을 가질 수 있는 고용량 15 mg의 rFLuc인 부하 용량과 45 mg 유지용량으로 나누어서 총 60 mg을 2시간 30분에 걸쳐 연구대상자에게 전신 투여 후 임상적 생화학적 평가를 하였다. 부하용량 투여 직후 5분, 30분에 rFLuc 활성 측정이 되었다.
Fluc는 구조적으로 fatty acyl-CoA-synthetase (FACS)와 유사하며 FACS와 유사한 활성을 할 수 있는 것으로 보고되어있어 이를 확인하기 위하여 연구대상자에 rFLuc 전신 투여 후 혈장(plasma)에서 FACS의 활성을 측정하였다. 부하 용량투여 직후인 5분, 30분의 혈장에서 luciferase 활성이 감지되었지만, FACS의 활성은 전혀 나타나지 않았다.
OTS-412에 감염된 항암세포에 발현된 FLuc의 세포 밖으로 유출을 확인하기 위하여 여러 항암 세포주에 여러 농도의 OTS-412바이러스를(10 MOI~0.0001 MOI) 감염 후 Luciferase assay 하였다. 세포용해물(lysate)과 세포배양액에서 FLuc의 활성 측정 결과 세포 용해물에서만 활성이 나타났다(Fig.
생체 내 투여된 mOTS-412에 의하여 발현된 FLuc의 생체 내 분포 및 활성을 확인하기 위해 VX2 종양 토끼 동물에서 mOTS-412를 전신투여 후 혈청과 주요장기에서 FLuc의 활성을 확인하였다. mOTS-412 투여 후 1일, 8일, 16일, 22일, 28일, 36일, 42일째 혈청에서 FLuc의 활성은 나타나지 않았다(Fig.
5시간, 20시간에 시험대상자의 전혈을 채취하여 혈액보관튜브(BD, USA)에 담은 뒤 원심 분리하여 혈장을 분리하였고, 전혈의 혈액세포 중 적혈구 세포를 용혈(RBC lysis buffer, Gibco, USA)하여 원심분리 후 PBS (Hyclone, USA)로 2회 수세(washing) 후 백혈구만 따로 분리하였다. 채취한 연구대상자 혈액의 일반검사(혈액학, 혈청학)는 양산 부산대학병원 진단검사의학과에서 진행하였다.

데이터처리

모든 실험한 결과의 통계 분석은 Prism 8 (GraphPad soft- ware, La Jolla, CA, USA) 이용하여 나타냈고, 그룹 간의 통계적 유의성 검정은 unpaired two-tailed t-tests을 통하여 확인하였다.

이론/모형

OTS-412 바이러스는 2% FBS 배지에 각 농도 바이러스를 희석 후 세포에 2시간 감염 후 배양 배지로 교체하였다. 이후 시간대별로 샘플을 회수 후 luciferase assay를 하였다.
재조합 firefly luciferase (rFLuc)은 Promega사의 rFLuc (QuantiLum® Recombinant Luciferase)을 사용하였다

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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