Pyrosequencing을 이용한 전통된장 제조과정 중 세균군집구조의 분석 Bacterial Community Profiling during the Manufacturing Process of Traditional Soybean Paste by Pyrosequencing Method원문보기
전통 방식으로 된장을 만드는 과정 동안 세균군집의 다양성과 변화를 관찰하기 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 하는 pyrosequencing을 수행하였다. 전통 된장 제조에 가장 중요한 접종원으로서 볏짚에 존재하는 세균 군집을 문수준에서 확인했을 때, 상대적 군집 비율로 1% 이상의 분포를 보였던 4종류는 Proteobacteria (71%), Actinobacteria (20.6%), Bacteroidetes (4.2%), Firmicutes (1.3%) 문이었다. 그러나 볏짚 세균 군집구조 결과와 달리 메주의 군집구조에서는 99.1%가 Firmicutes 문이었다. 문 수준에서 숙성 전 된장의 군집분포를 보면 Firmicutes 문 비율이 99.85%로 메주와 비슷한 수준이었다. 그러나 종 수준의 군집구조에서는 메주에서 32.54%의 가장 높은 군집빈도를 보였던 Bacillus siamensis는 0.1%로 거의 사라진 반면 B. amyloliquefaciens가 63.64%로 가장 높은 우점종이 되었다. 숙성 후 된장의 세균군집구조를 보면 숙성 전에 비해 Bacillus 비율이 증가되었으며 이들 중 군집의 상대밀도가 가장 높았던 우점종은 B. amyloliquefaciens (67.3%)였고, 5위까지 모두 Bacillus 종들(전체 군집분포의 92.2%)이 차지했다. 또한 메주 내 상위 11 위까지 우점을 이루던 세균 종들 중 10종이 숙성 후 된장에서도 우점종을 형성하여, 메주 미생물들이 숙성 후 된장 발효까지 영향을 준다는 것을 보였다. 이 결과들로부터 전통 장류에서 발효 주 세균은 Bacillus 종이며 이들은 기본적으로 볏짚으로부터 기원되어 메주에서 우점종을 형성한 것으로 추정되었다. 따라서 풍미와 위생성이 동시에 요구되는 전통 장류의 제조를 위해서는 볏짚 표면에 이 기능을 가진 Bacillus 종들의 군집 분포가 필요할 것으로 예상되었다.
전통 방식으로 된장을 만드는 과정 동안 세균군집의 다양성과 변화를 관찰하기 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 하는 pyrosequencing을 수행하였다. 전통 된장 제조에 가장 중요한 접종원으로서 볏짚에 존재하는 세균 군집을 문수준에서 확인했을 때, 상대적 군집 비율로 1% 이상의 분포를 보였던 4종류는 Proteobacteria (71%), Actinobacteria (20.6%), Bacteroidetes (4.2%), Firmicutes (1.3%) 문이었다. 그러나 볏짚 세균 군집구조 결과와 달리 메주의 군집구조에서는 99.1%가 Firmicutes 문이었다. 문 수준에서 숙성 전 된장의 군집분포를 보면 Firmicutes 문 비율이 99.85%로 메주와 비슷한 수준이었다. 그러나 종 수준의 군집구조에서는 메주에서 32.54%의 가장 높은 군집빈도를 보였던 Bacillus siamensis는 0.1%로 거의 사라진 반면 B. amyloliquefaciens가 63.64%로 가장 높은 우점종이 되었다. 숙성 후 된장의 세균군집구조를 보면 숙성 전에 비해 Bacillus 비율이 증가되었으며 이들 중 군집의 상대밀도가 가장 높았던 우점종은 B. amyloliquefaciens (67.3%)였고, 5위까지 모두 Bacillus 종들(전체 군집분포의 92.2%)이 차지했다. 또한 메주 내 상위 11 위까지 우점을 이루던 세균 종들 중 10종이 숙성 후 된장에서도 우점종을 형성하여, 메주 미생물들이 숙성 후 된장 발효까지 영향을 준다는 것을 보였다. 이 결과들로부터 전통 장류에서 발효 주 세균은 Bacillus 종이며 이들은 기본적으로 볏짚으로부터 기원되어 메주에서 우점종을 형성한 것으로 추정되었다. 따라서 풍미와 위생성이 동시에 요구되는 전통 장류의 제조를 위해서는 볏짚 표면에 이 기능을 가진 Bacillus 종들의 군집 분포가 필요할 것으로 예상되었다.
In order to evaluate the diversity and change of bacterial population during the manufacturing process of traditional soybean paste (doenjang), bacterial communities were analyzed using 16S rRNA gene-based pyrosequencing. In rice straw, the most important inoculum source for fermentation, the bacter...
In order to evaluate the diversity and change of bacterial population during the manufacturing process of traditional soybean paste (doenjang), bacterial communities were analyzed using 16S rRNA gene-based pyrosequencing. In rice straw, the most important inoculum source for fermentation, the bacterial sequences with a relative abundance greater than 1% were assigned to four phyla, Proteobacteria (71%), Actinobacteria (20.6%), Bacteroidetes (4.2%), and Firmicutes (1.3%). Unlike bacterial community composition of rice straw, a different pattern of bacterial population in meju was observed with predominantly high abundance (99.1%) of Firmicutes. Phylum composition in young doenjang was almost same as that of meju. Major genera in young doenjang were Bacillus (81.3%), Clostridium (6.9%) and Enterococcus (6.3%) and the predominant species among bacterial population was B. amyloliquefaciens (63.6%). Abundance of the phylum Firmicutes in mature doenjang was 99.98%, which was even higher value than those in meju and young doenjang. Predominant species in mature doenjang were B. amyloliquefaciens (67.3%), B. atrophaeus (12.7%), B. methylotrophicus (6.5%), B. mojavensis (3.2%), and B. subtilis. (2.5%), which were also identified as major species of the microbial flora in meju. These results suggested that rice straw was a primary source for supplement of Bacillus species in manufacturing the traditional doenjang and that some species of Bacillus strains were mainly involved in the fermentation process of traditional doenjang.
In order to evaluate the diversity and change of bacterial population during the manufacturing process of traditional soybean paste (doenjang), bacterial communities were analyzed using 16S rRNA gene-based pyrosequencing. In rice straw, the most important inoculum source for fermentation, the bacterial sequences with a relative abundance greater than 1% were assigned to four phyla, Proteobacteria (71%), Actinobacteria (20.6%), Bacteroidetes (4.2%), and Firmicutes (1.3%). Unlike bacterial community composition of rice straw, a different pattern of bacterial population in meju was observed with predominantly high abundance (99.1%) of Firmicutes. Phylum composition in young doenjang was almost same as that of meju. Major genera in young doenjang were Bacillus (81.3%), Clostridium (6.9%) and Enterococcus (6.3%) and the predominant species among bacterial population was B. amyloliquefaciens (63.6%). Abundance of the phylum Firmicutes in mature doenjang was 99.98%, which was even higher value than those in meju and young doenjang. Predominant species in mature doenjang were B. amyloliquefaciens (67.3%), B. atrophaeus (12.7%), B. methylotrophicus (6.5%), B. mojavensis (3.2%), and B. subtilis. (2.5%), which were also identified as major species of the microbial flora in meju. These results suggested that rice straw was a primary source for supplement of Bacillus species in manufacturing the traditional doenjang and that some species of Bacillus strains were mainly involved in the fermentation process of traditional doenjang.
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문제 정의
Pyrosequencing은 nucleotide의 결합 동안 방출되는 pyrophosphate 검출에 기반을 둔 next-generation DNA sequencing으로서, 각 시료에 특이적인 barcode system이 pyrosequencing에 도입(21)됨에 따라 국내에서도 간석지(10), 강 오염수(8), 젓갈(23), 메주(11)등의 미생물 군집분석에 이 방법의 이용이 활발해지고 있다. 이 연구는 순창 지역의 한 전통된장업체에서 전통 방식으로 된장을 만드는 과정 동안 볏짚, 메주, 숙성 전과 숙성 후 제조 단계별 전 과정에서 세균군집의 분포와 전이과정을 조사하여 제조 과정 중 발효 세균들의 역할을 이해하는데 그 목표를 두었다.
이러한 목표를 달성하기 위해서 전통 장류에서 발견되는 독소미생물들의 증식을 억제하면서 동시에 풍미가 좋은 발효 균주들을 선발할 필요가 있다. 이 연구는 순창의 한 지역을 대상으로 된장 제조 중 미생물군집과 제조 중 군집의 변화를 관찰하였다. 앞으로 전국적인 조사를 통해 장류 미생물들의 군집 분포를 밝히고 이를 통해 독소 미생물들에 대해 길항 특성을 가지면서 전통장류의 풍미를 지닌 발효 균주들을 지속적으로 발굴할 예정이다.
제안 방법
EzTaxon extended database (4)를 이용하여 BLASTN 탐색 실행결과로 찾은 상위 다섯 개의 hits을 대상으로 pair-wise alignment (20)를 실행한 뒤 얻은 similarity를 기준으로 분류학적 동정을 수행하였다. 3% 서열 불일치 도를 기준으로 CD-HIT program (17)을 이용하여 시료 내에 존재하는 종의 수인 operational taxonomic unit (OTU) 수를 구하였다. 통계분석은 MOTHUR program (27)을 사용해서 rarefaction curve, abundance-based coverage estimator (ACE) index, Chao1 richness index, Shannon 및 Simpson diversity indices들과 Good’s coverage index (6)를 구하였다(Table 1).
Barcode sorting에 따라 분리된 각 서열들에서, GL FLX software (Roche)를 사용하여 barcode 서열, primer 및 linker를 뺀 뒤 나머지 서열의 길이가 300 bp 이하인 것들은 분석에서 제외했고, Hidden Markov Model (HMMER 3.0; http://hmmer. janelia.org/)과 BLASTN search를 통해 chimera 염기 서열과 16S rRNA가 아닌 서열들도 제거하였다. EzTaxon extended database (4)를 이용하여 BLASTN 탐색 실행결과로 찾은 상위 다섯 개의 hits을 대상으로 pair-wise alignment (20)를 실행한 뒤 얻은 similarity를 기준으로 분류학적 동정을 수행하였다.
DNA 증폭을 위해 20 μl tube에 1 μl template DNA, 1 μl 각 primer (50 pmol), 1 μl dNTP (각 100 mM), 2 μl 10x PCR buffer, 1 μl Taq polymerase (Roche, Germany), 14 μl H2O의 반응 시약을 넣고 thermal cycler (Bio-Rad, USA)에서 PCR을 수행하였다.
org/)과 BLASTN search를 통해 chimera 염기 서열과 16S rRNA가 아닌 서열들도 제거하였다. EzTaxon extended database (4)를 이용하여 BLASTN 탐색 실행결과로 찾은 상위 다섯 개의 hits을 대상으로 pair-wise alignment (20)를 실행한 뒤 얻은 similarity를 기준으로 분류학적 동정을 수행하였다. 3% 서열 불일치 도를 기준으로 CD-HIT program (17)을 이용하여 시료 내에 존재하는 종의 수인 operational taxonomic unit (OTU) 수를 구하였다.
나머지 주요 2종은 아마 염수로부터 유래했을 가능성이 있는 호염 세균들(Tetragenococcus halotolerans, Brevibacterium halotolerans)이었다(Table 2). 각 시료간 세균 군집 다양성을 비교하기 위해 UniFrac service를 이용하여 Phylogenetic tree를 작성하였다(Fig. 4.). 예상대로 군집구조 유사성을 보인 숙성 전과 숙성 후 된장과 달리, 메주군집에서는 볏짚으로부터 선택적으로 접종된 미생물들과 내염성이 없는 미생물들이 함께 포함되었기 때문에 숙성 전, 후 된장과 볏짚의 군집구조의 중간위치에 존재했다.
대장균 16SrRNA의 V1, V2, V3 다변 영역(27-518)을 사용(16)한 fusion forward primer 27F는 5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC (adapter)-TCAG (key)-AC (linker)-GAGTTTGATCMTGGCTCAG (27F primer)-3′로 Reverse 518R은 5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC (adapter)) -TCAG (key)-Barcode-AC (linker)-WTTACCGCGGCTGCTGG(518R primer)-3′으로 구성 제작되었고, 각 시료의 Barcode는 CACTACGAG (볏짚), AGATGCTAG (메주), CACTATGTG (숙성 전 된장), TACGTAGACAG (숙성 후 된장)였다.
메주 제조에 사용한 볏짚 표면의 세균군집구조를 분석하기 위하여 건조 볏짚을 25 mesh 크기로 분쇄 후 glass bead beater (MP Bio Laboratories, USA)를 이용하여 토양 용 Fast DNA SPIN Kit (MP Bio Laboratories, USA)로 genomic DNA를 추출하였다. 메주 및 숙성 전 된장과 숙성 후 된장 시료는 각각 stomacher 80 biomaster (Seward, UK)에서 혼합 후 볏짚에서와 같은 방법으로 genomic DNA를 추출하였다. 대장균 16SrRNA의 V1, V2, V3 다변 영역(27-518)을 사용(16)한 fusion forward primer 27F는 5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC (adapter)-TCAG (key)-AC (linker)-GAGTTTGATCMTGGCTCAG (27F primer)-3′로 Reverse 518R은 5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC (adapter)) -TCAG (key)-Barcode-AC (linker)-WTTACCGCGGCTGCTGG(518R primer)-3′으로 구성 제작되었고, 각 시료의 Barcode는 CACTACGAG (볏짚), AGATGCTAG (메주), CACTATGTG (숙성 전 된장), TACGTAGACAG (숙성 후 된장)였다.
메주 제조에 사용한 볏짚 표면의 세균군집구조를 분석하기 위하여 건조 볏짚을 25 mesh 크기로 분쇄 후 glass bead beater (MP Bio Laboratories, USA)를 이용하여 토양 용 Fast DNA SPIN Kit (MP Bio Laboratories, USA)로 genomic DNA를 추출하였다. 메주 및 숙성 전 된장과 숙성 후 된장 시료는 각각 stomacher 80 biomaster (Seward, UK)에서 혼합 후 볏짚에서와 같은 방법으로 genomic DNA를 추출하였다.
전통 방식으로 된장을 만드는 과정 동안 세균군집의 다양성과 변화를 관찰하기 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 하는 pyrosequencing을 수행하였다. 전통 된장 제조에 가장 중요한 접종원으로서 볏짚에 존재하는 세균 군집을 문 수준에서 확인했을 때, 상대적 군집 비율로 1% 이상의 분포를 보였던 4종류는 Proteobacteria (71%), Actinobacteria (20.
대상 데이터
발효된 메주는 표면을 세척하여 끓이지 않은 18% 염수에 넣고 45일 간 침지한 후, 메주만 건져 으깬 뒤 혼합하여 살균한 통에 담고, 100일 동안 25°C에서 숙성하였다. Pyrosequencing 분석을 위해 볏짚, 메주, 염수에 침지 후 으깬 메주(숙성 전 된장), 숙성 후 된장을 각각 시료로 채취하였다.
선반 위에 볏짚(2010년 11월 채취, 전북 임실 산)을 깐 뒤 그 위에 성형한 메주를 얹고 주기적으로 볏짚 접촉면의 위치를 바꾸면서 25°C에서 60일간 발효시켰다.
데이터처리
통계분석은 MOTHUR program (27)을 사용해서 rarefaction curve, abundance-based coverage estimator (ACE) index, Chao1 richness index, Shannon 및 Simpson diversity indices들과 Good’s coverage index (6)를 구하였다(Table 1).
이론/모형
PCR 반응은 94°C 5분; 94°C 30초, 60°C 45초, 72°C 1분 30초로 10 cycle; 94°C 30초, 55°C 45초, 72°C 1분 30초로 20 cycle의 조건에서 수행하였다. QIAquick gel extraction kit (Qiagen, Germany)를 통해 정제한 PCR 산물은 GS Junior Titanium system (Roche, Germany) 염기서열분석기를 이용하여 pyrosequencing을 진행하였으며 pyrosequencing에 필요한 방법과 반응들은 제조회사(Roche)의 manual에 따라 ㈜천연구소(Chunlab, Korea)에서 수행하였다.
된장은 전통 방식에 따라 제조하였다. 상온에서 20시간 침지한 콩을 121°C, 5분 증자 후 12 cm × 20 cm × 10 cm (W × D × H) 크기(약 2.
성능/효과
5%로 증가되었다. 가장 많았던 우점종은 B. amyloliquefaciens (67.3%)였고, 다음으로 B. atrophaeus (12.7%), B. methylotrophicus (6.5%), B. mojavensis (3.2%), B. subtilus (2.5%)순으로 이들 5종 만의 Bacillus의 상대적 군집 빈도는 92.2%에 달했다 (Table 2). 내염성 젖산균인 Tetragenococcus halophilus (2.
85%로 메주와 비슷한 수준이었다. 그러나 종 수준의 군집구조에서는 메주에서 32.54%의 가장 높은 군집빈도를 보였던 Bacillus siamensis는 0.1%로 거의 사라진 반면 B. amyloliquefaciens가 63.64%로 가장 높은 우점종이 되었다. 숙성 후 된장의 세균군집구조를 보면 숙성 전에 비해 Bacillus 비율이 증가되었으며 이들 중 군집의 상대밀도가 가장 높았던 우점종은 B.
한편. 된장 주요 발효균의 하나(2)인 Bacillus amyloliquefaciens는 볏짚 전체 군집의 0.21%에 불과해서, 볏짚에서는 상대적으로 장류 발효세균의 분포가 낮았다. 벼 재배 지역의 토양에 따라 미생물 군집분포가 다르다는 것(25)을 고려하면 접종원으로 사용하는 볏짚의 미생물 분포 역시 다를 것으로 예상되었다.
메주 제조는 대기나 토양의 미생물이 가장 줄어드는 12월 말경 제조를 시작하며 전통적으로 삶은 콩을 직육면체 형태로 성형한 뒤 볏짚으로 묶거나 볏짚 위에서 2달 가량메주를 띄우는 과정을 거친다(32). 따라서 볏짚 표면에 묻어있던 균들이 메주 제조를 위한 주 미생물 공급원이 될 것이고, 이 볏짚 기원 미생물들은 이후 발효와 숙성과정 동안 미생물군집구조 형성에 기본적인 영향을 줄 것으로 예상된다. 그럼에도 불구하고 현재까지 전통 장류 제조에 볏짚의 미생물 분포가 장류의 세균군집구조에 어떤 영향을 주는지에 대한 체계적인 분석은 아직까지 보고된 바가 없다.
2%)이 차지했다. 또한 메주 내 상위 11 위까지 우점을 이루던 세균 종들 중 10종이 숙성 후 된장에서도 우점종을 형성하여, 메주 미생물들이 숙성 후 된장 발효까지 영향을 준다는 것을 보였다. 이 결과들로부터 전통 장류에서 발효 주 세균은 Bacillus 종이며 이들은 기본적으로 볏짚으로부터 기원되어 메주에서 우점종을 형성한 것으로 추정되었다.
따라서 볏짚 세균에 대한 pyrosequencing의 결과에서는 나타나지 않았지만 볏짚표면에서 낮은 세균 밀도로 존재했거나 또는 포자 형태로 존재하던 Bacillus 종들이 메주 발효과정 동안 증식했을 가능성이 있다. 또한 숙성 후 된장의 상대적 군집비율에 따라서 상위 30위까지 존재하는 종들 중 적어도 22종은 메주에서도 발견되었고, 메주에서 상위 6종이 숙성 후 된장에서 90% 이상의 상대적 우점종을 형성했다(Table 2)는 점에서 메주의 주요 균 종들은 숙성 후 된장에서 발견되는 세균 종과 밀접히 관계된다는 것을 보여주었다. 나머지 주요 2종은 아마 염수로부터 유래했을 가능성이 있는 호염 세균들(Tetragenococcus halotolerans, Brevibacterium halotolerans)이었다(Table 2).
문 수준에서 볏짚의 세균군집구조를 본 결과 Proteobacteria 문이 전체 염기 서열의 71%로 가장 많이 발견되었고, 다음으로 Actinobacteria (20.6%), Bacteroidetes (4.2%), Firmicutes (1.3%), Armatimonadetes (0.6%), Planctomycetes (0.6%), TM7 (0.4%), Deinococcus-Thermus (0.4%) 순이었으며 볏짚 세균군집의 90% 이상이 Proteobacteria와 Actinobacteria문으로 구성되어 있었다. 속 수준에서 군집을 상대적으로 비교한 결과 Proteobacteria 문에 속하는 Pantoea (27.
발효된 메주에서 군집구조는 Firmicutes 문이 99.1%, Proteobacteria 문이 0.9%로 메주의 미생물 공급원이었던 볏짚의 세균군집구조와는 극적인 변화가 있었다. 볏짚에서 Firmicutes 문은 전체 염기 서열 수의 1.
9%로 메주의 미생물 공급원이었던 볏짚의 세균군집구조와는 극적인 변화가 있었다. 볏짚에서 Firmicutes 문은 전체 염기 서열 수의 1.3%에 불과했으나, 메주 세균에서는 99% 이상을 차지하면서 볏짚에서 우점종이던 Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes 문을 완전히 대체하였다. 이 결과는 전국 17곳의 메주 시료에서 Firmicutes 문이 70.
비록 공기나 삶은 콩 표면에 부착된 미생물들이 접종원일 가능성도 배제할 수 없지만, 60일 간 메주 표면과 직접적이고 연속적인 접촉을 하면서 삶은 콩에 가장 많은 양의 미생물을 접종한 것은 볏짚이다. 볏짚의 세균군집을 Chao1 richness index와 ACE index에 따라 예측했을 때, 215-276의 OTUs를 함유하는 것으로 추정되었고(Table 1), rarefaction curve (Fig. 4.)에서 분석한 5,552개의 염기서열 수에서도 OTUs를 나타내는 곡선이 다른 시료들에 비해 더 가파른 증가로 볏짚시료에 포함된 모든 종을 확인하지 못한 것으로 나타났다. 따라서 볏짚 세균에 대한 pyrosequencing의 결과에서는 나타나지 않았지만 볏짚표면에서 낮은 세균 밀도로 존재했거나 또는 포자 형태로 존재하던 Bacillus 종들이 메주 발효과정 동안 증식했을 가능성이 있다.
). 볏짚의 염기서열들로부터 분석된 143 OTUs 중 Bacillus 종은 B. siamensis와 B. amyloliquefaciens 뿐이었지만 메주에서 확인된 총 80 OTUs중 Bacillus는 17종이 확인되었고 이들의 상대적 군집비율들도 상위(상위 8위 안에 6종 포함)에 속했다(Table 2). 메주에서 추가로 확인된 15종의 Bacillus들은, 메주 발효실내의 공기나 삶은 콩, 또는 볏짚으로부터 기원되었을 것으로 추정할 수 있다.
4%) 순이었으며 볏짚 세균군집의 90% 이상이 Proteobacteria와 Actinobacteria문으로 구성되어 있었다. 속 수준에서 군집을 상대적으로 비교한 결과 Proteobacteria 문에 속하는 Pantoea (27.1%), Methylobacterium (12.3%), Rhizobium (4.0%), Sphingomonas (3.8%)과 Actinobacteria문의 Microbacterium (4.2%)과 Mycobacterium (3.6%)등으로 구성되었으며 이들 중 토양 세균인 Pantoea 및 Methylobacterium 속이 볏짚 군집의 약 40%를 차지했다(Fig. 1.). 종 수준의 세균군집구조를 보면 Pantoea allii, P.
숙성 전 된장의 문 수준에서 세균 군집구조를 보면 Firmicutes 문이 전체 염기서열 빈도의 99.85%, Proteobacteria 문이 0.15%로 메주 세균의 군집구조분포와 비슷하였다. 한편 종 수준에서 군집구조를 보면 메주에서 32.
64%로 가장 높은 우점종이 되었다. 숙성 후 된장의 세균군집구조를 보면 숙성 전에 비해 Bacillus 비율이 증가되었으며 이들 중 군집의 상대밀도가 가장 높았던 우점종은 B. amyloliquefaciens (67.3%)였고, 5위까지 모두 Bacillus 종들(전체 군집분포의 92.2%)이 차지했다. 또한 메주 내 상위 11 위까지 우점을 이루던 세균 종들 중 10종이 숙성 후 된장에서도 우점종을 형성하여, 메주 미생물들이 숙성 후 된장 발효까지 영향을 준다는 것을 보였다.
숙성 후 된장의 세균군집구조를 보면, 숙성 전 81.3%였던 Bacillus 속의 상대적 군집빈도는 숙성 후에 95.5%로 증가되었다. 가장 많았던 우점종은 B.
또한 메주 내 상위 11 위까지 우점을 이루던 세균 종들 중 10종이 숙성 후 된장에서도 우점종을 형성하여, 메주 미생물들이 숙성 후 된장 발효까지 영향을 준다는 것을 보였다. 이 결과들로부터 전통 장류에서 발효 주 세균은 Bacillus 종이며 이들은 기본적으로 볏짚으로부터 기원되어 메주에서 우점종을 형성한 것으로 추정되었다. 따라서 풍미와 위생성이 동시에 요구되는 전통 장류의 제조를 위해서는 볏짚 표면에 이 기능을 가진 Bacillus 종들의 군집 분포가 필요할 것으로 예상되었다.
최근 장류 재료인 국내 메주들의 미생물군집 구조를 분석하기 위해 16S rRNA 유전자 서열 분석에 기반을 둔 pyrosequencing 연구가 수행되었다(11). 이 연구에서 전국적으로 수집한 18 종 메주의 우점종 세균은 문(phylum) 수준에서 전체 미생물 군집의 평균 93.6%를 차지한 Firmicutes였으며 다음으로는 Proteobacteria (4.5%), Bacteroidetes (0.8%) 순임을 보였다. 또한 Firmicutes의 대부분은 Bacillus와, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus 속을 포함하는 젖산균들로서 이들 비율은 메주 산지에 따라 다르게 나타났다.
예상대로 군집구조 유사성을 보인 숙성 전과 숙성 후 된장과 달리, 메주군집에서는 볏짚으로부터 선택적으로 접종된 미생물들과 내염성이 없는 미생물들이 함께 포함되었기 때문에 숙성 전, 후 된장과 볏짚의 군집구조의 중간위치에 존재했다. 이러한 결과로 볼 때 숙성된 된장의 주요 미생물들은 메주로부터 기원한 것이며, 메주 세균들 역시 기본적으로 볏짚 세균으로부터 접종되었을 것으로 추정되었다. 이의 검증을 위해 앞으로 삶은 콩, 발효실 공기, 염수의 미생물 군집 분포를 확인할 필요가 있다.
전통 방식으로 된장을 만드는 과정 동안 세균군집의 다양성과 변화를 관찰하기 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 하는 pyrosequencing을 수행하였다. 전통 된장 제조에 가장 중요한 접종원으로서 볏짚에 존재하는 세균 군집을 문 수준에서 확인했을 때, 상대적 군집 비율로 1% 이상의 분포를 보였던 4종류는 Proteobacteria (71%), Actinobacteria (20.6%), Bacteroidetes (4.2%), Firmicutes (1.3%) 문이었다. 그러나 볏짚 세균 군집구조 결과와 달리 메주의 군집구조에서는 99.
). 종 수준의 세균군집구조를 보면 Pantoea allii, P. ananatis, P. agglomerans, P. vagans가 비슷하게 각 6% 수준의 상대적 서열빈도를 보였고, Methylobacterium persicinum (3.8%), M. aquaticum (3.4%), Quadrispheaera granulorum (3.2%)가 그 뒤를 이었다(Table 2). 종 수준의 세균 군집분포를 볼 때 볏짚에 주로 존재하는 세균들은 주로 토양과 식물 기원의 세균들이 주류를 이루었고 특히 Pantoea 속의 일부는 식물 부착 병원성 균들로 알려져 있다(19, 24).
15%로 메주 세균의 군집구조분포와 비슷하였다. 한편 종 수준에서 군집구조를 보면 메주에서 32.5%로서 가장 높은 분포를 보였던 B. siamensis는 0.1%로 낮아진 반면 두 번째였던 B. amyloliquefaciens (19.2%)가 67.3%로 우점종이 되었고, B. atrophaeus는 12.7%로 그 뒤를 이었다(Table 2). 숙성 전 된장이 만들어지기 위해서는 메주를 18% 염수 하에서 45일간 담그는 과정을 거쳐야 하며, 이 때 높은 염 농도와 미 호기적 상태에서 견딜 수 있는 미생물들만이 생존할 수 있기 때문에 이러한 군집 변화가 일어났다고 예측되었다.
후속연구
이 결과들로부터 전통 장류에서 발효 주 세균은 Bacillus 종이며 이들은 기본적으로 볏짚으로부터 기원되어 메주에서 우점종을 형성한 것으로 추정되었다. 따라서 풍미와 위생성이 동시에 요구되는 전통 장류의 제조를 위해서는 볏짚 표면에 이 기능을 가진 Bacillus 종들의 군집 분포가 필요할 것으로 예상되었다.
이의 검증을 위해 앞으로 삶은 콩, 발효실 공기, 염수의 미생물 군집 분포를 확인할 필요가 있다. 또한 여러 지역에서 수거한 전통 장류용 볏짚들과 최종 장류의 미생물 군집 분포 사이의 상관 관계를 조사하고, 이 상관성에 주 발효균인 Bacillus의 길항능력이 어떤 영향을 주는지 밝혀야 할 것이다.
cereus group과 같은 위해 미생물의 존재 가능성은 상존한다. 비록 볏짚을 이용하는 전통장류 제조 방식이 풍미 관점에서 우수하다 하더라도 장류의 균일한 품질 유지와 식품 위해 요소 중점관리 기준(HACCP)에 부합하기 위해서는 장류 제조를 위한 접종 원으로서 현재와 같은 볏짚 사용 방식은 개선해야 할 것이다.
이 연구는 순창의 한 지역을 대상으로 된장 제조 중 미생물군집과 제조 중 군집의 변화를 관찰하였다. 앞으로 전국적인 조사를 통해 장류 미생물들의 군집 분포를 밝히고 이를 통해 독소 미생물들에 대해 길항 특성을 가지면서 전통장류의 풍미를 지닌 발효 균주들을 지속적으로 발굴할 예정이다.
이러한 결과로 볼 때 숙성된 된장의 주요 미생물들은 메주로부터 기원한 것이며, 메주 세균들 역시 기본적으로 볏짚 세균으로부터 접종되었을 것으로 추정되었다. 이의 검증을 위해 앞으로 삶은 콩, 발효실 공기, 염수의 미생물 군집 분포를 확인할 필요가 있다. 또한 여러 지역에서 수거한 전통 장류용 볏짚들과 최종 장류의 미생물 군집 분포 사이의 상관 관계를 조사하고, 이 상관성에 주 발효균인 Bacillus의 길항능력이 어떤 영향을 주는지 밝혀야 할 것이다.
전통 장류의 품질 우수성을 유지하기 위해서는, 기본적으로 B. cereus, Aspergillus flavus 같은 독소 미생물들의 증식이 없어야 하고, 대량 생산되는 장류에 부족한 전통 장류만의 풍미를 가진 미생물의 발효가 필요할 것이다. 이러한 목표를 달성하기 위해서 전통 장류에서 발견되는 독소미생물들의 증식을 억제하면서 동시에 풍미가 좋은 발효 균주들을 선발할 필요가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
선행 연구에서 국내 메주들의 미생물군집 구조에 대해 16S rRNA 유전자 서열 분석에 기반을 둔 pyrosequencing 한 결과를 설명하시오.
최근 장류 재료인 국내 메주들의 미생물군집 구조를 분석하기 위해 16S rRNA 유전자 서열 분석에 기반을 둔 pyrosequencing 연구가 수행되었다(11). 이 연구에서 전국적으로 수집한 18 종 메주의 우점종 세균은 문(phylum) 수준에서 전체 미생물 군집의 평균 93.6%를 차지한 Firmicutes였으며 다음으로는 Proteobacteria (4.5%), Bacteroidetes (0.8%) 순임을 보였다. 또한 Firmicutes의 대부분은 Bacillus와, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus 속을 포함하는 젖산균들로서 이들 비율은 메주 산지에 따라 다르게 나타났다. 이 연구는 국내산 메주들의 미생물군집구조의 다양성에 초점이 맞추어져 있어 된장의 제조 과정 동안 미생물 군집 구조의 변화는 다루고 있지 않다.
Pyrosequencing 방법이란?
이런 이유로 최근 미생물 생태의 표준 도구로 이용되고 있는 pyrosequencing 방법(18)을 사용하여 전통된장 제조 중 미생물 군집 구조를 확인할 필요가 있었다. Pyrosequencing은 nucleotide의 결합 동안 방출되는 pyrophosphate 검출에 기반을 둔 next-generation DNA sequencing으로서, 각 시료에 특이적인 barcode system이 pyrosequencing에 도입(21)됨에 따라 국내에서도 간석지(10), 강 오염수(8), 젓갈(23), 메주(11)등의 미생물 군집분석에 이 방법의 이용이 활발해지고 있다. 이 연구는 순창 지역의 한 전통된장업체에서 전통 방식으로 된장을 만드는 과정 동안 볏짚, 메주, 숙성 전과 숙성 후 제조 단계별 전 과정에서 세균군집의 분포와 전이과정을 조사하여 제조 과정 중 발효 세균들의 역할을 이해하는데 그 목표를 두었다.
전통 장류 발효 과정 동안 군집 구조의 변화를 추적하는 과정은 왜 중요한가?
이 연구는 국내산 메주들의 미생물군집구조의 다양성에 초점이 맞추어져 있어 된장의 제조 과정 동안 미생물 군집 구조의 변화는 다루고 있지 않다. 전통 장류는 자연계 여러 미생물들의 혼합 접종에 의한 복합 발효 과정으로 이루어져 있으므로 메주에서 된장의 숙성과정을 통해 미생물 군집구조는 계속 변화될 것으로 예상된다. 따라서 발효과정 동안 이러한 군집 구조의 변화를 추적하는 것은 전통 장류가 미생물들의 상호 작용에 의해 어떻게 발효되고 장류의 풍미와 위생에 어떤 영향을 주는지 예측하는데 매우 중요한 과정이 될 것이다.
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