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문제 정의
- 특히 된장의 미생물군집의 기원에 대한 연구는 세균의 군집에 치중되어 있고 진균에 대한 연구는 미흡하다[6−8]. 따라서 본 연구에서는 진균의 ITS (internaltranscribed spacer) 유전자 서열 분석에 기반을 둔 pyrosequencing을 이용하여 메주의 진균 군집 분석과 더불어 된장의 주요한 원료인 천일염, 그리고 된장의 진균 군집을 분석하여 진균 천이에 대한 연구를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- X는 각 DNA 샘플의 8-nucleotide barcode와 AC는 barcode와 프라이머를 연결한 a linker 부위이다. PCR은 95℃에서 initialdenaturation을 3분 실시하였고, 95℃ 30초 denaturation, 55℃에서 30초 annealing, 72℃ 30초 elongation을 25회 반복 수행 후 종결 반응을 위해 72℃ 5분 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 Qiagen purification kit (USA)을 가지고 정제하였고, 각 시료 PCR 산물 1 mg을 pyrosequencing 진행하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 Qiagen purification kit (USA)을 가지고 정제하였고, 각 시료 PCR 산물 1 mg을 pyrosequencing 진행하였다. Pyrosequencing은 Macrogen Inc. (Korea)이 MiSeqTM platform (Illumina, USA)을 사용하여 제조사의 매뉴얼대로 수행하였다.
- 메주, 천일염, 된장은 4℃에 저장하였다가 사용하였다. 각 시료는 PowerSoil DNA extraction kit (MOBIO, USA)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 곰팡이 ITS 서열의 PCR 증폭을 위해 프라이머 ITS3 (5′-X-AC-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGG-CATCGATGAAGAACGCAGC-3′)과 ITS4 (5′-XAC-GTCTCGTGGGCTCGGAG-ATGTGTATAAGAGACAGTCCTCCGCTTATTGATATGC′)를 이용하였다.
- 메주를 염수에 침지하여 된장을 만드는 과정 동안 진균의군집 변화와 재료가 된 메주와 천일염의 균총 천이를 확인하고자 진균의 ITS (internal transcribed spacer) 유전자 서열을 기반으로하는 pyrosequencing을 통해 미생물 군집을 확인하였다. 된장의 주요 원료인 메주는 Botrytis spp.
- PCR은 95℃에서 initialdenaturation을 3분 실시하였고, 95℃ 30초 denaturation, 55℃에서 30초 annealing, 72℃ 30초 elongation을 25회 반복 수행 후 종결 반응을 위해 72℃ 5분 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 Qiagen purification kit (USA)을 가지고 정제하였고, 각 시료 PCR 산물 1 mg을 pyrosequencing 진행하였다. Pyrosequencing은 Macrogen Inc.
- 지금까지 메주의 미생물 군집 연구결과 진균류로 Aspergillus, Cladosporium, Eurotium, Mucor, Penicillium, Rhizopus속이 주로 검출되었고, 세균에 있어서는 Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Clostridium, Staphylococcus와 Tetragenococcus속이 주로 검출되었다[4, 5]. 특히, 진균은 메주의 단백질과 같은 거대분자를 분해하기 위한 여러가지 효소를 생산하는 이유로 메주 발효에 중요한 역할을 한다고 알려져 있고 이들의 기원을 확인하기 위해 콩, 볏짚과 같은 원료나 환경의 미생물 군집을 비교하였다[4]. 그러나, 메주의 곰팡이가 된장으로 천이가 되는지에 대한 연구는 부족한 실정이다.
대상 데이터
- 곰팡이 ITS 서열의 PCR 증폭을 위해 프라이머 ITS3 (5′-X-AC-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGG-CATCGATGAAGAACGCAGC-3′)과 ITS4 (5′-XAC-GTCTCGTGGGCTCGGAG-ATGTGTATAAGAGACAGTCCTCCGCTTATTGATATGC′)를 이용하였다.
- 본 연구에 사용된 메주는 충청도 서산지역에서 2017년 11월에 전통적으로 제조하여 2달간 발효시킨 재래식 메주이며, 해당 메주를 이용하여 천일염을 첨가 후 된장을 제조하였고 3달간 발효 후 실험에 사용하였다. 메주, 천일염, 된장은 4℃에 저장하였다가 사용하였다.
이론/모형
- Pyrosequencing 결과는 SeqPurge 프로그램[9]을 사용하여 오류 교정을 실행하였고, FLASH [10]를 이용하여 하나의 서열로 조립하였다. Operational taxonomic units (OTUs)은 CD-HIT-OUT [11]를 이용하여 97% 이상의 서열 유사성을 갖는 서열끼리 군집화하여 종 수준의 OUT를 형성하였다.
성능/효과
- 된장의 주요 원료인 메주는 Botrytis spp.(57.94%)와 Dothiorella samentorum (24.08%)가 우점종으로 확인되었다. 천일염은 확인되지 않은 종들이(70.
- 각 시료별 종 추정치(OUTs) 개수는 30−69개, 종 풍부도(species richness) Chao1는 31−69개로 계산되었다.
- 그러나 해당 종은 메주와 천일염에서는 검출되지 않은것으로 보아 두 개의 원재료에 아주 미미한 정도로 존재하다가 고염인 환경에서 생육을 했거나, 다른 부재료에서 유래했을 것으로 추정된다. 결과적으로 우리는 된장의 발효에 있어서 주 원료가 되는 메주가 지닌 우점진균이 된장으로 천이가 되어 영향을 미칠 것으로 예상하였으나, 된장의 진균은 메주의 우점 유무와 상관없이 염에 내성을 가지는 진균이 우점을 차지하여 발효에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
- 그러나, 두 종의 진균이 식물병원균으로 먼저 알려져 있기 때문에 해당 종들이 발효된 메주에 존재했을 때 발효식품의 안전성 측면에서 연구가 필요하다. 그리고, 두 종이 메주에서 82.02%를 차지하고 있었음에도 불구하고 된장에서는 0.73%를 차지하는 것으로 보아 메주의 우점진균이 된장으로 천이되지 않은 것으로 판단된다. 이런 결과는 내염성이 없는 두 종이 고염인 된장에서의 생육이 용이치 않았을 것으로 판단한다.
- 다만 특이하게도, 메주 및 된장의 우점진균으로 알려져 있고 상업적 된장 제조에 종균으로 사용되는 Aspergillusoryzae는 본 연구에서 사용한 서산에서 제조된 된장에서 검출되지 않았다. 그리고 조 등의 연구결과에서도 제주나 호남권 전통된장에서 A.
- 13%) 검출되었고, 그 외 종들은 적은 비율로 다양하게 검출되었다. 된장은 진균 중 곰팡이가 아닌 효모인 Candida versatilis(92.62%)가 가장 높은 우점진균으로 확인되었다. 메주의 저염은 곰팡이 생육이 용이했고, 천일염은 고세균 또는 호염진균, 된장은 고염 효모의 생존에 용이했던 것으로 판단된다.
- 62%)가 가장 높은 우점진균으로 확인되었다. 메주의 저염은 곰팡이 생육이 용이했고, 천일염은 고세균 또는 호염진균, 된장은 고염 효모의 생존에 용이했던 것으로 판단된다. 메주와 천일염의 우점진균이 된장의 균총에 직접적인 영향을 미치지 못하는 것으로 판단된다.
- 시료의 진균 군집 분석을 바탕으로 계산된 통계분석 결과, 세 개의 시료에서 Goods Coverage가 0.99 이상으로 보임으로서 진균 군집 분석을 위한 충분한 read 수를 얻었다(Table1). 각 시료별 종 추정치(OUTs) 개수는 30−69개, 종 풍부도(species richness) Chao1는 31−69개로 계산되었다.
- 1). 일반적으로 메주의 우점진균으로 알려져있는 Mucor속은 Mucor racemosus (2.28%)와 Mucormucedo (0.04%)가 확인되었고, Aspergillus속은 Aspergillus flavus (0.94%)와 Aspergillus pseudoglaucus (0.06%)가 확인되었다(Table 2). 천일염의 경우에는 확인되지 않은 종(37.
- 03으로 계산되었다. 천일염의 Chao1과 Shannon 결과는 메주와 된장보다 높은 종의 다양성과 풍부도를 보였다. 메주는 종 풍부도 측면에서 가장 낮게 나왔고, 된장의 경우 종의 다양성이 가장 낮게 나왔다.
- 13%를 차지하고 있으며, 그 외 Ascomycota문에 포함되는 공기나 토양 중에 존재하는 곰팡이들이 검출되었다. 특이하게도 진균에 속하는 효모 중 S. fibuligera가 3.18% 검출되었으나, 이는 메주나 된장에서 모두 검출되지 않는 것으로 보아 천일염으로부터 천이가 일어나지 않은 것으로 판단된다.
- samentorum는 포도 줄기를 감염시키는 원인균으로 알려져 있으며[14], amylase, lipase 그리고 protease와 같은 외래 분비효소를 많이 생산한다고 알려져 있다[15]. 해당 진균이 메주 발효에 관여한다는 결과는 찾을 수 없었지만 흙에서 검출된다는 결과와 효소 생산을 기반으로 판단해볼 때 메주의 발효 연관성에 대한 가능성을 유추할 수 있다. 그러나, 두 종의 진균이 식물병원균으로 먼저 알려져 있기 때문에 해당 종들이 발효된 메주에 존재했을 때 발효식품의 안전성 측면에서 연구가 필요하다.
후속연구
- 해당 진균이 메주 발효에 관여한다는 결과는 찾을 수 없었지만 흙에서 검출된다는 결과와 효소 생산을 기반으로 판단해볼 때 메주의 발효 연관성에 대한 가능성을 유추할 수 있다. 그러나, 두 종의 진균이 식물병원균으로 먼저 알려져 있기 때문에 해당 종들이 발효된 메주에 존재했을 때 발효식품의 안전성 측면에서 연구가 필요하다. 그리고, 두 종이 메주에서 82.
- 2010년 채택된 나고야의 정서가 2014년 발효됨에 따라 국내 미생물 자원의 보호 및 활용이 활성화되어야 한다. 이러한 차원으로 볼 때 우리의 전통 메주나 된장에서 분리되어 산업적으로 유용한 잠재성을 지닌 균에 대해서는 식품원료목록에 신규 등재를 위한 편리한 절차와 규정이 필요하며, 신규 종균에 대한 사용이 용이할 수 있도록 국가적 차원의 전략이 필요하다고 제언한다.
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