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문제 정의
- 본 연구에서는 2차 가교를 통해 히아루론산 겔을 형성하던 방법을 마이크로입자의 제조에 처음으로 적용해 보고자 하였다. 기존에 알려진 히알루론산 마이크로입자의 제조방법 중 하나인 가교제 아디프산디하이드라지드(adipic acid dihydrazide, ADH)를 통하여 마이크로 입자를 제조한 후 트리메타인산삼나트륨(trisodium trimetaphosphate, STMP)으로 2차 가교반응을 시키거나 알긴산을 추가하여 히알루론산 마이크로입자 내부에 네트워크 폴리머를 형성하여 생체내 안정성을 높이고자 하였다.
제안 방법
- 히알루론산 마이크로입자(10 mg)를 히알루노니다제 500 U/ml을 포함하는 10 ml의 PBS에 첨가 후 37℃에서 항온처리하였다. 0.5, 1, 2, 3, 6 그리고 12시간에 샘플을 취하여 1500 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 완전히 건조시켜 히알루론산 마이크로입자의 무게를 측정하였다. 히알루노니다제에 의한 히알루론산 마이크로입자의 분해정도는 식(1)로부터 계산하였다.
- 기존에 알려진 히알루론산 마이크로입자의 제조방법 중 하나인 가교제 아디프산디하이드라지드(adipic acid dihydrazide, ADH)를 통하여 마이크로 입자를 제조한 후 트리메타인산삼나트륨(trisodium trimetaphosphate, STMP)으로 2차 가교반응을 시키거나 알긴산을 추가하여 히알루론산 마이크로입자 내부에 네트워크 폴리머를 형성하여 생체내 안정성을 높이고자 하였다.14) 제조된 히알루론산 마이크로입자들은 물리적 성질 및 히알루노니다제에 대한 저항성 등을 측정하여 약물수송체로서의 가능성을 평가하였다.
- 5%(w/v))을 상기 언급된 히알루론산 마이크로입자 제조방법과 동일하게 ml 미네랄 오일에 가하여 W/O 에멀젼을 형성하여 1차 가교반응를 진행하였다. 1차 가교반응 후 NaOH(0.1 N, 0.5 ml)를 넣어 약 알칼리 환경에서 3시간 동안 STMP의 이중가교 반응을 진행하였다(Fig. 2b). 2차 반응 후 IPA 를 이용하여 상기 언급된 방법과 같이 세척한 후 동결건조하여 DC-HA microspheres를 얻었다.
- 2b). 2차 반응 후 IPA 를 이용하여 상기 언급된 방법과 같이 세척한 후 동결건조하여 DC-HA microspheres를 얻었다.
- 2b). 2차 반응 후 IPA 를 이용하여 상기 언급된 방법과 같이 세척한 후 동결건조하여 DC-HA microspheres를 얻었다.
- 5%(w/v))을 400 mg의 span 80이 들어 있는 20 ml 미네랄 오일에 첨가한 후 교반기계를 이용하여 1000 rpm의 속도로 교반하여 히알루론산 W/O 에멀젼을 형성하였다. 교반을 시작한지 30분 후, 30 mg의 EDC(0.5 ml)을 상기 에멀젼에 서서히 가하여 완전히 분산되게 한 후 HCl(0.1 N, 0.1 ml)를 서서히 가하여 상온에서 24시간 동안 가교반응을 진행하였다(Fig. 2a). 24시간 후 30 ml의 IPA를 넣고 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여 히알루론산 마이크로입자를 수득한 후 IPA를 이용한 세척과정을 3번 반복하였다.
- 본 연구에서는 2차 가교를 통해 히아루론산 겔을 형성하던 방법을 마이크로입자의 제조에 처음으로 적용해 보고자 하였다. 기존에 알려진 히알루론산 마이크로입자의 제조방법 중 하나인 가교제 아디프산디하이드라지드(adipic acid dihydrazide, ADH)를 통하여 마이크로 입자를 제조한 후 트리메타인산삼나트륨(trisodium trimetaphosphate, STMP)으로 2차 가교반응을 시키거나 알긴산을 추가하여 히알루론산 마이크로입자 내부에 네트워크 폴리머를 형성하여 생체내 안정성을 높이고자 하였다.14) 제조된 히알루론산 마이크로입자들은 물리적 성질 및 히알루노니다제에 대한 저항성 등을 측정하여 약물수송체로서의 가능성을 평가하였다.
- 제조된 마이크로입자의 형태는 gold coating 후 주사전자현미경 이용하여 측정하였다. 또한 입자의 수화안정성을 평가하기 위하여 제조된 마이크로입자를 PBS에서 30분 동안 수화한 후, 건조하여 gold coating 하고 주사전자현미경을 이용하여 측정하였다. 제조된 마이크로입자의 크기는 주사전자현미경의 이미지를 바탕으로 크기를 측정하였으며,14) 제타전위측정기를 이용하여 마이크로입자의 표면전하를 측정하였다.
- 알긴산을 포함한 히알루론산 마이크로입자(Alginate containing HA microsphere, AC-HA microsphere)는 25 mg의 가교제 (ADH)가 포함된 5ml 히알루론산 : 알긴산나트륨(8 : 2, 7 : 3, 5 : 5) 수용액(0.5%(w/v))을 준비한 후 상기 언급된 히알루론산 마이크로 입자 제조방법과 동일하게 W/O 에멀젼을 형성하여 가교반응를 진행하였다. 가교반응 후 마이크로입자내에 폴리머 네트워크 형성을 위하여 알긴산의 반응물질인 CaCl2(0.
- 이중 가교된 히알루론산 마이크로입자(double-crosslinked HA microspheres, DC-HA microspheres)는 1차 가교제인 25 mg의 ADH와 2차 가교제인 25 mg의 STMP를 포함하는 5ml 히알루론산 수용액(0.5%(w/v))을 상기 언급된 히알루론산 마이크로입자 제조방법과 동일하게 ml 미네랄 오일에 가하여 W/O 에멀젼을 형성하여 1차 가교반응를 진행하였다. 1차 가교반응 후 NaOH(0.
- 또한 입자의 수화안정성을 평가하기 위하여 제조된 마이크로입자를 PBS에서 30분 동안 수화한 후, 건조하여 gold coating 하고 주사전자현미경을 이용하여 측정하였다. 제조된 마이크로입자의 크기는 주사전자현미경의 이미지를 바탕으로 크기를 측정하였으며,14) 제타전위측정기를 이용하여 마이크로입자의 표면전하를 측정하였다.
- 제조된 마이크로입자의 형태는 gold coating 후 주사전자현미경 이용하여 측정하였다. 또한 입자의 수화안정성을 평가하기 위하여 제조된 마이크로입자를 PBS에서 30분 동안 수화한 후, 건조하여 gold coating 하고 주사전자현미경을 이용하여 측정하였다.
- 히알루론산 마이크로입자(HA microspheres)의 제조는 에멀젼 가교반응을 통하여 진행하였다. 가교제 ADH를 25 mg 포함한 5 ml 히알루론산 수용액(0.
- 히알루론산 마이크로입자의 생체내 효소에 대한 안정성 평가는 히알루노니다제에 의한 마이크로입자의 분해정도로 평가하였다(Fig. 4). HA microsphere의 경우 히알루노니다제에 노출된 후 입자의 무게가 급격히 감소하여 30분 후 원래 무게의 53%만 남았으며 3시간 후는 대부분이 분해되었다.
- 히알루론산 마이크로입자의 형태는 SEM을 이용하여 관찰하였다(Fig. 3). 수화 전의 HA microspheres는 표면이 매끄러운 구형이었다.
대상 데이터
- (한국)에서 구입하여 사용하였고, 입도분석기 및 제타전위측정기(ELS-Z)는 Otsuka Electronics Co.(Hirakata, 일본)에서 구입하였으며, 전자주사현미경(scaning electronic microscopy, SEM)은 JEOL(Tokyo, 일본)사의 JSM-5310LV 모델을 사용하였다.
- 히알루론산(hyaluronic acid, 1040 kDa)은 Shandong Freda Biochem(jinan, 중국)에서 구입하였다. 미네랄오일(mineral oil), 소르비탄 모노올레이트(Span 80)은 Samchun pure chemical(한국)에서 구입하였고, 아디프산디하이드라지드(Adipic acid dihydrazide, ADH), 트리메타인산삼나트륨(Trisodium Trimetaphosphate, STMP), 알긴산(alginic acid), 에틸-3-[3-디메틸 아미노] 프로필 카르보디이미드(ethyl-3-[3-dimethyl amino] propyl carbodiimide, EDC), 히알루노니다제(Hyaluronidase)는 SigmaAldrich(St Louis, MO, 미국)에서 구입하였다. 이소프로필알코올 (isopropyl alcohol, IPA)은 Fisher scientific Inc(미국)에서 구입하였고 염화칼슘(CaCl2)은 Yakuri pure chemicals(Kyoto, 일본)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외의 시약은 특급 또는 1급을 사용하였다.
- 미네랄오일(mineral oil), 소르비탄 모노올레이트(Span 80)은 Samchun pure chemical(한국)에서 구입하였고, 아디프산디하이드라지드(Adipic acid dihydrazide, ADH), 트리메타인산삼나트륨(Trisodium Trimetaphosphate, STMP), 알긴산(alginic acid), 에틸-3-[3-디메틸 아미노] 프로필 카르보디이미드(ethyl-3-[3-dimethyl amino] propyl carbodiimide, EDC), 히알루노니다제(Hyaluronidase)는 SigmaAldrich(St Louis, MO, 미국)에서 구입하였다. 이소프로필알코올 (isopropyl alcohol, IPA)은 Fisher scientific Inc(미국)에서 구입하였고 염화칼슘(CaCl2)은 Yakuri pure chemicals(Kyoto, 일본)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외의 시약은 특급 또는 1급을 사용하였다. 기기는 교반기계(mechanical stirrer)를 Daihan scientific Co.
- 히알루론산(hyaluronic acid, 1040 kDa)은 Shandong Freda Biochem(jinan, 중국)에서 구입하였다. 미네랄오일(mineral oil), 소르비탄 모노올레이트(Span 80)은 Samchun pure chemical(한국)에서 구입하였고, 아디프산디하이드라지드(Adipic acid dihydrazide, ADH), 트리메타인산삼나트륨(Trisodium Trimetaphosphate, STMP), 알긴산(alginic acid), 에틸-3-[3-디메틸 아미노] 프로필 카르보디이미드(ethyl-3-[3-dimethyl amino] propyl carbodiimide, EDC), 히알루노니다제(Hyaluronidase)는 SigmaAldrich(St Louis, MO, 미국)에서 구입하였다.
이론/모형
- 제조된 마이크로입자의 생체내 분해효소에 대한 저항성은 히 알루노니다제에 의한 분해정도를 통하여 유추하였다. 히알루론산 마이크로입자(10 mg)를 히알루노니다제 500 U/ml을 포함하는 10 ml의 PBS에 첨가 후 37℃에서 항온처리하였다.
성능/효과
- 4%가 남았고 이후 일정한 속도로 분해되었다. DC-HA microspheres는 Fig. 2에서 나타낸 것과 같이 1차 가교제인 ADH와 2차 가교제인 STMP 가 히알루론산을 가교시켜 주기 때문에 가교제 ADH만을 사용한 HA microspheres에 비해 생체내 효소에 대한 안정성이 증가됨을 알 수 있었다. 또한 알긴산을 20% 포함한 AC-HA microspheres도 3시간 후 원래 무게의 52.
- 히알루론산 마이크로입자의 크기는 제조방법과는 상관없이 수백 나노미터에서 수십 마이크로미터 이내의 분포를 나타내었다 (Table I). DC-HA microspheres와 AC-HA microspheres(Alginate 20, 30%)의 입자크기는 고른 분포를 보였으나 HA microspheres와 AC-HA microspheres(Alginate 50%)의 입자크기는 분포가 일정하지 않은 것으로 관찰되었다. 또한 가교제의 양이 늘어났을 때 입자 크기가 증가한다는 선행 연구결과들이 있었으나,14,17) 본 연구에서는 HA microspheres에 비해 DC-HA microspheres의 입자의 크기 변화는 관찰되지 않았다.
- 두 가지 종류의 가교제로 이중 가교시킨 DC-HA microspheres의 경우, 구형입자에 막대 형상의 불순물이 관찰되었는데 이는 1차 가교반응에서 쓰인 HCl과 2차 가교반응에서 쓰인 NaOH의 잔해인 NaCl 염으로 보인다. 그리고 AC-HA microspheres는 알긴산이 20% 포함된 입자(AC-HA microspheres, Alginate 20%)에서 매끄러운 구형의 마이크로 입자가 형성되었으나, 알긴산의 비율이 30%였을 때는 일부 구형의 입자가 불규칙한 형태를 나타내었으며, 50%의 경우는 대부분의 입자가 불규칙한 형태를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 알긴산의 비율이 높아지면 상대적으로 히알루론산의 비율이 낮아져서, 입자의 형성에 가장 중요한 영향을 미치는 ADH의 가교 수가 적어지기 때문에 상대적으로 입자 형성이 분완전 해졌기 때문인 것으로 생각된다.
- 7%가 남았고 DC-HA microspheres와 비슷한 속도로 분해되었다. 그리고 알긴산의 비율이 높아질수록 AC-HA microspheres의 분해정도가 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 이는 알긴산과 히알루론산의 네트워크 폴리머 구조와 알긴산의 존재가 히알루론산에 대한 분해효소의 접촉에 장애물로 작용하여 저항성을 가지는 것이라 생각된다.
- 본 연구에서 제조한 이중 가교된 DC-HA microspheres와 알긴산이 포함된 AC-HA microspheres는 입자크기가 수 마이크로미터이고 대략 -30 mV의 표면전하를 가진 균일한 형태를 나타내었다. 또한, DC-HA microspheres와 AC-HA microspheres는 가교제를 하나만 사용한 HA microspheres에 비해 수화 후에도 입자의 형태를 안정적으로 유지하고 생체내 분해효소에 대한 안정성 또한 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들로부터, DC-HA microspheres와 AC-HA microspheres는 가교제 하나만을 사용한 HA microspheres에 비해 약물 방출 속도를 늦출 수 있을 것으로 예상되며, 향후 서방형 약물 전달체로서의 가능성을 검토할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 생체적합 고분자물질인 히알루론산을 마이크로입자의 형태로 제조하여 약물의 방출을 조절할 수 있는 전달체로 이용하려는 연구가 계속적으로 진행되고 있다. 본 연구에서 제조한 이중 가교된 DC-HA microspheres와 알긴산이 포함된 AC-HA microspheres는 입자크기가 수 마이크로미터이고 대략 -30 mV의 표면전하를 가진 균일한 형태를 나타내었다. 또한, DC-HA microspheres와 AC-HA microspheres는 가교제를 하나만 사용한 HA microspheres에 비해 수화 후에도 입자의 형태를 안정적으로 유지하고 생체내 분해효소에 대한 안정성 또한 증가하는 것을 확인하였다.
- 수화 전후의 히알루론산 마이크로 입자의 모양을 확인해 본 결과, STMP로 이중 가교를 시킨 DC-HA microspheres 또는 알긴산이 함유된 AC-HA microspheres의 경우, HA microspheres에 비해서 형태의 변화가 적은 것을 확인하였다. 이는, 이중 가교나 알긴산에 의한 입자 내부의 네트워크 형성이 수상에서의 히알루론산 마이크로입자의 안정성을 증가시켰기 때문인 것으로 생각된다.
후속연구
- 또한, DC-HA microspheres와 AC-HA microspheres는 가교제를 하나만 사용한 HA microspheres에 비해 수화 후에도 입자의 형태를 안정적으로 유지하고 생체내 분해효소에 대한 안정성 또한 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들로부터, DC-HA microspheres와 AC-HA microspheres는 가교제 하나만을 사용한 HA microspheres에 비해 약물 방출 속도를 늦출 수 있을 것으로 예상되며, 향후 서방형 약물 전달체로서의 가능성을 검토할 필요가 있을 것으로 생각된다.
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