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문제 정의
- 본 연구에서는 최소량의 가교제를 투여하면서 가교시간을 단축시키고자 하였다. 온도가 높아짐에 따라 반응물질의 입자수가 증가하고, 반응속도가 가속되며 10℃의 온도 증가 시 약 2배 정도의 반응속도 증가가 일어나는, 온도와 반응속도의 상관관계인 Arrhenius equation 식에 의거 실험을 수행하였다.
가설 설정
- 6. SEM images of dried HA microbeads crosslinked at (a) room temperature and (b) optical photograph of swollen HA mcirobeads in distilled water.
제안 방법
- 온도가 높아짐에 따라 반응물질의 입자수가 증가하고, 반응속도가 가속되며 10℃의 온도 증가 시 약 2배 정도의 반응속도 증가가 일어나는, 온도와 반응속도의 상관관계인 Arrhenius equation 식에 의거 실험을 수행하였다.14-16) 상온조건에서 가교시킨 HA 마이크로비드와 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 형성시킨 대조군에 대하여 가교온도가 가교도에 미치는 영향을 파악하기 위하여 SEM을 통하여 마이크로비드의 형상 및 표면을 관찰 하고 팽윤실험을 시행하여 마이크로비드의 제특성을 조사하였다.
- 가교액의 온도 조건은 상온, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃이었으며 가교시간은 5시간이었다. 가교가 완료된 히알루론산 마이크로비드를 200 mesh 표준체로 필터링하여 가교액으로 부터 분리시키고, 분리된 마이크로비드에 잔류하는 미반응 가교액 제거를 위하여 증류수에서 30분간 2회, 에탄올 (99.5%, Samchun, Korea)에서 30분간 3회, 총 5회에 걸쳐 각각 세척을 끝낸 후, 60℃ 20 mmHg 조건의 진공건조기에서 2시간 마이크로비드를 건조하였다.
- 가교온도에 따라 마이크로비드 직경 변화를 관찰하였다. 마이크로비드의 크기는 SEM과 실체현미경을 이용하여 각 실험군마다 최소 100개 이상의 마이크로비드를 관찰하고 실체현미경의 image analysis software를 이용하여 마이크로비드들의 직경을 측정하였다.
- 디비닐 설폰 가교액에 분산시킨 히알루론산 수용액이 가교액에 적용된 가교온도에 따른 마이크로비드의 형상과 팽윤도를 조사하였다. 실험결과, 가교온도가 높을수록 가교도가 증가하여 치밀하고 미세한 망상형 다공층 구조가 형성되었다.
- 가교온도에 따라 마이크로비드 직경 변화를 관찰하였다. 마이크로비드의 크기는 SEM과 실체현미경을 이용하여 각 실험군마다 최소 100개 이상의 마이크로비드를 관찰하고 실체현미경의 image analysis software를 이용하여 마이크로비드들의 직경을 측정하였다. Fig.
- 마이크로비드의 표면 및 내부 관찰을 위하여 건조된 마이크로비드의 형태 및 분포를 SEM(S-3000H, Hitachi, Japan)으로 분석하였다. 크기 및 형태 분석을 하기 위하여 각 실험군에 대하여 최소 100개 이상의 마이크로비드를 관찰하고 촬영된 마이크로비드의 사진(× 100)을 실체현미경(SV-55, Somtech, Korea)의 image analysis software(ISolution lite System, Canada)를 이용하여 마이크로비드들의 직경을 측정하였다.
- 그러므로, 가교도의 조절은 가교제의 농도 및 가교시간 외에도 가교액 온도에 따라 가교도를 조절할 수 있다는 결과를 알게 되었다. 본 연구결과는 가교도 조절을 통하여 마이크로비드의 다공층을 원하는 형상으로 설계(design)할 수 있으며 제조된 마이크로비드는 캐스팅법으로 멤브레인 제작이 가능하다. 3차원 망상형 구조를 가진 다공층을 원하는 형상으로 제조하고, 다공층 내부에 약물, 세포을 함유시킨 기능성 생착, 방출형 멤브레인을 제조하여 적용하면 결손된 조직을 치료 및 재생유도가 가능하다.
- 2에 나타나있다. 선행연구에서 최소 가교시간이 5시간 이상에서 다공성 마이크로비드가 형성되는 것이 발표되었는바,13) 모든 실험군에 가교시간을 동일하게 5시간 적용하였다. Fig.
- 마이크로비드의 팽윤도(swelling)는 식 (1)을 이용하여 계산하였다. 진공건조기에서 건조가 완료된 마이크로비드 중량(Wd)을 측정한 후, PBS (phosphate buffered saline) 수용액에 24시간 침지시킨 후 필터링 하여 PBS를 제거하고 증류수에서 팽윤된 상태의 마이크로비드 중량(Ws)을 측정하였다.
- 5와 6에 나타나 있다. 진공건조기에서 건조가 완료된 마이크로비드를 PBS 수용액에 24시간 침지시킨 후 필터링 하여 PBS를 제거하고 증류수에서 팽윤된 상태의 마이크로비드에 대한 팽윤도를 측정하였다. 선행 연구에서는 가교도가 높아질수록 팽윤성이 저하되는 것이 보고되었다.
- 크기 및 형태 분석을 하기 위하여 각 실험군에 대하여 최소 100개 이상의 마이크로비드를 관찰하고 촬영된 마이크로비드의 사진(× 100)을 실체현미경(SV-55, Somtech, Korea)의 image analysis software(ISolution lite System, Canada)를 이용하여 마이크로비드들의 직경을 측정하였다.
대상 데이터
- 5 wt% 농도의 히알루론산 수용액을 제조하였다. 0.5 wt% 히알루론산 수용액의 pH를 10~12 이내로 조정하였고, 이소부탄올 (2-methyl-1propanol, 99%, Junsei, Japan)에 가교제 디비닐 설폰 (divinyl sulfone, 98%, Sigma Aldrich, USA)을 혼합하여 0.2 vol%의 가교액을 준비하였다.1,2)
- 평균 분자량 106 Da을 가지는 분말형태의 히알루론산(Shiseido co,. Ltd, Japan)을 0.03mol/L의 NaOH 수용액에 혼합하여 0.5 wt% 농도의 히알루론산 수용액을 제조하였다. 0.
이론/모형
- 히알루론산의 카르복실기에 에틸알콜이나 벤질알콜을 결합반응시켜 합성한 결과로는 디메틸설폭사이드 등과 같은 유기용매에 녹는 특성을 가지나 용매추출법으로 유기용매를 첨가할 경우 미반응한 유기용매가 독성을 포함하고 있으며, 입자가 서로 엉켜 균일한 크기의 마이크로비드를 제조하기 곤란하며 수용액상의 팽윤성도 매우 낮아 응용에 제한적이다. 본 연구에서는 상기문제점을 보완하기 위해 발표된 선행연구에서 시행한 적가법을 사용하였다.1,2,13)
- 본 연구에서는 최소량의 가교제를 투여하면서 가교시간을 단축시키고자 하였다. 온도가 높아짐에 따라 반응물질의 입자수가 증가하고, 반응속도가 가속되며 10℃의 온도 증가 시 약 2배 정도의 반응속도 증가가 일어나는, 온도와 반응속도의 상관관계인 Arrhenius equation 식에 의거 실험을 수행하였다.14-16) 상온조건에서 가교시킨 HA 마이크로비드와 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 형성시킨 대조군에 대하여 가교온도가 가교도에 미치는 영향을 파악하기 위하여 SEM을 통하여 마이크로비드의 형상 및 표면을 관찰 하고 팽윤실험을 시행하여 마이크로비드의 제특성을 조사하였다.
성능/효과
- 적가법을 사용하여 제조된 마이크로비드는 팽윤성이 비교적 우수하나 마이크로비드의 크기를 조절하기 위하여 과량의 유화제를 사용하여 불순물의 문제점이 있고, 다단계의 유도체 제조과정을 가지며 이온처리를 해야하는 전처리 공정이 요구된다.1,2) 저분자 마이크로비드 제조법으로는 분무건조법이 있으나 히알루론산과 같은 분자량이 큰 고분자에서는 표면을 개질해야 하는 전처리 공정으로 인하여 장시간 안정화 하는데 부적합하다. 또한, 용매증발법은 친수성이 우수한 히알루론산에 대하여 수분을 제거하기 어렵고 부탄다이올다이글라이시딜에테르, 에틸렌클라콜 다이글라이시딜에테르 등과 같은 가교제로 다양한 미네랄 오일상에 떨어뜨려 용매 증발법을 이용하여 가교 공유결합을 형성시킨 기술에서는 가교제의 투여량이 많아 미반응 가교제가 발생하는 문제점이 있다.
- 1-4,14) 마이크로비드는 하이드로겔 제조의 전단계 공정이며 PBS (phosphate buffered saline) 수용액에 24시간 침지하여 하이드로겔화 한다.1,2) 화학적 가교제는 대부분 독성을 포함하므로 안전성을 높이기 위하여 극소량의 가교제를 사용하는 대신 히알루론산 수용액이 가교액에 대한 피노출 시간을 연장하여 고농도의 가교제를 사용 했을 때와 유사한 결과를 얻었다.1,2,13) 하지만, 가교시간의 장기화로 인해 생산성이 저하되므로 양산에는 부적합하다는 단점이 관찰되었다.
- 선행 연구에서는 가교도가 높아질수록 팽윤성이 저하되는 것이 보고되었다.13) 실험결과, 가교온도가 상온에서 60℃로 증가함에 따라, 가교도가 높아질수록 팽윤도가 970%에서 670%로 300% 감소하였다. 60℃에서 가교시킨 마이크로비드의 팽윤도는 매우 우수하지만, 가교온도별 상대적인 팽윤도의 저하는 마이크로 비드 표면의 치밀화, 마이크로비드 내부 다공층의 미세화, 망상형구조 네트워크의 조밀성에 의한 것으로 사료된다.
- 일반적으로, 약물에 따라 삼투압 효과가 달라지고 팽윤도는 변하지만 가교온도가 낮을수록 가교도가 감소하고 팽윤도는 증가한다. 가교온도가 가장 낮은 상온에서 실험한 마이크로비드가 가교도의 감소로 가장 높은 팽윤도가 관찰되었다. 일반적으로, 가교도가 작을수록 약물 방출속도는 증가한다.
- 12,13) 상기 결과는 가교액 온도가 증가할수록 반응속도의 가속화 때문인 것으로 사료된다. 그러므로, 가교도의 조절은 가교제의 농도 및 가교시간 외에도 가교액 온도에 따라 가교도를 조절할 수 있다는 결과를 알게 되었다. 본 연구결과는 가교도 조절을 통하여 마이크로비드의 다공층을 원하는 형상으로 설계(design)할 수 있으며 제조된 마이크로비드는 캐스팅법으로 멤브레인 제작이 가능하다.
- 가교온도 변수에 의한 다공성 조절과 가교도 조절은 팽윤도의 조절을 가능하게 하여 하이드로겔 및 멤브레인의 제조에 있어 조직 수복용 지지체로서 선택적 사용과 약물 전달체로서도 약물의 함유 및 방출 조건에서 선택적 이용이 가능할 것으로 추정된다. 본 연구를 통하여 가교제의 농도를 최소화하고 가교액 중에 적용된 가교온도로 가교도를 조절할 수 있어 기존의 가교시간에 의한 다공층 및 가교도 조절 연구에서 문제되었던 투여시간 대비 생산성 저하를 개선하여 생산속도를 향상 시키는데 효과적이었다.
- 디비닐 설폰 가교액에 분산시킨 히알루론산 수용액이 가교액에 적용된 가교온도에 따른 마이크로비드의 형상과 팽윤도를 조사하였다. 실험결과, 가교온도가 높을수록 가교도가 증가하여 치밀하고 미세한 망상형 다공층 구조가 형성되었다. 증류수에서 팽윤도 실험결과, 가교온도가 상온에서 60℃로 증가할수록 팽윤도는 감소하였다.
- 실험결과, 가교온도가 높을수록 가교도가 증가하여 치밀하고 미세한 망상형 다공층 구조가 형성되었다. 증류수에서 팽윤도 실험결과, 가교온도가 상온에서 60℃로 증가할수록 팽윤도는 감소하였다. 가교온도 변수에 의한 다공성 조절과 가교도 조절은 팽윤도의 조절을 가능하게 하여 하이드로겔 및 멤브레인의 제조에 있어 조직 수복용 지지체로서 선택적 사용과 약물 전달체로서도 약물의 함유 및 방출 조건에서 선택적 이용이 가능할 것으로 추정된다.
- 직경의 증가와 감소가 반복함을 관찰할 수 있었지만, 실온 가교군과 60℃ 가교군의 평균 직경 차이가 10 μm 이내 인 것으로 보아 히알루론산의 다분산성 특성을 고려해 볼 때, 비드의 형상에는(Figs. 1 and 2) 변화가 있었지만 마이크로비드의 크기에는 큰 영향이 없었다.
후속연구
- 일반적으로, 가교도가 작을수록 약물 방출속도는 증가한다. 가교도에 따른 약물 방출속도가 정교하게 제어 가능하다면 약물 전달분야에 효과적으로 적용 가능하다. 약물 방출속도와 약물 전달분야의 대한 자세한 연구는 추후 별도로 필요하다.
- 증류수에서 팽윤도 실험결과, 가교온도가 상온에서 60℃로 증가할수록 팽윤도는 감소하였다. 가교온도 변수에 의한 다공성 조절과 가교도 조절은 팽윤도의 조절을 가능하게 하여 하이드로겔 및 멤브레인의 제조에 있어 조직 수복용 지지체로서 선택적 사용과 약물 전달체로서도 약물의 함유 및 방출 조건에서 선택적 이용이 가능할 것으로 추정된다. 본 연구를 통하여 가교제의 농도를 최소화하고 가교액 중에 적용된 가교온도로 가교도를 조절할 수 있어 기존의 가교시간에 의한 다공층 및 가교도 조절 연구에서 문제되었던 투여시간 대비 생산성 저하를 개선하여 생산속도를 향상 시키는데 효과적이었다.
- 응용분야로, 외과용 유착방지제 (antiadhesion membrane), 치과용 임플란트 이식 시 치주 재생유도체 (peridontal guided bone regeneration), 화상환자 피부조직 재생유도제 (guided soft tissue regeneration) 등 결손된 조직재생에 응용 가능하다. 또한, 혈관 및 장관용 스텐트 피막(cover membrane), 인공장기 및 인공뼈 등 생착을 유도하는 코팅제 등에 활용 가능하다.
- 가교도에 따른 약물 방출속도가 정교하게 제어 가능하다면 약물 전달분야에 효과적으로 적용 가능하다. 약물 방출속도와 약물 전달분야의 대한 자세한 연구는 추후 별도로 필요하다.
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