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문제 정의
- 2) 이들의 선별기준은 의료용 약물을 우선으로 하여 염기성이고, 분석기기(GC-MS)의 특성을 고려하여 열에 안정하고, 자타살 목적으로 많이 사용되는 정신신경계용 약, 그리고 검출빈도가 높은 약물을 중심으로 선별하였다. 본 연구에서는 이들 약물을 중심으로 생체시료에서의 확인 및 간이 정량분석을 동시에 할 수 있는 분석법을 확립하고자 하였다. 약물의 추출은 고상추출법(SPE)을 사용하였고 최종 확인 및 정량분석은 가스크로마토 그래피-질량분석법(GC-MS)을 이용하였으며 자체 개발한 약물의 자동 확인 프로그램인 DrugMan3)을 이용하여 정량분석 기능을 추가로 개발하여 약물의 확인 및 간이 정량분석 결과가 동시에 이루어질 수 있도록 설계하였다.
가설 설정
- a) At first in order to adjust standard retention time of 55 drug, retention time of internal standard was confirmed. b) Automatically retention time of drugs were revised following their reference retention time. c) Revised data was exported to Data Chemstation menu and drug identification and semi quantitative analysis were performed by DrugMan simultaneously.
- a) One ml of blood was extracted by SPE and analyzed to GC-MS. b) Retention time of internal standard (trimipramine-D3) was 11.20 min under our analytical condition.
제안 방법
- 이와 관련하여 저자 등은 최근 3년간 우리나라 변사체 중 약독물의 검출 유형과 빈도수를 조사하여 약독물 검출시스템에 필요한 목표 약물 62종을 선정하였다.2) 이들의 선별기준은 의료용 약물을 우선으로 하여 염기성이고, 분석기기(GC-MS)의 특성을 고려하여 열에 안정하고, 자타살 목적으로 많이 사용되는 정신신경계용 약, 그리고 검출빈도가 높은 약물을 중심으로 선별하였다. 본 연구에서는 이들 약물을 중심으로 생체시료에서의 확인 및 간이 정량분석을 동시에 할 수 있는 분석법을 확립하고자 하였다.
- 2. 생체시료(혈액)에서 55종 약물의 동시 검색 및 간이 정량분석이 가능한 프로그램 DrugMan을 자체 개발하였으며 파라미터로서 GC-MS분석에 따른 유지시간, 주요 프라그멘트 이온 및 검량선을 입력하였다.
- 45℃ 수욕상에서 질소 가스로 농축한 후 얻어진 잔사에 메탄올 100 µl를 가하여 GC-MS용 분석시료로 하였다.
- 55종 약물 중 검출빈도가 높은 약물 29종을 선별하여 정확도를 계산하였다. 정확도는 공시료 혈액에 각 표준용액을 0.
- DrugMan이 실제 양성 시료를 양성으로 판단하는 능력을 알아보기 위하여 민감도율을 계산하였다. 55종 약물의 표준용액을 0.05 및 0.5 mg/l 농도로 공시료 혈액에 동시에 모두 첨가한 후 내부표준물질 및 0.1 M 인산완충액을 넣고 전술한 방법과 같이 추출하여 DrugMan 프로그램을 적용하였을때 의음성 시료 개수(양성이나 음성으로 판단하는 약물 수)를 조사하여 아래의 식에따라 민감도율을 계산하였다.9) 시료는 3회씩 반복 시험하여 평균값을 구하였다.
- DrugMan 프로그램을 실제 시료에 직접 적용시켜 약물 검색 및 간이 정량을 시행하였다. 시료는 당 연구원에 부검의뢰된 변사체의 혈액(ID 36566)을 사용하였는데, 혈액 1ml를 취하여 전술한 바와 같이 추출한 후 GC-MS 분석을 한 결과 Fig.
- DrugMan이 실제 양성 시료를 양성으로 판단하는 능력을 알아보기 위하여 민감도율을 계산하였다. 55종 약물의 표준용액을 0.
- 1과 같은 크로마토그램을 얻었다. Fig. 1에서 내부표준물질의 유지시간을 확인한 후 Fig. 2와 같이 DrugMan 프로그램을 구동하여 내부표준물질의 유지시간을 입력한 후 분석 크로마토그램을 chemstation menu로 전송하였다. 1분 이내에 시료에 대한 55종 약물에 대한 검색결과 및 함량이 Fig.
- 즉 약물복용이 의심되는 운전자의 혈액을 추출하여 GC-MS 분석을 한 후 본 프로그램에 의하여 운전에 영향을 미치는 벤조디아제핀계 약물 등 49종의 약물을 자동적으로 검색하도록 설계한 것이다. 개발 당시 파라미터로서 49종 약물의 GC-MS 분석에 따른 표준 유지시간과 주요 프라그멘트(fragment) 이온을 등록하였고, 장비회사에서 제공한 chemstation data analysis 메뉴에 연계시켜 목적 약물에 대한 피크 선별 및 data processing이 이루어지도록 하여 생체시료 중 49종 약물을 동시에 검색할 수 있도록 하였다. 본 연구에서는 DrugMan의 프로그램을 기반으로 하여 약독물 검출 시스템에 사용되는 약물 55종을 선별하여 이들 약물을 0.
- 공시료 혈액1 ml에 표준용액(1 및 10 mg/l in MeOH)을 검량선의 범위에 따라 일정량씩 가하고 내부표준물질 30 µl씩 넣은 후 잘 혼화하여 전술한 방법과 같이 추출하여 GC-MS 분석을 하였다. 검량선 작성은 내부표준물질 및 각 선별물질의 정량이온에 대한 피크 면적비로 계산하였고, 각 농도별로 3회씩 작성하여 평균값을 사용하였다.
- 검량선은 농도범위에 따라 55종의 약물을 크게 4그룹으로 나누어 작성하였는데 즉, 1그룹(0.05, 0.25, 0.5, 0.75, 1 mg/l), 2그룹(0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1 mg/l), 3그룹(0.1, 1.5, 2.5, 3.5, 5 mg/l) 및 4그룹(0.5, 2.5, 5, 7.5, 10 mg/l)으로 분류하였다. 공시료 혈액1 ml에 표준용액(1 및 10 mg/l in MeOH)을 검량선의 범위에 따라 일정량씩 가하고 내부표준물질 30 µl씩 넣은 후 잘 혼화하여 전술한 방법과 같이 추출하여 GC-MS 분석을 하였다.
- 공시료 혈액1 ml에 표준용액(1 및 10 mg/l in MeOH)을 검량선의 범위에 따라 일정량씩 가하고 내부표준물질 30 µl씩 넣은 후 잘 혼화하여 전술한 방법과 같이 추출하여 GC-MS 분석을 하였다.
- 또한 각 약물별 질량분석 스펙트럼을 얻어 3개의 주요 프라그멘트 이온을 선별하였고, 그중 주요 이온을 정량이온(quantifier ion)으로 정하고, 다른 2개 이온은 약물 확인을 위한 검증이온(qualifier ion)으로 정하였다. 그 외에 개개 약물별로 검량선을 등록하여 선별한 55종 약물에 대한 간이 정량 분석이 가능하도록 설계하였다.
- 5 mg/l의 농도로 공시료 혈액에 가한 후 추출하여 얻어지는 크로마토그램을 갖고 파라미터로서 우선 GC-MS 분석에 따른 표준 유지시간, 주요 프라그멘트 이온을 데이터베이스로 등록하였다. 또한 각 약물별 질량분석 스펙트럼을 얻어 3개의 주요 프라그멘트 이온을 선별하였고, 그중 주요 이온을 정량이온(quantifier ion)으로 정하고, 다른 2개 이온은 약물 확인을 위한 검증이온(qualifier ion)으로 정하였다. 그 외에 개개 약물별로 검량선을 등록하여 선별한 55종 약물에 대한 간이 정량 분석이 가능하도록 설계하였다.
- )를 파라미터로서 DrugMan에 입력하였으며, 이때 입력 데이터는 Table II와 같았다. 본 분석조건에서 55종 약물은 6.31분(ephedrine)에서 22.20분(tiropramide)까지 광범위하게 검출되었는데 약물의 유지시간은 분석환경에 따라 다소 변화할 수 있으므로 프로그램에 입력한 표준유지시간은 내부표준물질의 유지 시간으로 나눈 값 즉, 상대유지시간(relative retention time)이 자동적으로 계산되도록 하여 유지시간의 변화를 보정하도록 하였다.
- 개발 당시 파라미터로서 49종 약물의 GC-MS 분석에 따른 표준 유지시간과 주요 프라그멘트(fragment) 이온을 등록하였고, 장비회사에서 제공한 chemstation data analysis 메뉴에 연계시켜 목적 약물에 대한 피크 선별 및 data processing이 이루어지도록 하여 생체시료 중 49종 약물을 동시에 검색할 수 있도록 하였다. 본 연구에서는 DrugMan의 프로그램을 기반으로 하여 약독물 검출 시스템에 사용되는 약물 55종을 선별하여 이들 약물을 0.5 mg/l의 농도로 공시료 혈액에 가한 후 추출하여 얻어지는 크로마토그램을 갖고 파라미터로서 우선 GC-MS 분석에 따른 표준 유지시간, 주요 프라그멘트 이온을 데이터베이스로 등록하였다. 또한 각 약물별 질량분석 스펙트럼을 얻어 3개의 주요 프라그멘트 이온을 선별하였고, 그중 주요 이온을 정량이온(quantifier ion)으로 정하고, 다른 2개 이온은 약물 확인을 위한 검증이온(qualifier ion)으로 정하였다.
- 분석기기 및 조건은 전보2)의 방법과 동일하였는데, GC-MS는 Agilent사의 HP 5973i MSD를 사용하였고, 컬럼은 HP-5MS(0.25 mm ID, 0.25 µm film thickness, 30 M)를 사용하여 분석하였다.
- 선별된 약물 55종에 대한 GC-MS 분석시 표준유지시간 (standard retention time), 3가지 주요 프라그멘트 이온(정량이온 및 검증이온), 검량선 범위, 검량선의 기울기, y절편 값 및 상관계수(r2)를 파라미터로서 DrugMan에 입력하였으며, 이때 입력 데이터는 Table II와 같았다. 본 분석조건에서 55종 약물은 6.
- 시료 전처리에는 자동고상추출 장치(ASPEC XL 4TM, Gilson) 및 카트리지(Bond Elut-Certify®, 130 mg/3 ml, Varian)를 사용하였으며, 약독물 추출 등의 분석에 사용한 유기용매 및 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다.
- 본 연구에서는 이들 약물을 중심으로 생체시료에서의 확인 및 간이 정량분석을 동시에 할 수 있는 분석법을 확립하고자 하였다. 약물의 추출은 고상추출법(SPE)을 사용하였고 최종 확인 및 정량분석은 가스크로마토 그래피-질량분석법(GC-MS)을 이용하였으며 자체 개발한 약물의 자동 확인 프로그램인 DrugMan3)을 이용하여 정량분석 기능을 추가로 개발하여 약물의 확인 및 간이 정량분석 결과가 동시에 이루어질 수 있도록 설계하였다.
- 5 mg/l의 농도로 첨가하여 3일간 연속하여 반복실험을 하고 GC-MS 분석하였다. 일별로 4개의 시료를 준비하여 시행하였으며, 얻어진 시험결과에 대한 일내(intra-day) 및 일간(inter-day) 정밀도를 상대표준편차 CV(%)로 나타내었다.15)
- 3회 반복시험하여 평균값을 구하였다. 정밀도는 공시료 혈액에 각 표준용액을 0.5 mg/l의 농도로 첨가하여 3일간 연속하여 반복실험을 하고 GC-MS 분석하였다. 일별로 4개의 시료를 준비하여 시행하였으며, 얻어진 시험결과에 대한 일내(intra-day) 및 일간(inter-day) 정밀도를 상대표준편차 CV(%)로 나타내었다.
- 55종 약물 중 검출빈도가 높은 약물 29종을 선별하여 정확도를 계산하였다. 정확도는 공시료 혈액에 각 표준용액을 0.5 mg/l의 농도로 첨가하고 전술한 방법과 같이 추출하여 DrugMan에서 계산하였을 때 간이 정량 분석값과 기준 농도(0.5 mg/l)와의 차이를 비교하였다. 3회 반복시험하여 평균값을 구하였다.
- 은 visual basic을 기반으로 한 일종의 데이터베이스 프로그램으로서 당시에는 운전에 영향을 미치는 약물검색에 응용하고자 개발하였다. 즉 약물복용이 의심되는 운전자의 혈액을 추출하여 GC-MS 분석을 한 후 본 프로그램에 의하여 운전에 영향을 미치는 벤조디아제핀계 약물 등 49종의 약물을 자동적으로 검색하도록 설계한 것이다. 개발 당시 파라미터로서 49종 약물의 GC-MS 분석에 따른 표준 유지시간과 주요 프라그멘트(fragment) 이온을 등록하였고, 장비회사에서 제공한 chemstation data analysis 메뉴에 연계시켜 목적 약물에 대한 피크 선별 및 data processing이 이루어지도록 하여 생체시료 중 49종 약물을 동시에 검색할 수 있도록 하였다.
- 에 준하여구하였다. 즉, 검출한계는 S/N ratio가 3 : 1 이상이고, 유지시간이 표준물질과 일치할 때의 농도를 선택하였고, 정량한계는 LOD의 조건을 충족하면서 목적농도의 범위가 검량선에서 계산하였을 때 20% 이내의 농도를 선택하였다.
대상 데이터
- 약독물 검출시스템에 사용한 55종의 약물과 표준품의 구입처를 Table I에 나타내었다. Amitriptyline 등 36종의 약물은 Cerilliant사(Austin, TX, USA), benztropine 등 13종의 약물은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, bupivacaine, cloperastine 및 carbinoxamine은 Fluka사(St. Louis, MO, USA)에서, cyproheptadine은 Aldrich사 (Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였으며 itopride 및 tiropramide는 국내 제약회사에서 각각 표준품을 분양받아 사용하였다. 이들 표준품은 각각 메탄올로 1 및 10 mg/l 농도로 제조하여 표준용액으로 사용하였으며 분석시까지 -20℃에서 보관하였다.
- 이들 표준품은 각각 메탄올로 1 및 10 mg/l 농도로 제조하여 표준용액으로 사용하였으며 분석시까지 -20℃에서 보관하였다. 내부표준물질로 트리미프라민-중수소치환체(Trimipramine-D3, 100 mg/l, Cerilliant)를 메탄올로 희석하여 5 mg/l 농도로 조제한 것을 사용하였다. 시료 전처리에는 자동고상추출 장치(ASPEC XL 4TM, Gilson) 및 카트리지(Bond Elut-Certify®, 130 mg/3 ml, Varian)를 사용하였으며, 약독물 추출 등의 분석에 사용한 유기용매 및 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다.
- 본 원에 부검 의뢰된 변사체 혈액시료 중 약물이 검출되었던 실제 시료를 대상으로 본 프로그램을 적용하였다. 검출된 약물에 대하여 DrugMan 프로그램에서 얻어진 간이 정량값과 별도로 검량선을 작성하여 계산한 결과(기준값)를 비교하여 정확도를 계산하였다.
- DrugMan 프로그램을 실제 시료에 직접 적용시켜 약물 검색 및 간이 정량을 시행하였다. 시료는 당 연구원에 부검의뢰된 변사체의 혈액(ID 36566)을 사용하였는데, 혈액 1ml를 취하여 전술한 바와 같이 추출한 후 GC-MS 분석을 한 결과 Fig. 1과 같은 크로마토그램을 얻었다. Fig.
- 에서 보고한 62종 약물에 의거하였는데 이들은 최근 3년간 국내 변사체 혈액에서 검출된 약물 중 의료용 약물 중심으로 검출빈도수가 높으며, 자타살 목적으로 많이 사용되는 정신신경계용 약물을 중심으로 선별한 것이었다. 이들 약물 가운데 정량용 표준품이 없거나 GC-MS 분석이 적합하지 않은 7종의 약물은 본 연구에서 제외하고 최종적으로 55종의 약물을 선정하였다(Table II). 이들은 항우울제(대사체 포함) 14종, 항히스타민제 8종, 진정수면제 5종, 마약성진통제 5종, 항정신병약 3종, 국소마취제 3종, 진해거담제 3종, 파킨슨치료제 3종, 비만치료제 3종 및 기타 약물류 7종으로 구성되었다(Table II).
데이터처리
- 1 M 인산완충액을 넣고 전술한 방법과 같이 추출하여 DrugMan 프로그램을 적용하였을때 의음성 시료 개수(양성이나 음성으로 판단하는 약물 수)를 조사하여 아래의 식에따라 민감도율을 계산하였다.9) 시료는 3회씩 반복 시험하여 평균값을 구하였다.
- 1 M 인산완충액을 넣고 전술한 방법과 같이 추출하여 DrugMan 프로그램을 적용하였을때 의음성 시료 개수(양성이나 음성으로 판단하는 약물 수)를 조사하여 아래의 식에따라 민감도율을 계산하였다.9) 시료는 3회씩 반복 시험하여 평균값을 구하였다.
- 개발한 프로그램의 적용성 및 활용가능성을 검토하기위하여 민감도율과 정확도를 측정하고 실제 시료에 적용하여 결과를 비교하였다.
- 본 원에 부검 의뢰된 변사체 혈액시료 중 약물이 검출되었던 실제 시료를 대상으로 본 프로그램을 적용하였다. 검출된 약물에 대하여 DrugMan 프로그램에서 얻어진 간이 정량값과 별도로 검량선을 작성하여 계산한 결과(기준값)를 비교하여 정확도를 계산하였다.
이론/모형
- 55종 약물에 대한 검출한계 및 정량한계는 전보14)에 준하여구하였다. 즉, 검출한계는 S/N ratio가 3 : 1 이상이고, 유지시간이 표준물질과 일치할 때의 농도를 선택하였고, 정량한계는 LOD의 조건을 충족하면서 목적농도의 범위가 검량선에서 계산하였을 때 20% 이내의 농도를 선택하였다.
- 혈액에서 55종 약물의 분석은 고상추출법을 사용하였으며 추출과정은 전보4)에 준하였다. 약물이 검출되지 않음을 확인한 공시료 혈액 1ml에 표준용액 일정량 및 내부표준물질 30 µl를 가하고, 0.
성능/효과
- 1. 약독물 검출 시스템 확립을 위하여 목표약물 55종을 선별하였으며, 이들은 항우울제 14종, 항히스타민제 8종, 진정·수면제 5종, 마약성진통제 5종, 항정신병약 3종, 국소마취제 3종, 진해거담제 3종, 파킨슨치료제 3종, 비만치료제 3종 및 기타 약물류 7종이었다.
- 3. 검량선 범위에 따라 55종 약물을 4그룹으로 나누어 작성하였는데, 대다수의 약물은 상관계수(r2)가 0.98 이상으로 직선성을 나타냈다.
- 4. 55종 약물을 0.5 mg/l 농도로 첨가한 후 추출하여 DrugMan을 적용하여 검색한 결과 49종의 약물이 양성으로 반응하여 0.90(90%)의 민감도율을 보였다.
- 5. 29종 약물을 0.5 mg/l 농도로 첨가한 후 추출하여 DrugMan 을 적용하여 정량하였더니 0.36~0.64 mg/l 범위로서 정확도는 ±28% 이내였으며, 3일간 연속하여 반복 실험한 후 분석하였을 때 일간(inter-day) 정밀도는 모두 15% 이내였으며, 일내(intraday) 정밀도는 zolpidem 등 7종의 약물을 제외하고 모두 15% 이내였다.
- 3과 같이 출력되었다. DrugMan에 의한 분석결과 변사자 혈액에서 항히스타민제인 diphenhydramine 및 doxylamine이 양성으로 검출되었으며, 간이 정량값은 각각 0.11 및 0.10 mg/l이었다. Fig.
- a) At first in order to adjust standard retention time of 55 drug, retention time of internal standard was confirmed. b) Automatically retention time of drugs were revised following their reference retention time.
- 5~10 mg/l, 3)이었다. 검량선 작성 결과 대다수의 약물은 상관계수(r2)가 0.98 이상이었으며, 특히 20종의 약물은 r2값이 0.99이상으로 좋은 직선성을 보였다. 한편 phendimetrazine은 r2값이 0.
- 대부분의 약물은 ±10% 이내의 정확도를 보였지만 chlorpromazine, dihydrocodeine, diphenhydramine 및 imipramine의 4종 약물의 정확도가 ±20% 이상으로 비교적 크게 나타났다.
- 민감도율 − 55종 약물을 0.5 mg/l 농도로 공시료 혈액에 동시에 첨가한 후 추출하여 DrugMan 프로그램에 적용한 결과 49종의 약물을 양성으로 검출하고 6종의 약물은 인식하는데 실패하였다.
- 본 분석조건에서 itopride와 trazodone의 LOD 및 LOQ는 모두 0.5 mg/l이었으며, 대부분 약물의 LOD는 0.01∼0.05 mg/l 범위이었고, LOQ는 0.05∼0.1 mg/l 범위이었다(Table III).
- 본 연구에서는 55종의 약물을 선별하여 우선 자동 검색 및 간이 정량 기능을 가진 프로그램을 개발하였으며, 실제 변사자의 혈액 시료를 적용하였을 때 목적약물을 빠르게 검출하였을 뿐만 아니라 간이 정량까지 일련의 과정이 1분 이내에 이루어짐을 확인하였다. 비록 약물의 수는 전술한 일본의 프로그램에 비하여 적지만 실제 우리나라에서 가장 빈번하게 사용되는 약물을 대상으로 하였다는 점에서 의의가 있다고 생각된다.
- 한편 29종 약물에 대한 정밀도를 계산하였더니 일간(inter-day) 정밀도는 모두 15% 이내였고, 일내(intra-day) 정밀도는 zolpidem 등 7종의 약물이 15.3∼18.5%로 다소 높게 나타났으나 이들을 제외한 다른 약물은 모두 15% 이내였다(Table V).
- 한편 본 혈액에서 검출된 diphenhydramine 및 doxylamine의 정량분석을 위하여 별도로 검량선을 각각 작성하여 함량분석을 시행한 결과 두 약물 모두 0.13 mg/l이었다. DrugMan에 의한 간이 정량값과의 정확도를 계산하였을 때 diphenhydramine은-15.
후속연구
- 6. 실제 변사자의 혈액을 대상으로 DrugMan을 적용한 결과 1분 이내에 약물의 검색 및 간이 정량이 가능하였으므로 향후 더 많은 약물을 데이터베이스로 DrugMan에 입력하여 활용한다면 법독성학에서 매우 유용할 것으로 판단되었다.
- 또한 프로그램에 의한 간이 정량값의 정확도는 ±10% 이상으로서 다소 높게 나타나 향후 생체시료에서 약물간의 간섭효과를 최대한 제거할 수 있는 전처리 방법의 개선 등 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 사료되지만, 약물의 범위를 넓혀가면서 많은 약물을 데이터베이스로 프로그램에 입력시킨다면 생체시료에서 신속하고 정확한 약독물 분석결과를 도출할 수 있어 앞으로 법독성학 분야에서 유용할 것으로 기대된다.
- 하지만 이들 3종의 의음성 약물은 주요 프라그멘트 이온들을 입력하면 개별적으로 확인이 가능하였으므로 추출상의 문제는 없는 것으로 판단되었다. 한편 itopride, phentermine 및 trazodone의 경우는 주요 프라그멘트 이온에 대한 피크 면적이 너무 낮아 프로그램상에서 음성으로 인식하였는데, 이는 55종의 약물을 동시에 주입함에 따라 약물간의 간섭효과로 인하여 상대적으로 감도가 낮아진 것으로 추정되었으며 이들 약물에 대한 향후 분석조건 또는 추출조건의 검토하여 추출효율을 높일 수 있는 연구가 필요할 것으로 사료되었다. 한편 0.
- 99이상으로 좋은 직선성을 보였다. 한편 phendimetrazine은 r2값이 0.887로서 분석 약물 중 가장 낮은 직선성을 보여 좀더 검토가 필요할 것으로 사료되었다(Table II).
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