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문제 정의
- 본 연구에서는 산벚나무 수피의 추출물 및 용매분획별 시료의 항산화 및 항균활성, 그리고 tyrosinase 저해활성 등을 비교하기 위한 실험을 실시하였다. 총 polyphenol 함량 측정 결과, 75% EtOH 추출물 중 polyphenol 함량이 215.
- 본 연구에서는 화피의 75% ethanol 추출물과 용매분획별 항산화활성과 피부질환 중 여드름 원인균에 대한 항균활성과 피부 미백관련 활성으로 tyrosinase 저해 활성을 조사하여 생약재를 활용한 피부 관련 기능성 소재 개발의 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- DPPH radical 소거능 측정 − 75% EtOH 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다.
- Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정 − 75% EtOH 추출물 및 분획물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다.
- 총 flavonoid 함량 측정 − 페놀성 화합물중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.
- 추출 및 분획 − 건조된 산벚나무 수피 시료를 blender를 사용하여 마쇄한 후 75% ethanol(EtOH)을 추출 용매로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다.
- 추출 및 분획 − 건조된 산벚나무 수피 시료를 blender를 사용하여 마쇄한 후 75% ethanol(EtOH)을 추출 용매로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화하였고 이중 일부를 증류수에 분산시킨 후 chloroform(CHCl3), ethylacetate(EtOAc), butanol(BuOH)을 사용하여 순차적으로 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
- 1~10 mg/ml의 다양한 농도로 용해시킨 시료액 20 µl와 200 µM로 용해시킨 DPPH 용액 180 µl를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader(BIO-TEK, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도(SC50)를 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였다.
- 항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주를 멸균 면봉을 이용하여 100 µl씩 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 1, 5 mg이 되도록 paper disc(직경 6 mm)에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
대상 데이터
- 사용 균주 및 배지 − 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주인 Propionibacterium acnes(KCTC3314), Staphylococcus epidermidis(KCTC1917), Staphylococcus aureus(KCTC3881)는 한국생명공학연구원 생물자원센터(BRC)에서 분양 받은 것을 실험에 사용하였다. P. acnes 균주는 Reinforced Clostridial Medium(RCM)을 사용하였으며, S. epidermidis와 S. aureus 균주는 Nutrient agar 및 broth를 사용하였다.
- 사용 균주 및 배지 − 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주인 Propionibacterium acnes(KCTC3314), Staphylococcus epidermidis(KCTC1917), Staphylococcus aureus(KCTC3881)는 한국생명공학연구원 생물자원센터(BRC)에서 분양 받은 것을 실험에 사용하였다.
- 식물재료 − 본 실험에 사용된 산벚나무 수피는 2010년 6월 전라남도 나주시의 야산에 자생하는 산벚나무에서 분리한 것으로 수세 후 50℃에서 건조시킨 후 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였으며, 표품은 동신대학교 생물자원산업화지원센터에 보관되어 있다.
데이터처리
- Different superscript letters in the same concentration show significant differences at p<0.05 by one-way ANOVA.
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의미를 부여하였다.
- 통계분석 − 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차(mean±SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0(SPSS Inc, Chicago, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 저해 활성 측정 − Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법으로 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다.
- 총 polyphenol 함량 측정 − Folin-Denis법을 이용하여 75% EtOH 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량을 측정하였다.
성능/효과
- 이와 같은 polyphenol 함량은 천궁의 지상부와 같은 약재의 추출물에 존재하는 polyphenol 함량과 유사한 수준이며, 황기와 같은 약재의 추출물 중의 함량보다는 월등히 높은 수준임을 알 수 있었다.23,24) BuOH 분획의 polyphenol 함량 역시 318.8 mg/g으로 75% EtOH 추출물보다 높게 나타났으며, CHCl3과 aqueous 분획의 함량은 각각 26.5 mg/g과 89.4 mg/g으로 추출물보다 현저히 낮아지는 것으로 나타났다. 이는 추출물 중에 존재하는 polyphenol 화합물 대부분이 EtOAc와 BuOH 분획으로 분리되어 나온 것을 의미한다.
- 75% EtOH 추출물과 용매 분획별 시료의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table I에 제시하였다. 75% EtOH 추출물 중 polyphenol 함량이 215.9 mg/g으로 나타났고, 용매 분획별 시료에서 EtOAc 분획의 함량이 378.0 mg/g으로 가장 높게 나타났다. 이와 같은 polyphenol 함량은 천궁의 지상부와 같은 약재의 추출물에 존재하는 polyphenol 함량과 유사한 수준이며, 황기와 같은 약재의 추출물 중의 함량보다는 월등히 높은 수준임을 알 수 있었다.
- DPPH radical 소거능 − 75% EtOH 추출물과 용매 분획별 항산화 활성을 확인하기 위해 실시한 DPPH radiacl 소거능 측정에서 Fig. 1에 나타난 바와 같이 0.5 mg/ml 농도의 시료를 처리한 소거능 결과에서 EtOAc 분획과 BuOH 분획이 각각 80.47%와 78.97%의 radical을 소거함으로써 상대적으로 높은 활성을 나타내었다.
- 2에 나타난 바와 같이 EtOAc 분획과 BuOH 분획, 그리고 75% EtOH 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 다른 시료에 비해 높게 나타났고 특히, EtOAc 분획의 저해 활성은 positive control로 사용된 ascorbic acid의 저해 활성보다도 높은 수준임을 확인할 수 있었다. EtOAc 분획 이외에도 BuOH 분획과 75% EtOH 추출물에서도 비교적 높은 수준의 tyrosinase 저해 활성이 확인되었으나 CHCl3 분획과 aqueous 분획의 tyrosinase 저해 활성은 실험이 실시된 가장 높은 농도인 5 mg/ml에서 7.38%와 19.37%로 EtOAc 분획의 101.38%, BuOH 분획의 81.78% 등에 비해 현저하게 낮은 활성을 나타냈다. 산벚나무 수피의 열수와 80% EtOH 추출물을 대상으로 한 기존의 연구에서 보고한 tyrosinase 저해 활성에 비해 본 연구에서 비교한 용매분획별 활성이 높은 수준으로 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 활성이 높은 분획을 대상으로 활성물질 분리 및 규명에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- 276 mg/ml로 거의 동일한 수준으로 나타났다. Positive control로 사용된 ascorbic acid 의 SC50 값을 기준으로 비교한 결과, 75% EtOH 추출물의 활성이 40.37% 수준으로 나타났고 EtOAc 분획과 BuOH 분획의 활성이 각각 54.51%와 54.71% 수준으로 다른 분획에 비해 높게 나타났다.
- 13 mm의 저해환을 형성함으로써 EtOAc 분획 다음으로 높은 항균활성을 가지는 것으로 나타났다. S. aureus 균주에 대한 항균활성의 결과에서 Table V에 나타난 바와 같이 EtOAc 분획의 저해환이 1 mg/disc와 5 mg/disc 농도에서 각각 11.23 mm와 14.67 mm로 나타남으로써 다른 원인균의 결과와 마찬가지로 가장 강한 항균활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 기존의 연구 보고에서 밝힌 P.
- 87 mm의 생육저해환을 형성함으로써 가장 강력한 항균활성을 나타내었다. S. epidermidis에 대한 항균활성에서도 EtOAc 분획과 BuOH 분획의 항균활성이 추출물보다 향상됨과 동시에 다른 분획 시료보다 뛰어난 결과를 보였다. 또한 대표적인 병원성 균주인 S.
- Tyrosinase 저해 활성 − 피부에 침착되는 색소인 melanin 형성에 있어 중요한 단계를 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려진 tyrosinase를 저해하는 활성을 측정한 결과 Fig. 2에 나타난 바와 같이 EtOAc 분획과 BuOH 분획, 그리고 75% EtOH 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 다른 시료에 비해 높게 나타났고 특히, EtOAc 분획의 저해 활성은 positive control로 사용된 ascorbic acid의 저해 활성보다도 높은 수준임을 확인할 수 있었다.
- aureus를 대상으로 한 실험에서도 EtOAc 분획의 항균활성이 상대적으로 강한 것으로 나타났다. Tyrosinase 저해활성에서 EtOAc 분획과 BuOH 분획, 그리고 75% EtOH 추출물의 활성이 높은 수준임을 확인할 수 있었으며, 특히 EtOAc 분획의 경우 positive control인 ascorbic acid보다도 높은 활성을 보였다. 이상의 결과를 종합해보면 추출물 시료 중에 존재하는 생리활성 물질의 대부분이 EtOAc 분획과 BuOH 분획으로 분리되어 나온 것으로 판단할 수 있으며, 특히 EtOAc 분획의 활성이 가장 높은 것을 확인하였다.
- 97%의 radical을 소거함으로써 상대적으로 높은 활성을 나타내었다. 또한 동일한 농도에서 75% EtOH 추출물의 소거능 역시 63.89%을 나타냄으로써 추출물 수준의 항산화 효능 또한 높은 수준임을 확인할 수 있었다. 그러나 CHCl3 분획과 aqueous 분획의 경우, 동일 농도에서 각각 10.
- 여드름 원인균에 대한 항균활성 − 여드름의 원인과 관련된 균주에 대한 항균활성 측정 결과, 측정에 사용된 원인균 모두에서 EtOAc 분획이 가장 강한 항균활성을 가지는 것으로 나타났다.
- Tyrosinase 저해활성에서 EtOAc 분획과 BuOH 분획, 그리고 75% EtOH 추출물의 활성이 높은 수준임을 확인할 수 있었으며, 특히 EtOAc 분획의 경우 positive control인 ascorbic acid보다도 높은 활성을 보였다. 이상의 결과를 종합해보면 추출물 시료 중에 존재하는 생리활성 물질의 대부분이 EtOAc 분획과 BuOH 분획으로 분리되어 나온 것으로 판단할 수 있으며, 특히 EtOAc 분획의 활성이 가장 높은 것을 확인하였다.
- 0 mg/g으로 가장 높게 나타났다. 이와 같은 polyphenol 함량은 천궁의 지상부와 같은 약재의 추출물에 존재하는 polyphenol 함량과 유사한 수준이며, 황기와 같은 약재의 추출물 중의 함량보다는 월등히 높은 수준임을 알 수 있었다.23,24) BuOH 분획의 polyphenol 함량 역시 318.
- 37%의 소거능을 보여줌으로써 다른 분획이나 75% EtOH 추출물에 비해 낮은 활성을 가지는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 Table I의 polyphenol 함량 측정의 결과와 유사한 양상임을 확인할 수 있는데, 이는 기존의 연구들에서 제시한 것과 마찬가지로 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성이 polyphenol 화합물의 함량과 밀접한 연관관계가 있음을 확인할 수 있었다.23,25)
- 본 연구에서는 산벚나무 수피의 추출물 및 용매분획별 시료의 항산화 및 항균활성, 그리고 tyrosinase 저해활성 등을 비교하기 위한 실험을 실시하였다. 총 polyphenol 함량 측정 결과, 75% EtOH 추출물 중 polyphenol 함량이 215.9 mg/g으로 나타났고, 용매 분획별 시료에서 EtOAc 분획의 함량이 378.0 mg/g으로 가장 높게 나타났다. Flavonoid 함량에서는 EtOAc 분획 시료에서 67.
- 07 mm의 저해환을 형성함으로써 가장 높은 항균활성을 나타내었다. 한편, 1 mg/disc 농도에서 75% EtOH 추출물과 CHCl3 분획의 결과와 통계적으로 동일한 수준의 항균활성을 보였던 BuOH 분획이 5 mg/disc 농도에서는 16.13 mm의 저해환을 형성함으로써 EtOAc 분획 다음으로 높은 항균활성을 가지는 것으로 나타났다. S.
- 6 mg/g의 함량을 나타냈다. 항산화활성을 확인하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능 측정에서 EtOAc 분획물, BuOH 분획물, 75% EtOH 추출물 순으로 소거능이 높은 것으로 확인되었다. 이는 활성물질군인 polyphenol이나 flavonoid 함량 측정에서 EtOAc 분획과 BuOH 분획의 함량이 다른 시료에 비해 높게 나온 결과와 높은 연관성이 있는 것으로 판단된다.
후속연구
- 1-3) 지금까지 밝혀진 주요성분으로는 sakuranin을 포함하여 taxifolin, naringenin, pinostobin 등이 있으며, 관련된 활성으로 항산화 활성과 면역억제 활성, 아토피성 염증 억제, tyrosinase 저해 활성 등이 연구되어 왔다.4-9,26) 그러나 연구의 수준이 추출물을 단계에서만 이루어진 것이 대부분이고 동명의 생약재인 자작나무 유래의 화피에 대해서만 용매분획에 따른 항체생산능 등에 대한 연구가 이루어져 벚나무 유래의 화피에 대한 보다 구체적인 연구가 필요하다고 할 수 있다.10)
- 78% 등에 비해 현저하게 낮은 활성을 나타냈다. 산벚나무 수피의 열수와 80% EtOH 추출물을 대상으로 한 기존의 연구에서 보고한 tyrosinase 저해 활성에 비해 본 연구에서 비교한 용매분획별 활성이 높은 수준으로 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 활성이 높은 분획을 대상으로 활성물질 분리 및 규명에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.5,26)
- 67 mm로 나타남으로써 다른 원인균의 결과와 마찬가지로 가장 강한 항균활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 기존의 연구 보고에서 밝힌 P. acnes와 S. epidermidis 균주에 대한 산벚나무 수피 추출물의 항균 효과보다는 다소 차이는 있었지만 유사한 수준이었으나 동일한 연구에서 항균 효과가 전혀 없었던 것으로 밝힌 S. aureus 균주에 대한 항균 활성이 확인됨으로써 산벚나무의 산지나 품종 등에 따른 활성의 차이에 대한 추가적인 검토가 필요할 것으로 판단된다.26)
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