선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 저자는 赤芍藥 추출물의 열수 추출과 에탄올 추출에 따른 세포에 대한 독성, 대식세포에서의 NO의 생성, PGE2의 생성 등 항염증 효과에 대해 실험적 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 10% inactivated fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin · streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)을 배양액으로 사용하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 조건의 배양기에서 배양하였다.
- LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 대식세포에서의 염증반응을 알아보기 위해 열수 추출과 에탄올 추출로 추출된 赤芍藥 추출물이 세포독성, NO 생성량, PGE2 생성률에 미치는 영향을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 열수 추출 조제방법은 적작약 300g을 중량하고 3차 증류수 2L와 혼합하여 100℃로 4시간 동안 중탕하여 열수 추출하였으며, 여과지로 여과한 추출액을 rotary evaporator를 이용하여 100㎖까지 농축하고 -80℃로 동결하였다. 농축한 동결액을 freezing dryer system (Labconco, USA)을 이용하여 7일간 동결 건조하였다. 에탄올 추출 조제방법은 적작약 300g을 중량하고 70% 에탄올 2L와 혼합하여 70℃로 4시간 추출하였으며, 상층액을 여과지로 여과하였으며 rotary evaporator를 이용하여 농축하였다.
- 7 대식세포를 선정하여 赤芍藥을 材料로 한 추출물을 대식세포에 투여하여 赤芍藥 추출물의 세포독성에 대해 관찰하고자 MTT assay를 시행하였고, 赤芍藥 추출물이 염증반응에 있어서 중요한 free radical인 NO에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 NO의 분비량을 측정하였으며, PGE2의 생성에 미치는 변화를 관찰하고자 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 R&D systems(Minneapolis, USA)에서 구입하여 실험하였다. 또한 각각의 실험에서 적작약을 열수 추출과에탄올 추출법으로 달리 추출하여 실험적 영향을 비교 관찰하였다.
- 안정화시킨 세포에 시료를 농도별로 처리하고 16시간 동안 배양 후 MTT 용액(5㎍/㎖)을 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO(dimethylsulfoxide) 300 또는 100㎕를 넣어 보라색의 formazan이 용출되도록 하여 ELISA reader를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 배양상층액 100㎕와 Griess 시약(0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride 50㎕ & 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 50㎕) 100㎕를 섞어 흡광도 540㎚에서 측정하였다.
- 세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT)시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosman12)의 방법을 변형하여 측정하였다. RAW 264.
- 세포로부터 생성되는 NO의 양은 세포 배양액 중 존재하는 NO2- 형태를 Griess 시약 반응을 이용하여 측정하였다. 세포를 well당 1×105이 되도록 96well plate에 깔고 16시간 동안 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기에서 세포를 안정화했다.
- 의 측정은 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 R&D systems(Minneapolis, USA) 에서 구매하여 사용하였으며, 측정방법은 제조회사의 설명서를 준용하였다. 실험방법은 RAW 264.7 세포에 한약 추출물을 1시간 전처치하고 10㎍/㎖의 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 18시간 배양한 후 세포 배양 상층 액을 거둬들여 PGE2 측정에 사용하였는데, 배양액을 goat anti-mouse로 coating된 96well plate 에 각각의 배양액을 100㎕씩 loading하였다. 여기에 primary antibody solution 50㎕와 PGE2 conjugate 50㎕씩 첨가하여 4℃에서 overnight시킨 다음, 기질 용액을 200㎕씩 처리하여 5~20분간 반응시킨 후, 50㎕ 의 stop solution을 처리하고 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 세포에 한약 추출물을 1시간 전처치하고 10㎍/㎖의 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 18시간 배양한 후 세포 배양 상층 액을 거둬들여 PGE2 측정에 사용하였는데, 배양액을 goat anti-mouse로 coating된 96well plate 에 각각의 배양액을 100㎕씩 loading하였다. 여기에 primary antibody solution 50㎕와 PGE2 conjugate 50㎕씩 첨가하여 4℃에서 overnight시킨 다음, 기질 용액을 200㎕씩 처리하여 5~20분간 반응시킨 후, 50㎕ 의 stop solution을 처리하고 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 赤芍藥은 (주)HMAX에서 구매하여 사용하였다. 열수 추출 조제방법은 적작약 300g을 중량하고 3차 증류수 2L와 혼합하여 100℃로 4시간 동안 중탕하여 열수 추출하였으며, 여과지로 여과한 추출액을 rotary evaporator를 이용하여 100㎖까지 농축하고 -80℃로 동결하였다. 농축한 동결액을 freezing dryer system (Labconco, USA)을 이용하여 7일간 동결 건조하였다.
- 이에 저자는 염증 매개물질의 생성에 미치는 영향을 연구하기 위해 LPS로 염증 유발된 RAW 264.7 대식세포를 선정하여 赤芍藥을 材料로 한 추출물을 대식세포에 투여하여 赤芍藥 추출물의 세포독성에 대해 관찰하고자 MTT assay를 시행하였고, 赤芍藥 추출물이 염증반응에 있어서 중요한 free radical인 NO에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 NO의 분비량을 측정하였으며, PGE2의 생성에 미치는 변화를 관찰하고자 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 R&D systems(Minneapolis, USA)에서 구입하여 실험하였다.
대상 데이터
- 赤芍藥은 (주)HMAX에서 구매하여 사용하였다. 열수 추출 조제방법은 적작약 300g을 중량하고 3차 증류수 2L와 혼합하여 100℃로 4시간 동안 중탕하여 열수 추출하였으며, 여과지로 여과한 추출액을 rotary evaporator를 이용하여 100㎖까지 농축하고 -80℃로 동결하였다.
- 실험에 사용된 세포는 생쥐대식세포 주인 RAW 264.7 세포주를 ATCC(USA)로부터 분양받아 사용하였다. 10% inactivated fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin · streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)을 배양액으로 사용하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 조건의 배양기에서 배양하였다.
- 7 cell은 대식세포주로서 LPS 등과 같은 cytokine의 자극만으로도 스스로 NO를 생성하는 특성을 가지고 있어서 일반적으로 세포독성이 있는 물질들의 독성검정을 위해 유용하게 사용되고 있다17). 이러한 RAW 264.7 cell의 염증 활성화에 LPS를 사용하였다.
데이터처리
- 효과를 판정하기 위한 통계학적 분석은 graphpad prism program의 student’s t-test를 실시하였다. 그래프 작성은 Microsoft Office Excel 2010을 사용하였다.
- 실험결과는 SPSS Window program(Ver 10.0)을 이용하였으며, 측정값은 평균값±표준편차(mean±standard error)로 나타내었고, p<0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 효과를 판정하기 위한 통계학적 분석은 graphpad prism program의 student’s t-test를 실시하였다.
성능/효과
- 1. 열수 추출한 赤芍藥 추출물은 1, 5, 25, 125㎍/㎖에서 세포생존율에서 유의한 감소를 나타내지 않았다.
- 2. 에탄올 추출한 赤芍藥 추출물은 1, 5, 25, 125, 625㎍/㎖에서 세포생존율에서 유의한 감소를 나타내지 않았다.
- 3. 열수 추출한 赤芍藥 추출물 25, 125㎍/㎖ 처치군은 LPS 단독처리군에 비하여 NO의 생성을 유의하게 감소시켰다.
- 4. 에탄올 추출한 赤芍藥 추출물 125, 625㎍/㎖ 처치군은 LPS 단독처리군에 비하여 NO의 생성을 유의하게 감소시켰다.
- 5. 열수 추출한 赤芍藥 추출물 150, 200㎍/㎖ 처치군은 LPS 단독처리군에 비하여 PGE2의 생성률을 유의하게 감소시켰다.
- PGE2 생성률을 조사한 결과 적작약 추출물을 처리하지 않은 Control군에서는 821.24±1.63pg/well로 나타났고, 열수 추출한 赤芍藥 실험군에서는 50, 100, 150 및 200㎍/㎖로 처리한 군에서는 각각 847.60±5.61, 839.01±7.58, 740.40±9.07 및 715.75±10.26pg/well로 나타났으며, 150 및 200㎍/㎖ 처치군에서는 대조군에 비해 유의한 감소가 관찰되었다(Fig. 5).
- 赤芍藥 추출물의 농도가 세포 내에서 독성을 일으키는지 확인하기 위해 실험한 결과, 열수 추출한 赤芍藥 추출물 625㎍/㎖와 3125㎍/㎖에서 통계학적으로 유의한 감소가 나타났으며(Fig. 1), 에탄올 추출한 赤芍藥 추출물은 3125㎍/㎖에서 통계학적으로 유의한 감소가 나타났다(Fig. 2).
- 赤芍藥의 농도가 세포 내에서 독성을 일으키는지 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 측정한 결과, 열수 추출한 赤芍藥의 대조군 생존율을 100±4.98%로 설정하였을 때 1, 5, 25, 125, 625 및 3,125㎍/㎖에서 각각 101.677±6.72, 99.92±0.91, 105.83±5.88, 90.53±5.11, 87.50±1.99 및 69.41±11.02%로 나타났으며, 625 및 3,125㎍/㎖ 처치군에서 세포 생존율이 유의하게 감소하였다(Fig. 1).
- 赤芍藥이 NO의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 단독으로 LPS 10㎍/㎖를 처리하고 실험한 군과 LPS10㎍/㎖에 열수 추출한 赤芍藥과 에탄올 추출한 赤芍藥을 1, 5, 25, 125㎍/㎖ 농도로 처리한 군과 NO 생성률을 비교하였는데, 열수 추출한 赤芍藥을 25, 125㎍/㎖ 농도로 처리한 군에서 유의한 감소를 보였는데(Fig. 3), 이는 열수 추출한 赤芍藥의 농도가 25, 125㎍/㎖에서는 염증 유발물질인 NO 생성에 유의한 억제 효과가 있다는 것을 의미한다. 세포에 독성이 없으면서도 NO생성에 유의한 억제 효과가 있는 것으로 보아 赤芍藥 열수 추출물에 항염증 효과가 있음을 알 수 있었고, 결과에 625, 3125㎍/㎖ 농도로 처리한 기준이 빠지게 된 것은 세포독성으로 인한 영향이 포함된 결과로 직접 언급하지 않았다.
- 赤芍藥이 PGE2 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 LPS 처리하지 않은 정상군에서는 큰 변화가 나타나지 않은 반면 LPS군에서는 821.24±1.63 pg/well 로 PGE2 생성에 큰 변화가 나타났다.
- 이는 赤芍藥 추출법에 따라서 PGE2 생성에 미치는 영향에 차이가 있음을 추정할 수 있다. 따라서 赤芍藥의 추출법으로는 이 실험의 결과만을 놓고 보았을 때는 에탄올 추출법보다는 열수 추출에 의한 赤芍藥 추출물의 생성이 보다 의미 있는 추출법이라고 사료된다.
- 상기 실험 결과, RAW 264.7 대식세포를 열수 추출한 赤芍藥과 에탄올 추출한 赤芍藥으로 처리한 후 NO 생성량, PGE2 생성에 미치는 영향을 평가한 결과 대조군에 비해 통계적으로 유의한 감소가 나타났다.
- 3), 이는 열수 추출한 赤芍藥의 농도가 25, 125㎍/㎖에서는 염증 유발물질인 NO 생성에 유의한 억제 효과가 있다는 것을 의미한다. 세포에 독성이 없으면서도 NO생성에 유의한 억제 효과가 있는 것으로 보아 赤芍藥 열수 추출물에 항염증 효과가 있음을 알 수 있었고, 결과에 625, 3125㎍/㎖ 농도로 처리한 기준이 빠지게 된 것은 세포독성으로 인한 영향이 포함된 결과로 직접 언급하지 않았다.
- 에탄올 추출한 赤芍藥의 경우 PGE2 생성률을 조사한 결과 적작약 추출물을 처리하지 않은 Control군에서는 821.24±1.63 pg/well로 나타났으며, 에탄올 추출한 赤芍藥 실험군에서는 50, 100, 150 및 200㎍/㎖로 처리한 군에서는 각각 834.52±10.34, 820.88±14.65, 807.62±12.11 및 816.65±17.32pg/well로 나타났으며, 유의성은 나타나지 않았다(Fig. 6).
- 에탄올 추출한 赤芍藥의 경우 nitric oxide 생성률을 조사한 결과 적작약 추출물을 처리하지 않은 Control 군에서는 68.28±2.72µM 농도로 나타난 반면, 赤芍藥을 1, 5, 25, 125 및 625㎍/㎖ 농도로 처리한 군에서는각각 65.03±2.37, 61.76±2.71, 62.37±1.94, 55.14±1.71 및 32.09±1.47µM로 나타났으며, 25 및 125㎍/㎖ 처치군에서는 대조군에 비해 유의한 감소가 관찰되었다(Fig. 4).
- 에탄올 추출한 赤芍藥의 대조군 생존율을 100±3.39%로 설정하였을 때 1, 5, 25, 125, 625 및 3,125㎍/㎖에서 각각 99.68±5.29, 98.24±4.63, 95.93±0.51, 96.21±2.99, 95.63±7.09 및 59.58±9.36%로 나타났으며, 3125㎍/㎖ 처치군에서 세포생존율이 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
- 63 pg/well 로 PGE2 생성에 큰 변화가 나타났다. 열수 추출한 赤芍藥에서는 150 및 200㎍/㎖로 처리한 군에서는 통계학적으로 유의한 감소가 나타나(Fig. 5), 열수 추출한 赤芍藥이 중요한 염증매개물질의 하나인 PGE2 생성에 유의한 억제 효과가 있다는 것을 알 수 있었으나 에탄올 추출한 赤芍藥 실험군에서는 유의한 감소가 나타나지 않았다(Fig. 6). 이는 赤芍藥 추출법에 따라서 PGE2 생성에 미치는 영향에 차이가 있음을 추정할 수 있다.
- 열수 추출한 赤芍藥의 경우 NO 생성률을 조사한 결과, 적작약 추출물을 처리하지 않은 Control군에서는 49.57±2.50µM 농도로 나타난 반면, 赤芍藥을 1, 5, 25 및 125㎍/㎖ 농도로 처리한 군에서 각각 49.13±1.99, 46.07±0.97, 41.91±2.64 및 33.85±2.26µM로 나타났으며, 25 및 125㎍/㎖ 처치군에서는 대조군에 비해 유의한 감소가 관찰되었다(Fig. 3).
후속연구
- 따라서 赤芍藥 추출물이 일정 농도에서는 세포에 독성을 유발시키지 않으며 활성화된 대식세포로부터 유발되는 NO 및 PGE2 생성을 효과적으로 억제함으로써 각종 염증질환 치료를 위한 약물로 사용할 수 있을 것으로 사료되고 또한 농도 및 추출용매의 다양화를 통해 약재 추출물의 항염증 효과 극대화에 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
- 4), 이는 에탄올 추출한 赤芍藥의 농도가 125, 625㎍/㎖에서는 염증 유발물질인 NO 생성에 유의한 억제 효과가 있다는 것을 의미한다. 열수 추출한 赤芍藥 추출물과 에탄올 추출한 赤芍藥 추출물의 농도가 본 실험에서는 공통적으로 NO 생성에 억제 효과를 나타내는 농도가 125㎍/㎖라는 것이 발견되어 향후 항염증 억제제로서의 赤芍藥 추출액 농도에 대한 지속적인 연구가 필요하리라 사료된다.
- 이러한 결과로 보아 赤芍藥 추출물은 3125㎍/㎖의 과량 투여 시에는 오히려 세포에 독성을 초래한다는 사실을 알게 되었고 NO 생성량 감소, PGE2 생성 억제에 의한 항염증효과를 보여주는 것으로 사료되며, 추출법에 따른 항염증 효과의 차이가 존재한다는 것이 밝혀진 만큼 앞으로 다른 약재들에서의 추출 용매의 다양화 및 적용 농도에 대한 연구가 지속적으로 활성화 되어야 할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.