병원균에 대한 정확한 동정은 임상 연구실에서 필수적인 요소의 하나이다. Chyseobacterium indologenes에 대한 동정을 포함한 분자생물학적 분석과 리보솜의 16S rRNA 유전자로 한국에서 추출한 17검체와 GenBank에서 Chyseobacterium속 검색을 통해 이들과 계통관계를 평가하였다. C. indologenes의 배당 서열은 1,176 nucleotides였다. C. indologenes 내의 서열 변이는 주로 염기 치환이었다. 한국의 C. indologenes 검체는 다른 나라의 동 종과 크게 다르지 않았다. 그런데 한국의 C. indologenes의 치환율은 GenBank에 있는 동종보다 높았다. C. indologenes는 C. isbiliense, C. hominis, C. hispanicum, C. molle, C. hungaricum, and C. pallidum과 자매종을 형성하였다.
병원균에 대한 정확한 동정은 임상 연구실에서 필수적인 요소의 하나이다. Chyseobacterium indologenes에 대한 동정을 포함한 분자생물학적 분석과 리보솜의 16S rRNA 유전자로 한국에서 추출한 17검체와 GenBank에서 Chyseobacterium속 검색을 통해 이들과 계통관계를 평가하였다. C. indologenes의 배당 서열은 1,176 nucleotides였다. C. indologenes 내의 서열 변이는 주로 염기 치환이었다. 한국의 C. indologenes 검체는 다른 나라의 동 종과 크게 다르지 않았다. 그런데 한국의 C. indologenes의 치환율은 GenBank에 있는 동종보다 높았다. C. indologenes는 C. isbiliense, C. hominis, C. hispanicum, C. molle, C. hungaricum, and C. pallidum과 자매종을 형성하였다.
Accurate identification for pathogenic bacterium is an essential element in the clinical microbiology laboratory. We studied molecular analysis involving the identification of Chyseobacterium indologenes and evaluated the seventeen isolates in Korea with the 16S rRNA gene of the ribosome to estimate...
Accurate identification for pathogenic bacterium is an essential element in the clinical microbiology laboratory. We studied molecular analysis involving the identification of Chyseobacterium indologenes and evaluated the seventeen isolates in Korea with the 16S rRNA gene of the ribosome to estimate phylogenetic relationships within the genus Chyseobacterium in GenBank. The aligned data sets for C. indologenes were 1,176 nucleotides. Sequence variation within the C. indologenes was mostly due to nucleotide substitutions. Korean C. indologenes isolates were not strikingly different from the same species found in the other countries. However, the rates of base substitution in Korean C. indologenes isolates were higher than those of other C. indologenes isolates in GenBank. C. indologenes was placed as a sister species to C. isbiliense, C. hominis, C. hispanicum, C. molle, C. hungaricum, and C. pallidum.
Accurate identification for pathogenic bacterium is an essential element in the clinical microbiology laboratory. We studied molecular analysis involving the identification of Chyseobacterium indologenes and evaluated the seventeen isolates in Korea with the 16S rRNA gene of the ribosome to estimate phylogenetic relationships within the genus Chyseobacterium in GenBank. The aligned data sets for C. indologenes were 1,176 nucleotides. Sequence variation within the C. indologenes was mostly due to nucleotide substitutions. Korean C. indologenes isolates were not strikingly different from the same species found in the other countries. However, the rates of base substitution in Korean C. indologenes isolates were higher than those of other C. indologenes isolates in GenBank. C. indologenes was placed as a sister species to C. isbiliense, C. hominis, C. hispanicum, C. molle, C. hungaricum, and C. pallidum.
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제안 방법
병원균에 대한 정확한 동정은 임상 연구실에서 필수적인 요소의 하나이다. Chyseobacterium indologenes에 대한 동정을 포함한 분자생물학적 분석과 리보솜의 16S rRNA 유전자로 한국에서 추출한 17검체와 GenBank에서 Chyseobacterium속 검색을 통해 이들과 계통관계를 평가하였다. C.
DNA 서열에서 염기 치환이 같은 패턴으로 진화해왔다는 가설을 몬테-카를로 테스트(1000 반복)로 검증하였다(Table 3).
PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA 50 ng, 각 dNTPs, 100 μM, 시발체 각 0.2 μM, 1× enzyme buffer, Taq polymerase 2 unit를 넣고 증류수로 전체 50 μl volume이 되도록 추가하였다.
또한 Chyseobacterium속의 종이 ß-lactamase를 생성하여 그람 음성균에 의한 감염의 치료로 사용되는 aminoglycosides계, ß-lactam계 항생제, tetracyclines, chloramphenicol 등에 본질적으로 저항성을 지니며 약제 사용에 대한 저항성 균주의 발생을 야기할 수 있는 서열 치환, 삽입, 결실, 중복 등 돌연변이에 의한 염기 변화를 탐지하기 위한 검체들 내 서열 간 차이가 있는지 변이를 분석하였다.
621번째부터 CID27에서 많은 변이가 관찰되었다. 모든 균주 간 유전적 거리를 산출하였다(Table 3). CID11번과 CID22번 균주 간 가장 유전적으로 먼 유연관계를 나타내었다.
본 연구에서는 전통적인 생화학적 방법 또는 동정용 키트로도 명확하게 드러나지 않는 30검체를 분석하여 동일한 서열을 가진 같은 계보의 검체를 제외한 17균주와 GenBank에서 얻은 서열과 비교하였다. 또한 Chyseobacterium속의 종이 ß-lactamase를 생성하여 그람 음성균에 의한 감염의 치료로 사용되는 aminoglycosides계, ß-lactam계 항생제, tetracyclines, chloramphenicol 등에 본질적으로 저항성을 지니며 약제 사용에 대한 저항성 균주의 발생을 야기할 수 있는 서열 치환, 삽입, 결실, 중복 등 돌연변이에 의한 염기 변화를 탐지하기 위한 검체들 내 서열 간 차이가 있는지 변이를 분석하였다.
57의 NEIGHBOR, neighbor-joining (NJ) 방법에 의해 구성하였다[5,15]. 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 1,000회 반복법으로 실시하였다.
염기 치환에 대한 가능성과 transition/transversion의 비는 Tamura 등[2004]의 방법으로 산출하였다. 서열 간 코돈의 중립성 검증은 갭(gap)과 결손 서열을 제외하고 1,000회 반복으로 MEGA4로 실시하였다[11]. 다양도와 돌연변이 정도는 Tajima의 여러 통계 척도(M=number of sites, S=Number of segregating sites, ps=S/M, and π=nucleotide diversity.
현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Corperation, CA, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, ICI Americas Inc., USA)로 추출하였다. 추출된 DNA를 bluescript II SK(+) vector (Invitrogen, Life Technologies, USA)로 클로닝한 후 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, USA)로 염기서열을 분석하였다.
최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bisection-reconnection에 따랐다[17]. 최우법(maximum likelihood tree, ML), N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.
, USA)로 추출하였다. 추출된 DNA를 bluescript II SK(+) vector (Invitrogen, Life Technologies, USA)로 클로닝한 후 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, USA)로 염기서열을 분석하였다.
전기영동 후 젤은 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다. 현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Corperation, CA, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, ICI Americas Inc.
대상 데이터
동정용 키트로도 명확하게 드러나지 않는 30검체를 분석하였다. 이 중 동일한 서열을 가진 같은 계보의 검체는 한 검체만 남기고 제외하여 총 17균주의 서열을 사용하였다.
본 분석에 사용한 시료는 2007년부터 2009년까지 서울특별시 oo대학교 의료원에서 배양 의뢰한 임상검체에서 증식된 세균 중 전통적인 생화학적 방법 또는 동정용 키트(VITEK system, BIOMḖRIEUX, Marcy-I'Toile, France)로 동정이 불명확한 세균 30주를 대상으로 하였다.
데이터처리
)로 편집하였다. 이들 서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA version 4.1과 Clustal X program으로 분석하였다[20]. 배당된 서열에서 갭의 부위는 missing data로 처리하였다.
프로그램 PAUP* (Phylogenetic Analysis Using Parsimony)에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, uncorrected "p"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다[17].
이론/모형
DNA 추출은 상등액 10 μl를 사용하였다. 각 균주로부터 DNA를 추출하기 위한 시약은 DNA Zol Reagent(Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA)를 사용하였다 추출방법은 사용자의 지침서에 의거하여 추출하였다. 추출된 DNA는 진공 흡입기로 5분간 건조시킨 후 TE(10 mM Tris, pH 8.
최우법(maximum likelihood tree, ML), N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-joining (NJ) 방법에 의해 구성하였다[5,15]. 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 1,000회 반복법으로 실시하였다.
염기 치환에 대한 가능성과 transition/transversion의 비는 Tamura 등[2004]의 방법으로 산출하였다. 서열 간 코돈의 중립성 검증은 갭(gap)과 결손 서열을 제외하고 1,000회 반복으로 MEGA4로 실시하였다[11].
최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bisection-reconnection에 따랐다[17]. 최우법(maximum likelihood tree, ML), N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다.
성능/효과
indologenes의 배당 서열은 1,176 nucleotides였다. C. indologenes 내의 서열 변이는 주로 염기 치환이었다. 한국의 C.
이 중 동일한 서열을 가진 같은 계보의 검체는 한 검체만 남기고 제외하여 총 17균주의 서열을 사용하였다. C. indologenes의 16S 부위의 profiles는 모두 약 1,176 nucleotides (bp)의 크기를 가지고 있었다. GenBank 등과 비교한 결과 같은 종 내 차이는 삽입과 결실보다는 염기 치환에 의한 것이었다.
Chyseobacterium indologenes에 대한 동정을 포함한 분자생물학적 분석과 리보솜의 16S rRNA 유전자로 한국에서 추출한 17검체와 GenBank에서 Chyseobacterium속 검색을 통해 이들과 계통관계를 평가하였다. C. indologenes의 배당 서열은 1,176 nucleotides였다. C.
모든 균주 간 유전적 거리를 산출하였다(Table 3). CID11번과 CID22번 균주 간 가장 유전적으로 먼 유연관계를 나타내었다. 그 외 균주 간 유전적 거리 차이는 크지 않거나 거의 없었다.
MP tree 에서 CID16과 CID22는 한 분지군을 형성하였다. CID15, CID17, CID24, CID26도 한 그룹을 형성하였으며 CID16과 sister를 형성하였으나 75%지지도를 나타내었다. ML tree에서는 CID27이 제일 외측에 있는 단계원 모양을 나타내었다.
daecheongense 등 많은 Chyseobacterium속 내 여러 종과 근연관계에 있었다. Chyseobacterium속을 제외하고는 Bergeyella속(Bergeyella zoohelcum)과 Riemerella속(Riemerella anatipestfer, Riemerella columbina)과 가장 근연관계를 나타내었다.
NJ tree 는 ML tree보다 MP tree에 더 유사한 양상을 나타내었다. Chyseobacterium속의 종과 근연관계를 계통도에서 조사할 때 C. indologenes는 한 계통분기군를 형성하였고, C. isbiliense, C. hominis, C. hispanicum, C. molle, C. hungaricum, C. pallidum을 포함한 그룹과 이웃하였다(Fig. 2). 그 외 C.
결론적으로 진균의 분자생물학적 동정에는 리보솜의 ITS 부위 등이 많이 쓰이나 C. indologenes 균주에서는 16S로 동정이 잘 될 수 있음이 입증되었으며 우리나라 C. indologenes 17균주는 GenBank에 보고된 C. indologenes 균주보다 염기 치환이 보다 높았다.
본 연구에서 서열 변화에 따른 다양도는 Chyseobacterium속의 종 17균주에 대한 0.004로 전체 76균주의 다양도(0.117)에 비해 높지 않았다(Table 5). 그런데 삽입과 결실에 의한 결실돌연변이(D=-2.
본 연구에서도 C. indologenes 검체 중 9검체가 동정 키트의 결과와 다르게 동정되었고 생화학적 표현형 특성이 약한 검체도 있었지만 서열 분석 결과 GenBank에 서열 비교 결과 대부분 99%이상 일치하였다. 이들 균주는 16S rRNA의 시발체가 세균에 보편성을 가지고 있어 다른 종으로 오인의 경우가 발생할 수 있고 GenBank에 등록된 기존 서열에도 일부 오류가 있을 수 있어 비록 키트에서는 불명확해도 일차로 현미경으로 형태상 검경한 후 GenBank에서 서열 일치도로 확인한 후 본 분석에 사용한 결과 서열 일치도, 계통도의 같은 분지군에 배체 되는 등 정보의 신뢰가 매우 높았다.
따라서 상동치환(dS)=비상동치환(dN)이라는 귀무가설을 수용하지 않았다. 비상동 치환과 상동치환의 차이(dN-dS)가 전체 155 쌍 중 44 쌍이 음의 값을 나타내어 비상동치환이 상동치환보다 많았다. 한 염기가 다른 염기로 치환될 확률에서 피리미딘 염기 간 C⟶T, T⟶C일 확률이 각각 15.
165)에 비해 높았다. 이는 중립설의 검증 결과 음의 값을 가짐으로 17균주 그룹과 76균주 그룹 모두 도태에 의한 중립가설보다는 결실돌연변이에 의한 것이고 우리나라 17균주가 더 높다는 것은 전체 서열이 약 1902 bp 중 1176 bp로 배열정돈과정에서 결실부분이 많았다는 것을 보여준다. 리보소옴 자체는 mRNA를 단백질로 번역하는데 중요한 기능을 수행하므로 오랜 시간에도 서열이 잘 보존되고 그 구조를 유지하고 있지만 리보소옴 접히는 과정에서 일부는 고리모양과 비결합부위(hypervariable regions)는 돌연변이가 유발된다.
indologenes 검체 중 9검체가 동정 키트의 결과와 다르게 동정되었고 생화학적 표현형 특성이 약한 검체도 있었지만 서열 분석 결과 GenBank에 서열 비교 결과 대부분 99%이상 일치하였다. 이들 균주는 16S rRNA의 시발체가 세균에 보편성을 가지고 있어 다른 종으로 오인의 경우가 발생할 수 있고 GenBank에 등록된 기존 서열에도 일부 오류가 있을 수 있어 비록 키트에서는 불명확해도 일차로 현미경으로 형태상 검경한 후 GenBank에서 서열 일치도로 확인한 후 본 분석에 사용한 결과 서열 일치도, 계통도의 같은 분지군에 배체 되는 등 정보의 신뢰가 매우 높았다. 16S rRNA 유전자 서열은 보통 1.
117로 나타났다. 중립설의 검증 결과는 17균주와 유사하게 도태에 의한 중립가설보다는 삽입과 결실에 의한 결실돌연변이설로 설명되지만 17균주보다 낮았다(D=-0.165).
004로 낮았다(Table 5). 중립설의 검증 결과는 도태에 의한 중립가설보다는 삽입과 결실에 의한 결실돌연변이설로 설명된다(D=-2.259). GenBank에서 얻은 76균주에 대해 다형현상을 나타내는 자리수는 360 자리였으며, 전체 자리수는 947이었고, 이들의 비는 0.
치환된 염기의 분석에서 다른 염기로 치환 확률은 transition/transversion의 값은 전체 76균주는 0.945인 반면 우리나라의 17균주는 1.206로 높았다(Table 4). 특히 A↔T 또는 C↔G일 transition 확률은 낮으나 C↔T일 확률과 A↔G일 확률은 높았다.
비상동 치환과 상동치환의 차이(dN-dS)가 전체 155 쌍 중 44 쌍이 음의 값을 나타내어 비상동치환이 상동치환보다 많았다. 한 염기가 다른 염기로 치환될 확률에서 피리미딘 염기 간 C⟶T, T⟶C일 확률이 각각 15.37과 15.33으로 다른 염기로 치환될 확률보다 높았다(Table 4). 전체 transition/transversion의 값은 1.
후속연구
Chyseobacterium속의 종의 감염을 치료하기 위해 vancomycin이 사용되었으나, 근래에는 minocycline, rifampin, trimethoxazole-sulfamethoxazole, quinolones의 치료제 사용에서 더 좋은 결과를 나타내는 것으로 알려져 있다[1,7]. 이런 약제사용에 대한 저항성 균주의 발생을 야기할 수 있는 서열 치환, 삽입, 결실, 중복 등 돌연변이에 의한 염기 변화를 충분히 예측하기 위한 검체들 내 서열 간 차이가 있는지 변이를 분석하는 것은 향후 항생제 감시 프로그램을 위해 바람직한 연구가 될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
C. indologenes의 특징은 무엇인가?
C. indologenes는 사람에서 병원성은 낮으나 면역력이 저하된 사람에서 패혈증, 균혈증, 신우신염, 뇌수막염, 담도 감염, 인공호흡기 관련 폐렴 등을 유발할 수 있다[6].
Chyseobacterium속의 특징은 무엇인가?
Chyseobacterium속은 Chyseobacterium gleum, Chyseobacterium indologenes, Chyseobacterium meningosepticum 등이 있다. 이들 종은 비발효성 그람 음성 간균이다. 또한 이들은 호기성, oxidase 양성, 비운동성, indole 양성을 특성을 가지고 있다[1]. 이들이 발견되는 곳은 주거 환경, 식물체, 유제품, 토양, 민물과 해수 등 광범위하며 특히 주거 환경 내 욕조, 체내 유치 도관, 소독약, 흡입치료제 등에서도 동정되기도 한다[16]. C.
Chyseobacterium속에는 어떤 종이 있는가?
Chyseobacterium속은 Chyseobacterium gleum, Chyseobacterium indologenes, Chyseobacterium meningosepticum 등이 있다. 이들 종은 비발효성 그람 음성 간균이다.
참고문헌 (23)
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