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문제 정의
- 특히, 유 등7)의 보고서에 의하면, 當歸 약침은 고 prolacin 혈증을 유발한 흰 쥐의 혈청에서 FSH, prolactin의 농도를 변화시킬 수 있음을 보고 하였으며, PGF2α에 의한 배란억제에도 일정한 효과가 있는 것으로 보고 하였다7). 이러한 선행 연구를 바탕으로 본 연구진은 當歸가 직접적으로 PCO의 형성을 저해할 수 있다는 가설을 세우고 본 연구를 수행하였다.
가설 설정
- b) Values are represented as mean±SD (n=8).
제안 방법
- ß-Estradiol 17-valerate (EV, Sigma, USA) 1회 근육 주사법9)을 이용하여 PCO를 유발하였다.
- AGR 추출물은 0.2 g/㎖로 증류수에 희석하여 상기한 비율의 고형사료와 섞어 실험식이를 제작하였다. AGR 추출물의 투여용량은 사람(60 ㎏)의 1일 건재 투여용량을 9 ~ 12 g으로 하였을 때, 흰쥐와 사람의 무게비 (1/300), 시료 추출 수율 (20%), 사람보다 10배 이상 빠른 흰쥐의 대사 속도를 감안하여 흰쥐 1마리당 1일 투여용량을 계산한 결과 60 ~ 80 ㎎/day로 계산되었다.
- 정상군(Normal group, n=8)은 PCO를 유발하지 않고, 5주간 정상식이를 투여하였고, 대조군(Control group, n=8)은 PCO를 유발시킨 후, 5주간 정상 식이를 투여하였다. AGR 투여군(AGR group, n=8)은 PCO를 유발시킨 후, AGR 추출물을 5 g/kg으로 고형사료에 섞어 투여하였다.
- hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색된 조직 표본을 저 배율 (x2.5)로 촬영하여 형성된 폐쇄 난포와 낭포를 정량하였다. 이때 낭포는 개당 2점, 폐쇄 난포는 개당 1점을 부여하고 이를 합산하여 정량하였다.
- 當歸 200 g을 증류수 1,500 ㎖에 넣어 전기약탕기 (대웅, 한국)를 이용하여 3시간 동안 전탕하여 물 추출을 시행하였다. 얻어진 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 감압 농축하고, 동결건조기 (Labconco, Missouri, USA)를 이용하여 동결건조 분말을 조제하였다.
- AGR 추출물의 투여용량은 사람(60 ㎏)의 1일 건재 투여용량을 9 ~ 12 g으로 하였을 때, 흰쥐와 사람의 무게비 (1/300), 시료 추출 수율 (20%), 사람보다 10배 이상 빠른 흰쥐의 대사 속도를 감안하여 흰쥐 1마리당 1일 투여용량을 계산한 결과 60 ~ 80 ㎎/day로 계산되었다. 계산된 AGR 추출물을 흰쥐의 1일 고형사료 섭취량 (15g)에 골고루 섞어서 실험식이를 제작하였으며, 고형사료 1 ㎏당 AGR 추출물 5 g이 포함된 것은 사람의 1일 투여용량 (g/kg)의 10배에 해당한다. 자세한 고형사료의 조성은 Table 1.
- 이렇게 하여 얻어진 EV용액을 20 ㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 Sesame oil을 근육 주사하였다. 근육주사 후 2일간 주사한 근육부위에 특이사항이 발생하는지를 관찰한 다음, 5주간 약물을 투여하였다.
- 체중의 측정은 측정일 오후 2시에 전자저울 (Hansung, 서울, 한국)을 이용하여 실시하였다. 난소의 무게는 실험 마지막 날 생쥐를 희생시킨 후, 좌, 우측의 난소를 적출하여 측정하였으며, 희생 직전 측정한 체중에 대한 비율로 제시하였다.
- 정상군 (Normal group)은 EV를 녹이지 않은 Sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군 (Control group)과 실험군 (AGR group)은 EV를 Sesame oil에 20㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다.
- 측정은 주당 1회였으며, 측정 단위는 24시간으로 하였다. 모든 측정은 cage 단위로 이루어졌으며, 측정된 값을 cage에 사육된 마리수인 4로 나누어 개체당 식이량 및 음수량으로 제시하였다.
- 본 연구에서는 PCO를 유발하는 물질인 EV를 흰쥐에 주사하여 PCO를 유발한 후, 5주간 AGR을 투여하면서 체중변화, 식이량, 음수량에 미치는 영향을 관찰하고, 5주간의 약물 투여가 끝난 후, 흰쥐로부터 적출된 난소의 무게와 낭포(Cyst) 형성 정도를 관찰하였다.
- 미세절단기 (microtome, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 고정된 조직을 4 ㎛ 두께로 잘라 슬라이드 글라스 위에 부착하였다. 부착된 조직으로부터 파라핀을 제거하고 hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색한 후 광학 현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 실험 시작일부터 5주간 식이량 및 음수량을 변화를 관찰하였다. 측정은 주당 1회였으며, 측정 단위는 24시간으로 하였다.
- 실험시작일 (day 1) 측정한 체중을 기준으로 5주간 매주체중 변화를 관찰하였다. 체중의 측정은 측정일 오후 2시에 전자저울 (Hansung, 서울, 한국)을 이용하여 실시하였다.
- 當歸 200 g을 증류수 1,500 ㎖에 넣어 전기약탕기 (대웅, 한국)를 이용하여 3시간 동안 전탕하여 물 추출을 시행하였다. 얻어진 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 감압 농축하고, 동결건조기 (Labconco, Missouri, USA)를 이용하여 동결건조 분말을 조제하였다. 얻어진 추출물은 40.
- . 이러한 이유로 한의학적 치료가 PCOS의 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 가설을 세우고, 부인과 질환에 多用하는 약물인 當歸 (Angelicae Gigantis Radix, AGR)를 이용하여 본 연구를 수행하였다.
- 45 mm Syringe Filter (Whatman, Springfield, UK)로 걸러 줌으로써 멸균을 대신하였다. 이렇게 하여 얻어진 EV용액을 20 ㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 Sesame oil을 근육 주사하였다. 근육주사 후 2일간 주사한 근육부위에 특이사항이 발생하는지를 관찰한 다음, 5주간 약물을 투여하였다.
- 정상군(Normal group, n=8)은 PCO를 유발하지 않고, 5주간 정상식이를 투여하였고, 대조군(Control group, n=8)은 PCO를 유발시킨 후, 5주간 정상 식이를 투여하였다. AGR 투여군(AGR group, n=8)은 PCO를 유발시킨 후, AGR 추출물을 5 g/kg으로 고형사료에 섞어 투여하였다.
- PCO 유발을 위하여 ß-Estradiol 17-valerate (EV, Sigma, USA)를 사용하였고, 시료 조제를 위하여 전기약탕기 (대웅, 한국), 감압농축기 (EYELA, Japan), 동결건조기 (Labconco, Missouri, USA), 강제순환건조기 (제이오텍, 한국)를 사용하였다. 조직병리학적 관찰을 위하여 미세절단기 (microtome, Leica, Wetzlar, Germany)와 광학현미경 (Olympus, Japan) 등을 사용하였다.
- 실험시작일 (day 1) 측정한 체중을 기준으로 5주간 매주체중 변화를 관찰하였다. 체중의 측정은 측정일 오후 2시에 전자저울 (Hansung, 서울, 한국)을 이용하여 실시하였다. 난소의 무게는 실험 마지막 날 생쥐를 희생시킨 후, 좌, 우측의 난소를 적출하여 측정하였으며, 희생 직전 측정한 체중에 대한 비율로 제시하였다.
- 실험 시작일부터 5주간 식이량 및 음수량을 변화를 관찰하였다. 측정은 주당 1회였으며, 측정 단위는 24시간으로 하였다. 모든 측정은 cage 단위로 이루어졌으며, 측정된 값을 cage에 사육된 마리수인 4로 나누어 개체당 식이량 및 음수량으로 제시하였다.
대상 데이터
- 180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험실 환경은 온도 22±2℃를 유지하면서 12시간 단위로 낮과 밤이 계속되는 상황을 실험 종료 시까지 유지하였다.
- PCO 유발을 위하여 ß-Estradiol 17-valerate (EV, Sigma, USA)를 사용하였고, 시료 조제를 위하여 전기약탕기 (대웅, 한국), 감압농축기 (EYELA, Japan), 동결건조기 (Labconco, Missouri, USA), 강제순환건조기 (제이오텍, 한국)를 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 약재는 참당귀 (Angelica gigas Nakai) 의 뿌리를 건조한 것으로 화림제약(부산, 한국)을 통하여 구입, 정선하여 사용하였다.
- 실험동물은 160～180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
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3) 실험군의 선정
정상군 (Normal group)은 EV를 녹이지 않은 Sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군 (Control group)과 실험군 (AGR group)은 EV를 Sesame oil에 20㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다.
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot (Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.)을 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.
이론/모형
- Effects of AGR on histo-pathological changes of Ovary in PCO Rats. Histo-pathological changes of Ovary were observed using haematoxylin and eosin stain methods. (A) Normal, (B) Control, (C) AGR.
성능/효과
- 5주 간의 약물 투여 기간 동안 식이량 및 음수량 변화를 관찰한 결과 모든 군에서 식이량의 차이는 발견되지 않았으나, 음수량은 대조군에서 정상군에 비하여 유의하게 감소함이 관찰되었다. 약물군은 대조군과 유사한 수준의 음수량을 보였다 (Table.
- 2 g/㎖로 증류수에 희석하여 상기한 비율의 고형사료와 섞어 실험식이를 제작하였다. AGR 추출물의 투여용량은 사람(60 ㎏)의 1일 건재 투여용량을 9 ~ 12 g으로 하였을 때, 흰쥐와 사람의 무게비 (1/300), 시료 추출 수율 (20%), 사람보다 10배 이상 빠른 흰쥐의 대사 속도를 감안하여 흰쥐 1마리당 1일 투여용량을 계산한 결과 60 ~ 80 ㎎/day로 계산되었다. 계산된 AGR 추출물을 흰쥐의 1일 고형사료 섭취량 (15g)에 골고루 섞어서 실험식이를 제작하였으며, 고형사료 1 ㎏당 AGR 추출물 5 g이 포함된 것은 사람의 1일 투여용량 (g/kg)의 10배에 해당한다.
- 3B). AGR은 이러한 변화를 효율적으로 억제하여 정상군에서 보이던 초기 난포가 보이고, 낭성 난포나 폐쇄 난포는 감소하는 경향을 보였다 (Fig. 3C). 또한, PCO 형성 정도를 수치화 하여 통계 분석한 결과를 살펴보면, AGR군에서 대조군에 비하여 유의한 수준으로 낭성 난포와 폐쇄난포의 생성이 감소한 것으로 나타났다 (Fig.
- EV 투여 첫 날 체중을 기준으로 하여 5주간의 체중 변화를 측정한 결과 정상군 (Normal)은 유의한 증가세를 보인 반면, 대조군 (Control)은 기준 체중과 유사한 수준의 체중을 유지하였다. AGR군은 대조군과 특별한 차이를 보이지 않았다 (Fig.
- Estradiol valerate에 의해 유발된 다낭성 난소 질환에 當歸 추출물 (AGR)을 경구투여하면서 체중변화와 식이량, 음수량을 관찰하고, 실험 마지막 날 난소의 무게와 조직병리학적 소견을 관찰한 결과, 체중, 식이량, 음수량에는 특별한 영향을 미치지 않았고, 유의한 수준의 난소 / 체중비 감소 억제 효과와 낭성 난포 유발 억제효과를 보였다. 이상의 결과에서 예전부터 不姙, 生理痛 등의 婦人科 질환에 다용되어 왔던 當歸가 다낭성난소증후군 환자에게 유용할 것임을 알 수 있다.
- 2). 난소의 무게를 체중에 대한 비율로 나타낸 결과 대조군의 난소 / 체중비는 정상군의 62% 정도로 나타났다. AGR의 투여는 감소된 난소 / 체중비를 정상 수준의 88% 수준으로 회복시켰다 (Fig.
- 3C). 또한, PCO 형성 정도를 수치화 하여 통계 분석한 결과를 살펴보면, AGR군에서 대조군에 비하여 유의한 수준으로 낭성 난포와 폐쇄난포의 생성이 감소한 것으로 나타났다 (Fig. 4) 이상의 결과는 AGR이 직접적으로 낭성 난포의 형성을 억제할 가능성이 있는 것으로 해석된다.
- . 본 연구 결과에서 EV의 투여는 PCO의 유발뿐만 아니라 난소의 크기와 무게를 유의한 수준으로 감소시켰다 (Fig. 2). 난소의 무게를 체중에 대한 비율로 나타낸 결과 대조군의 난소 / 체중비는 정상군의 62% 정도로 나타났다.
- 본 연구의 결과를 살펴보면 5주간의 EV 투여는 정상군에 비하여 유의한 수준으로 체중 증가 억제 경향을 보였으며, AGR 역시 이러한 체중에 특별한 영향을 미치지 않았음을 알 수 있다 (Fig. 1). 체중 증가율의 감소 원인으로는 외적으로 식이량의 감소와 내적으로 체내 대사의 증가로 인한 소모율의 증가로 구분 할 수 있는데, 어떤 요인에 기인하는지 살펴보기 위하여 식이량 및 음수량을 관찰한 결과 대조군에서 정상군에 비하여 감소된 식이량을 보였지만, 통계적으로 유의한 정도는 아니었으며, 음수량에서는 유의한 수준의 감소를 보였다 (Table 2).
- 실험 마지막날, 흰쥐를 희생시키고 난소를 적출하여 좌, 우 난소의 무게를 측정한 후, 난소 / 체중비를 계산한 결과 대조군에서 정상군에 비하여 유의한 난소 / 체중비의 감소가 관찰되었고, AGR 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의한 난소/ 체중비의 증가가 관찰되었다 (Fig. 2).
- Estradiol valerate에 의해 유발된 다낭성 난소 질환에 當歸 추출물 (AGR)을 경구투여하면서 체중변화와 식이량, 음수량을 관찰하고, 실험 마지막 날 난소의 무게와 조직병리학적 소견을 관찰한 결과, 체중, 식이량, 음수량에는 특별한 영향을 미치지 않았고, 유의한 수준의 난소 / 체중비 감소 억제 효과와 낭성 난포 유발 억제효과를 보였다. 이상의 결과에서 예전부터 不姙, 生理痛 등의 婦人科 질환에 다용되어 왔던 當歸가 다낭성난소증후군 환자에게 유용할 것임을 알 수 있다.
- 정상군의 난소 조직에서는 낭포는 관찰되지 않았고, 일부에서 폐쇄 난포만 관찰되었으며, 대조군에서는 상당수의 낭포와 폐쇄 난포가 관찰되어 Symptom Score가 9.5±1.6으로 나타났으며, AGR 군의 경우 6.0±1.4로 낭포와 폐쇄 난포가 유의한 수준으로 감소하였다.
- 1). 체중 증가율의 감소 원인으로는 외적으로 식이량의 감소와 내적으로 체내 대사의 증가로 인한 소모율의 증가로 구분 할 수 있는데, 어떤 요인에 기인하는지 살펴보기 위하여 식이량 및 음수량을 관찰한 결과 대조군에서 정상군에 비하여 감소된 식이량을 보였지만, 통계적으로 유의한 정도는 아니었으며, 음수량에서는 유의한 수준의 감소를 보였다 (Table 2). 이는 EV가 식욕부진을 일으켜 체중 증가를 억제시키기 때문16)에 발생한다는 선행 연구 결과를 감안하여 해석하면, 음수량의 감소와 경미하게 감소한 식이량, 그리고 체내 대사율의 증가 등 복합적인 요인이 작용한 것으로 해석된다.
후속연구
- 선행 연구 결과에서 當歸 는 혈중 FSH 농도를 증가시킬 수 있음이 보고되었으며7), 본 연구의 결과에서는 직접적으로 AGR이 낭성 난소의 생성을 억제함이 관찰되었다. 추후, 상기한 여러 가지 인자들에 미치는 영향을 연구하여 AGR의 PCO 유발 억제 기전을 규명하여야 할 것으로 생각된다.
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