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문제 정의
- 본 연구에서는 AGR이 PCOS가 유발된 흰쥐에서 적출된 난소 조직의 유전자 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 관찰하기 위하여 적출된 난소에서 total RNA를 추출한 다음 cRNA를 제작하고, 이를 DNA microarray analysis를 통하여 분석하였다.
- 당귀에 의한 생리학적 변화는 어느정도 알려져 있지만 유전자 차원에서 규명된 바는 없다. 본 연구에서는 PCOS의 유발에 AGR의 투여가 어떤 영향을 주는지 유전자 칩을 이용하여 측정하였다. 우선 PCOS의 유발이 어떤 유전적인 변화를 야기하는지 측정한 결과 세포신호 전달, 산화환원, 독소반응, 지질 대사반응 등의 다양한 생물학적 기능을 변화시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 이에 본 저자는 PCOS의 치료에 當歸(Angelicae Gigantis Radix, AGR)를 활용할 수 있는지와 어떤 기전으로 작용하는지에 대한 단서를 확인하기 위하여 흰 쥐에 PCOS을 유발한 다음, 當歸를 투여하고 난소 조직을 적출하여 microarray기법으로 유전자 발현 양상을 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이처럼 當歸가 婦人科질환에 다양하게 이용 되고 있음에도 불구하고 그에 대한 정확한 기전이나 효능에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 이에 저자는 부인과관련 질환에 다양하게 이용되는 當歸가 가임기 여성에 있어 다발하는 PCOS에 어떤 영향을 미치는지 유전자 분석을 통해 연구해 보고자 하였다.
제안 방법
- ß-Estradiol 17-valerate(EV, Sigma, USA)의 1회 근육 주사법15)을 이용하여 PCOS를 유발하였다.
- 정상군(Normal group, n=8)은 다낭성 난소를 유발하지 않고, 5주간 정상식이를 투여하였고, 다낭성 난소 대조군 (Control group, n=8)은 다낭성 난소를 유발시킨 후 5주간 정상 식이를 투여하였다. AGR 투여군(AGR group, n=8)은 다낭성 난소를 유발시킨 후 AGR 추출물을 5 g/kg으로 고형사료에 섞어 투여하였다.
- Total RNA를 아가로스겔 상에서 전기영동한 후 28S/18S RNA의 비율을 측정하여 정도 관리하여 분석 적합 판정을 확인한 후 실험을 진행하였다. Microarray 실험에 있어서 결과에 영향을 주는 여러가지 factor들 중 가장 중요한 것이 RNA이며17), 이 RNA 상태를 확인하기 위해 Agilent사의 Bioanalyzer 2100을 사용하여 rRNA ratio(28S/18S ribosomal RNA)를 확인함으로써 판정하였다.
- Rat Genome Microarray Kit(Agilent Technology, U.S.A)을 이용하여 실험을 수행하였다. 정도 관리를 통과한 total RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, cDNA 로부터 dsDNA를 합성하였다.
- Total RNA를 아가로스겔 상에서 전기영동한 후 28S/18S RNA의 비율을 측정하여 정도 관리하여 분석 적합 판정을 확인한 후 실험을 진행하였다. Microarray 실험에 있어서 결과에 영향을 주는 여러가지 factor들 중 가장 중요한 것이 RNA이며17), 이 RNA 상태를 확인하기 위해 Agilent사의 Bioanalyzer 2100을 사용하여 rRNA ratio(28S/18S ribosomal RNA)를 확인함으로써 판정하였다.
- 정도 관리를 통과한 total RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, cDNA 로부터 dsDNA를 합성하였다. dsDNA로부터 형광이 표지된 cRNA를 합성하고, 이를 Agilent Hybridization oven(Agilent Technology, USA)에서 DNA 칩에 반응시켰다. 형광 표지된 cRNA 제작시 20㎍의 total RNA를 사용하였다.
- 이렇게 하여 얻어진 EV용액을 20 ㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 sesame oil을 근육 주사하였다. 근육주사 후 2일간 관찰한다음, 5주간 약물을 투여하였다.
- 당귀 추출물이 다낭성난소증후군이 유발된 흰쥐의 난소 조직에서 유전자 발현 양상에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, ß-Estradiol 17-valerate로 다낭성난소증후군을 유발한 다음, 당귀 추출물을 투여하고 난소 조직을 적출하여 total RNA를 추출한 후 DNA 칩을 이용하여 유전자 발현 양상을 관찰한 결과는 다음과 같다.
- 정상군(Normal group)은 EV를 녹이지 않은 sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군(Control group)과 실험군(AGR group)은 EV를 sesame oil에 20 ㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다.
- 그 결과 유전자 발현 패턴은 크게 6가지로 분류될 수 있으나, 본 연구와 관련하여 의미 있는 변화는 PCOS 유발로 인하여 발현이 감소하거나, 증가한 유전자와 이렇게 변화한 유전자들 중에서 AGR 투여를 통하여 발현 정도가 정상 수준으로 돌아간 유전자(A, B)들이다. 따라서, 이러한 유전자들을 위주로 분석을 시행하였다.
- 4배 더 큰 경우에 한해 제대로 측정된 것으로 판단하여 선별하였고, 시료에서 제대로 측정되지 않은 것은 제외시켰다. 발현 비율은 Cluster를 이용하여 순차적 클러스터링한 후 TREEVIEW(M.B. Eisen, http://rabam. lbl.gov)19)를 이용하여 시각화하였다.
- 본 연구에서는 단백질 상호작용 네트워크 분석을 수행하여 가장 핵심이 되는 IRS2, MCM10, ORC2L, CTBP2, CD44, RHOA 등의 대표 유전자를 발굴하였다(Fig. 6, 9). 그림 6에는 PCOS 유발에 의해 발현이 증가 되었으나 당귀섭취로 인해 발현이 정상수준으로 회복된 유전자들로부터 번역된 단백질들의 상호작용 네트워크가 표시되어 있다.
- 의 방법을 변형하여 시행되었다. 상기한 방법으로 약물을 투여하고 난소 조직을 적출하였다. 적출된 조직은 막자사발로 파쇄한 후, Trizol reagent(invitrogen, Cat# 15596-026)을 이용하여 total RNA를 분리하였으며, 실험 과정은 Qiagen에서 제시한 방법에 따라 이루어졌다.
- 세척되고 세절된 상태로 구입된 當歸 200 g을 증류수 1,500 ㎖에 넣어 전기약 탕기(대웅, 한국)를 이용하여 3시간 동안 전탕하여 물 추출을 시행하였다. 얻어진 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 감압 농축하고, 동결건조기(Labconco, Missouri, USA)를 이용하여 동결건조 분말을 조제 하였다.
- 세척되고 세절된 상태로 구입된 當歸 200 g을 증류수 1,500 ㎖에 넣어 전기약 탕기(대웅, 한국)를 이용하여 3시간 동안 전탕하여 물 추출을 시행하였다. 얻어진 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 감압 농축하고, 동결건조기(Labconco, Missouri, USA)를 이용하여 동결건조 분말을 조제 하였다. 얻어진 추출물은 40.
- 45 ㎛ syringe filter(Whatman, Springfield, UK)로 걸러 줌으로써 멸균을 대신하였다. 이렇게 하여 얻어진 EV용액을 20 ㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 sesame oil을 근육 주사하였다. 근육주사 후 2일간 관찰한다음, 5주간 약물을 투여하였다.
- 이미지파일에서 IMAGENE 4.0(Biodiscovery, Marina del Rey, CA)를 사용하여 1차 데이터를 얻은 후 locally weighted scatterplot smoothing(LOWESS)method 를 사용하여 표준화하였다18). 모든 칩상의 spot에서, 각 채널의 형광 강도가 배경의 형광 강도보다 1.
- A)을 이용하여 실험을 수행하였다. 정도 관리를 통과한 total RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, cDNA 로부터 dsDNA를 합성하였다. dsDNA로부터 형광이 표지된 cRNA를 합성하고, 이를 Agilent Hybridization oven(Agilent Technology, USA)에서 DNA 칩에 반응시켰다.
- 정상군(Normal group, n=8)은 다낭성 난소를 유발하지 않고, 5주간 정상식이를 투여하였고, 다낭성 난소 대조군 (Control group, n=8)은 다낭성 난소를 유발시킨 후 5주간 정상 식이를 투여하였다. AGR 투여군(AGR group, n=8)은 다낭성 난소를 유발시킨 후 AGR 추출물을 5 g/kg으로 고형사료에 섞어 투여하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 160～180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형사료 (삼양 배합사료 실험동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험실 환경은 온도 22±2℃를 유지하면서 12시간 단위로 낮과 밤이 계속되는 상황을 실험 종료 시까지 유지하였다.
- PCOS 유발을 위하여 ß-Estradiol 17- valerate(EV, Sigma, USA)를 사용하였고, 시료 조제를 위하여 전기약탕기(대웅, 한국), 감압농축기(EYELA, Japan), 동결건조기(Labconco, Missouri, USA), 강제순환건조기(제이오텍, 한국)를 사용하였다.
- 본 실험에서 當歸(Angelicae Gigantis Radix, AGR)는 繖形科(Umbelliferae)에 속한 多年生 本草인 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리를 건조한 것으로, 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다.
- 실험동물은 160～180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형사료 (삼양 배합사료 실험동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
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3) 실험군의 선정
정상군(Normal group)은 EV를 녹이지 않은 sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군(Control group)과 실험군(AGR group)은 EV를 sesame oil에 20 ㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다.
- dsDNA로부터 형광이 표지된 cRNA를 합성하고, 이를 Agilent Hybridization oven(Agilent Technology, USA)에서 DNA 칩에 반응시켰다. 형광 표지된 cRNA 제작시 20㎍의 total RNA를 사용하였다. 어레이를 씻어낸 후 ScanArray scanner(Perkin -Elmer, Boston, MA)로 스캔하였으며, 정상 RNA를 레퍼런스로 사용하여 DNA 칩상의 대다수 cDNA spots(85% 이상) 이 검출됨을 확인하였다.
데이터처리
- DNA 칩을 이용한 실험에서 발현 증가 및 감소된 유전자의 유의성 검증은 Chi-square test를 이용하여 p-value<0.05일 때 유의하다고 판정하였다.
- . 단백질 상호 작용 네트워크 분석은 BOND 데이터베이스(http://bond.unleashedinformatics .com)에서 얻어진 백서단백질 데이터베이스를 이용하였으며, 시각화를 위해서 cytoscape program(버전 2.4)을 이용하여 분석하였다22). 전사인자(transcription factor) 분석은 TFM-Explorer(Transcription Factor Matrix Explorer)를 사용하였다23).
이론/모형
- 유전자 기능분석은 OntoExpress20)을 이용하였으며, pathway 분석은 SPIA algorithms를 이용하여 수행하였다21). 단백질 상호 작용 네트워크 분석은 BOND 데이터베이스(http://bond.
- 상기한 방법으로 약물을 투여하고 난소 조직을 적출하였다. 적출된 조직은 막자사발로 파쇄한 후, Trizol reagent(invitrogen, Cat# 15596-026)을 이용하여 total RNA를 분리하였으며, 실험 과정은 Qiagen에서 제시한 방법에 따라 이루어졌다.
- 4)을 이용하여 분석하였다22). 전사인자(transcription factor) 분석은 TFM-Explorer(Transcription Factor Matrix Explorer)를 사용하였다23). 전사인자의 결합부위 서열은 transfac database를 이용하였다.
- 전사인자(transcription factor) 분석은 TFM-Explorer(Transcription Factor Matrix Explorer)를 사용하였다23). 전사인자의 결합부위 서열은 transfac database를 이용하였다.
성능/효과
- 1. 난소 조직으로부터 얻어낸 total RNA의 정도관리를 시행한 결과 전기영동 결과상에서 동일한 위치에 밴드가 관찰되어 유전자 분석을 위해 필요한 조건을 충족하였다.
- 2. PCOS유발에 의해 1,421종의 유전자의 발현이 증가 하였으며 이중 884종의 유전자가 AGR 추출물 투여에 의하여 정상 수준으로 발현이 감소하였고, PCOS유발에 의해 발현이 감소한 1,391종의 유전자 중에서 588종의 유전자가 AGR 추출물 투여에 의하여 정상 수준으로 발현이 증가 하였다.
- 3. PCOS 유발에 의해 발현이 증가된 유전자들은 세포신호전달 관련 기능(Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smess, G-protein coupled reception signaling pathway) 및 염증 반응(Inflammatory response)에 관련되어 있다는 것을 확인할 수 있다.
- 4. PCOS 유발에 의해 발현이 감소된 유전자들이 산화환원에 관련된 기능(Oxidation reduction), 세포신호전달에 관련된 기능(Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smess, G-protein coupled reception signaling pathway), 외부독소반응(Response to toxin), 대사 과정기능(Cholesterol biosynthetic process) 등이 유의적으로 측정되었다.
- 5. PCOS 유발에 의해 발현이 증가하였으나 AGR 투여에 의해 발현이 정상으로 회복된 유전자들에 대하여 ontology 분석 결과 Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smess, G-protein coupled reception signaling pathway 등이 다낭성 난소 증후군 유발군에서와 동일하게 측정되었으며, 유전자들의 상호작용 네트워크 분석을 통하여 IRS2, MCM10, ORC2L등이 선정 되었다. 유전자들의 전사인자 분석을 통하여 총 SP1, Klf4, GATA2 등 9종의 공통전사 인자가 관여함을 알 수 있었다.
- 6. PCOS 유발에 의해 발현이 감소하였으나 AGR 투여에 의해 발현이 정상으로 회복된 유전자들의 ontology 분석 결과 PCOS 유발에 의해 감소한 유전자들이 관여된 기능이 일부 회복되기도 하였지만 Oxidation reduction, hypoxia와 연관된 기능, JAK-STAT 신호전달 기능 등 새로운 기능들이 유의적으로 측정되었으며, 유전자들의 상호작용 네트워크 분석을 통하여 CTBP2, CD44, RHOA 등이 선정 되었다. 유전자들의 전사인자 분석을 통하여 총 MEIS1B/HOXA9, Tal-1beta /ITF-2, NFYA등 25종의 공통전사 인자가 관여함을 알 수 있었다.
- 7. AGR 투여에 의하여 정상 기능으로 회복되는 유전자들과 관련 있는 pathway로는 Olfactory transduction pathway, Focal adhesion pathway, ECM-receptor interaction pathway 등이 확인 되었다.
- PCOS 유발에 의해 발현이 증가한 유전자 1,421종 중에서 884종의 유전자가 AGR 투여로 인해 발현이 정상수준으로 회복하였다. 884종의 유전자를 분석한 결과, 세포 신호전달 관련 기능(Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smell, G-protein coupled reception signaling pathway) 및 감각 신호 전달 (Olfactory receptor activities)에 관련되어 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- AGR 투여에 의하여 발현이 감소되었으나 AGR 투여에 의하여 발현이 정상으로 회복된 유전자들을 대상으로 전사인자 결합 분석을 수행한 결과, 25개의 전사인자가 공통으로 관찰되었으며, 대표적으로 MEIS1B/HOXA9, Tal-1beta/ ITF-2, NFYA 등을 들 수 있었다(Fig. 10).
- AGR 투여에 의해 변화되는 유전자들의 조절 기전을 파악하기 위하여 유전자의 조절부위(promoter region)에 결합하는 전사인자를 분석한 결과, 이들 유전자들에 공통적으로 존재하는 9개의 전사인자 결합부위가 표시되어 있으며, 대표적으로 SP1, Klf4, GATA2 등의 전사인자가 관여하고 있었다(Fig. 7).
- PCOS 유발에 대한 AGR의 효과를 pathway 차원에서 다시 한 번 확인한 결과 다양한 pathway가 AGR 투여에 의해 유의적으로 변화한다는 것을 확인 할 수 있었다. AGR 투여와 관련 있는 pathway로는 Olfactory transduction pathway, Focal adhesion pathway, ECM-receptor interaction pathway 등이 확인되었다(Fig. 11).
- PCOS 유발에 대한 AGR의 효과를 pathway 차원에서 다시 한 번 확인한 결과 다양한 pathway가 AGR 투여에 의해 유의적으로 변화한다는 것을 확인 할 수 있었다. AGR 투여와 관련 있는 pathway로는 Olfactory transduction pathway, Focal adhesion pathway, ECM-receptor interaction pathway 등이 확인되었다(Fig.
- PCOS 유발에 의해 발현이 감소되었으나 AGR 투여로 인해 발현이 정상수준으로 회복된 유전자들로부터 번역된 단백질들의 상호작용 네트워크를 살펴본 결과 CTBP2, CD44, RHOA등의 유전자가 주요 유전자임을 알 수 있었다(노란색)(Fig. 9).
- PCOS 유발에 의해 발현이 감소한 유전자 1,391종 중에서 588종의 유전자가 AGR 투여로 인해 발현이 정상수준으로 회복하였다. 이 유전자들을 분석한 결과, 산화환원에 관련된 기능(Oxidation reduction), hypoxia 와 연관된 기능(response to hypoxia), JAK-STAT 신호전달 관련 기능(negative regulation of JAK-STAT cascade) 등이 측정되었다(Fig.
- PCOS 유발에 의해 발현이 감소한 유전자 1,391종을 OntoExpress 프로그램을 이용하여 분석한 결과, PCOS 유발에 의해 발현이 감소된 유전자들이 산화환원에 관련된 기능(Oxidation reduction), 세포신호전달에 관련된 기능(Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smess, G-protein coupled reception signaling pathway), 외부독소 반응(Response to toxin), 대사과정기능 (Cholesterol biosynthetic process)등이 측정되었다(Fig. 4).
- PCOS 유발에 의해 발현이 증가한 유전자 1,421종 중에서 884종의 유전자가 AGR 투여로 인해 발현이 정상수준으로 회복하였다. 884종의 유전자를 분석한 결과, 세포 신호전달 관련 기능(Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smell, G-protein coupled reception signaling pathway) 및 감각 신호 전달 (Olfactory receptor activities)에 관련되어 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- PCOS 유발에 의해 발현이 증가한 유전자 1,421종을 OntoExpress 프로그램을 이용하여 분석한 결과, PCOS 유발에 의해발현이 증가된 유전자들이 세포신호전달 관련 기능(Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smell, G-protein coupled reception signaling pathway) 및 염증 반응(Inflammatory response)에 관련되어 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- PCOS유발에 의해 1,421종의 유전자의 발현이 증가(적색) 하였으며, 1,391종의 유전자의 발현이 감소(녹색) 하였다. 또한 AGR 투여에 의해 이런 유전자 발현 패턴이 크게 변화 하였다.
- 그 결과 PCOS 유발에 의하여 총 1,421개의 유전자가 발현 증가하였고, 1,391 개의 유전자가 발현 감소하였으며, 발현이 증가한 유전자들 중 884개의 유전자는, AGR의 처리에 의하여 발현이 정상 수준으로 되돌아갔으며, 발현 감소한 1,391 개의 유전자 중에서 588개의 유전자가 정상 수준으로 회복되었음을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 이상의 결과를 통하여 본 저자는 當歸가 PCOS에서 난소의 이상 증식 또는 암발생 등을 억제해 줄 수 있을 것으로 생각된다. 그 기전으로는 세포 신호 전달 과정이나 염증 반응에 관여하는 기전이 관여할 것으로 생각되며, IRS2, MCM10, ORC2L, CTBP2, CD44, RHOA등의 유전자 그리고, 공통적으로 관여하는 총 24종의 전사인자들 또한 유기적으로 관여할 것으로 생각된다. 이러한 표적 물질들은 당귀의 효과를 분자적 수준에서 규명하는데 필수적인 요소가 될 것이며, 추후 신약 개발 등의 연구에도 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
- 단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해 당귀섭취에 의해 영향을 받는 주요 유전자들을 선별한 결과 IRS2, MCM10, ORC2L 등의 유전자가 선정되었다(노란색)(Fig. 6).
- 유전자의 발현은 유전자의 프로모터(promoter) 부위에 어떤 종류의 전사인자가 결합하는지에 따라 결정된다. 따라서 PCOS 유발 및 AGR 투여에 의한 유전자 조절을 전사인자 수준에서 분석한 결과 PCOS 유발에 의해 발현이 증가하였으나 AGR 투여에 의해 발현이 정상으로 회복된 유전자들의 경우 9개의 공통 전사인자가(Fig. 7), PCOS 유발에 의해 발현이 감소하였으나 AGR 투여에 의해 발현이 정상으로 회복된 유전자들의 경우 25개의 전사인자가 공통으로 작용하는 것으로 나타났다(Fig. 10).
- 이상의 결과를 종합하여 보면, PCOS가 유발된 백서에서 AGR의 투여는 PCOS에 의하여 기능이 증가된 일련의 유전자들과 그 결과 나타나는 현상에 대하여 발현 정도가 증가된 유전자들을 정상 수준으로 되돌림으로써 결과적으로 PCOS에 의하여 나타나는 증상의 일부를 호전 시킬 수 있는 것으로 보이며, 단백질 네트워크 분석을 통하여 AGR의 주요 치료기전에 관여할 수 있는 몇 가지 유전자들과 전사인자들을 선정할 수 있었다. 또한, PCOS유발에 의하여 염증 반응에 관여하는 유전자가 발현이 증가하였고, 이러한 변화는 AGR의 투여를 통하여 정상 수준으로 회복되었다.
- 본 연구의 결과에서 PCOS유발에 의하여 염증 반응에 관여하는 유전자가 발현이 증가하였고, 이러한 변화는 AGR의 투여를 통하여 정상 수준으로 회복되었다. 또한, 단백질 네트워크 분석 결과 염증 반응에 관여하는 IL-4의 수용체와 관련있는 IRS2등과 같은 유전자가 선별되었다. 이러한 내용에서 PCOS 유발과정에는 염증 반응이 관여할 수 있으며, 이러한 염증 반응을 억제해 주는 것이 AGR의 주요한 치료 기전 중의 하나임을 유추할 수 있다.
- 이는 PCOS의 유발에 의해 손상된 세포기능이 AGR 투여에 의해 정상으로 회복되었다는 것을 보여준다. 반면 PCOS의 유발에 의해 발현이 감소하였으나 AGR 투여에 의해 정상수준으로 회복된 유전자들이 연관된 생물학적 기능은 질병 유발에 의해 손상된 기능과 상이하다는 것을 알 수 있었다(Fig. 4, 8). 즉 PCOS의 유발에 의해 발현이 감소한 유전자들이 연관된 생물학적 기능은 AGR 투여에 의해 회복되지 않았다는 것을 보여준다.
- 따라서, 세포로부터 추출된 total RNA의 순도와 함량은 실험 결과에 직접적인 영향을 미칠 수 있다41,42). 본 연구의 결과에서 AGR 처리 후 세포로부터 얻어낸 total RNA를 전기영동으로 migration 시킨 결과 3군 모두 동일한 영역에서 피크가 관찰되어 각각의 total RNA가 분석에 적합한 상태임을 알 수 있었다(Fig. 1).
- 본 연구의 결과에서 PCOS유발에 의하여 염증 반응에 관여하는 유전자가 발현이 증가하였고, 이러한 변화는 AGR의 투여를 통하여 정상 수준으로 회복되었다. 또한, 단백질 네트워크 분석 결과 염증 반응에 관여하는 IL-4의 수용체와 관련있는 IRS2등과 같은 유전자가 선별되었다.
- 형광 표지된 cRNA 제작시 20㎍의 total RNA를 사용하였다. 어레이를 씻어낸 후 ScanArray scanner(Perkin -Elmer, Boston, MA)로 스캔하였으며, 정상 RNA를 레퍼런스로 사용하여 DNA 칩상의 대다수 cDNA spots(85% 이상) 이 검출됨을 확인하였다.
- 본 연구에서는 PCOS의 유발에 AGR의 투여가 어떤 영향을 주는지 유전자 칩을 이용하여 측정하였다. 우선 PCOS의 유발이 어떤 유전적인 변화를 야기하는지 측정한 결과 세포신호 전달, 산화환원, 독소반응, 지질 대사반응 등의 다양한 생물학적 기능을 변화시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 3, 4). 한편 AGR의 투여가 PCOS의 유발에 미치는 영향을 유전자 차원에서 측정한 결과 다양한 유전자의 발현이 AGR 투여에 의해 변화된다는 것을 알 수 있었다(Fig.
- PCOS 유발에 의해 발현이 감소하였으나 AGR 투여에 의해 발현이 정상으로 회복된 유전자들의 ontology 분석 결과 PCOS 유발에 의해 감소한 유전자들이 관여된 기능이 일부 회복되기도 하였지만 Oxidation reduction, hypoxia와 연관된 기능, JAK-STAT 신호전달 기능 등 새로운 기능들이 유의적으로 측정되었으며, 유전자들의 상호작용 네트워크 분석을 통하여 CTBP2, CD44, RHOA 등이 선정 되었다. 유전자들의 전사인자 분석을 통하여 총 MEIS1B/HOXA9, Tal-1beta /ITF-2, NFYA등 25종의 공통전사 인자가 관여함을 알 수 있었다.
- PCOS 유발에 의해 발현이 증가하였으나 AGR 투여에 의해 발현이 정상으로 회복된 유전자들에 대하여 ontology 분석 결과 Detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smess, G-protein coupled reception signaling pathway 등이 다낭성 난소 증후군 유발군에서와 동일하게 측정되었으며, 유전자들의 상호작용 네트워크 분석을 통하여 IRS2, MCM10, ORC2L등이 선정 되었다. 유전자들의 전사인자 분석을 통하여 총 SP1, Klf4, GATA2 등 9종의 공통전사 인자가 관여함을 알 수 있었다.
- PCOS 유발에 의해 발현이 감소한 유전자 1,391종 중에서 588종의 유전자가 AGR 투여로 인해 발현이 정상수준으로 회복하였다. 이 유전자들을 분석한 결과, 산화환원에 관련된 기능(Oxidation reduction), hypoxia 와 연관된 기능(response to hypoxia), JAK-STAT 신호전달 관련 기능(negative regulation of JAK-STAT cascade) 등이 측정되었다(Fig. 8).
- 이상의 결과를 종합하여 보면, PCOS가 유발된 백서에서 AGR의 투여는 PCOS에 의하여 기능이 증가된 일련의 유전자들과 그 결과 나타나는 현상에 대하여 발현 정도가 증가된 유전자들을 정상 수준으로 되돌림으로써 결과적으로 PCOS에 의하여 나타나는 증상의 일부를 호전 시킬 수 있는 것으로 보이며, 단백질 네트워크 분석을 통하여 AGR의 주요 치료기전에 관여할 수 있는 몇 가지 유전자들과 전사인자들을 선정할 수 있었다. 또한, PCOS유발에 의하여 염증 반응에 관여하는 유전자가 발현이 증가하였고, 이러한 변화는 AGR의 투여를 통하여 정상 수준으로 회복되었다.
- 이상의 결과를 통하여 본 저자는 當歸가 PCOS에서 난소의 이상 증식 또는 암발생 등을 억제해 줄 수 있을 것으로 생각된다. 그 기전으로는 세포 신호 전달 과정이나 염증 반응에 관여하는 기전이 관여할 것으로 생각되며, IRS2, MCM10, ORC2L, CTBP2, CD44, RHOA등의 유전자 그리고, 공통적으로 관여하는 총 24종의 전사인자들 또한 유기적으로 관여할 것으로 생각된다.
- 즉 PCOS의 유발에 의해 발현이 감소한 유전자들이 연관된 생물학적 기능은 AGR 투여에 의해 회복되지 않았다는 것을 보여준다. 종합적으로 판단하면 PCOS의 유발에 의해 발현이 증가된 유전자와 연관된 세포기능은 AGR 투여에 의해 회복되었으나, 발현이 감소한 유전자와 연관된 세포기능은 AGR 투여에 의해 회복되지 않았다(Fig. 5, 8). 이런 결과는 AGR 투여에 의해 발현이 정상으로 회복된 유전자들을 대상으로 생물학적 pathway 분석을 한 결과에서도 확인할 수 있다(Fig.
- 4, 8). 즉 PCOS의 유발에 의해 발현이 감소한 유전자들이 연관된 생물학적 기능은 AGR 투여에 의해 회복되지 않았다는 것을 보여준다. 종합적으로 판단하면 PCOS의 유발에 의해 발현이 증가된 유전자와 연관된 세포기능은 AGR 투여에 의해 회복되었으나, 발현이 감소한 유전자와 연관된 세포기능은 AGR 투여에 의해 회복되지 않았다(Fig.
- 칩에서 얻어진 raw data를 표준화 한 후, 본격적인 분석 작업을 시행하였는데, 발현증가의 경우 2배 이상, 발현감소의 경우 1/2 이하의 발현량을 보일 때를 증가 감소의 기준으로 삼았다. 그 결과 유전자 발현 패턴은 크게 6가지로 분류될 수 있으나, 본 연구와 관련하여 의미 있는 변화는 PCOS 유발로 인하여 발현이 감소하거나, 증가한 유전자와 이렇게 변화한 유전자들 중에서 AGR 투여를 통하여 발현 정도가 정상 수준으로 돌아간 유전자(A, B)들이다.
- 3, 4). 한편 AGR의 투여가 PCOS의 유발에 미치는 영향을 유전자 차원에서 측정한 결과 다양한 유전자의 발현이 AGR 투여에 의해 변화된다는 것을 알 수 있었다(Fig. 2). 특이한 점은 PCOS의 유발에 의해 발현이 증가 혹은 감소한 유전자들이 AGR 투여에 의해 정상수준으로 발현이 회복되기도 하지만, AGR 투여 자체에 의해 새로운 유전자들의 발현이 변화한다는 점이다.
후속연구
- 4, 5, 8). 이는 향후 AGR 투여 자체의 유전적 영향을 규명하기 위해서 이런 신규 유전자들의 발현이 매우 중요할 것으로 판단된다.
- 이러한 유전자들은 당귀에 의한 효과를 중간에 매개하는 주요기능을 수행할 것으로 판단되고 AGR의 분자적 기전을 설명하는데 중요한 역할을 수행할 것으로 기대한다.
- 그 기전으로는 세포 신호 전달 과정이나 염증 반응에 관여하는 기전이 관여할 것으로 생각되며, IRS2, MCM10, ORC2L, CTBP2, CD44, RHOA등의 유전자 그리고, 공통적으로 관여하는 총 24종의 전사인자들 또한 유기적으로 관여할 것으로 생각된다. 이러한 표적 물질들은 당귀의 효과를 분자적 수준에서 규명하는데 필수적인 요소가 될 것이며, 추후 신약 개발 등의 연구에도 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
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