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문제 정의
- 특히 LPS(lipopolysaccharide)로 유발된 대식세포의 TNF-α와 IL-6 생성을 억제하는 등 유의한 면역활성을 나타내었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 96 well plate에 1×105 cells/mL의 cell을 100 ㎕ 씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 LPS를 단독처리(2 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료(25, 50, 100 ㎍/mL)와 함께 배지에 담아 처리하고 3시간 동안 배양하였다.
- 이를 위해 다음과 같이 실험하였다. LPS를 단독처리(2 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료(25, 50, 100, 200 ㎍/mL)와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 100 ㎕을 채취하여 여기에 그리스시약 100 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 nitric oxide 생성은 다음 공식으로 계산하였다.
- LPS와 시료를 처리하기 전에 우선 DHR(10 uM)이 담긴 배지를 30분간 각 well에 처리한 뒤 배지를 제거하였다. LPS를 단독처리(2 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료(25, 50, 100, 200 ㎍/mL)와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포내 H2O2 생성은 다음 공식으로 계산하였다.
- SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 3시간에서 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 25 ㎍/mL 이상 일 때 모두 LPS에 의한 증가를 유의하게 감소시켰다(Fig.
- SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 TNF-α 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다.
- SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 hydrogen peroxide(H2O2)의 생성 감소에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간에서 모두 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 H2O2 생성이 감소하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 50 ㎍/mL이상일 때 LPS에 의한 감소를 유의하게 회복하였다(Fig.
- SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 nitric oxide(NO)의 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 NO생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 50, 100 ㎍/mL일 때 LPS에 의한 증가를 유의하게 억제시켰다(Fig.
- SFS가 대식 세포의 증식에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 감소는 없었다(Fig.
- SFS가 대식세포의 hydrogen peroxide(H2O2)의 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간에서 25 ㎍/mL 이상일 때 유의한 증가를 나타내었다(Fig.
- SFS가 대식세포의 nitric oxide(NO)의 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 4시간의 배양에서는 25, 50, 200 ㎍/mL일 때 유의한 감소를 나타내었으며, 24시간의 배양에서는 25 ㎍/mL이상일 때 모두 유의한 감소를 나타내었다(Fig.
- 苦參을 Saccharomyces cerevisiae STV89(효모)로 발효 추출한 후 얻은 추출시료 SFS로 마우스 Raw 264.7 cell을 이용한 cell viability, 세포내 hydrogen peroxide 생성, NO 생성, 그리고 cytokines(TNF-α와 IL-6 등) level에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- NO의 기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다. 그리스 시약(griess reagent : 0.5%의 설파닐아미드, 2.5%의 인산 및 0.5%의 나프틸에틸렌아민)은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 추정하기 위해 microplate reader를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO의 생성정도를 비교하였다. 이를 위해 다음과 같이 실험하였다.
- 면역단백질 분비와 관련된 시료의 영향을 알아보기 위해 Anderson 등18)의 방법을 응용하여 다음과 같이 실험을 시행하였다. 96 well plate에 1×105 cells/mL의 cell을 100 ㎕ 씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 LPS를 단독처리(2 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료(25, 50, 100 ㎍/mL)와 함께 배지에 담아 처리하고 3시간 동안 배양하였다.
- 배양이 끝나면 상층액을 채취하여 Bio-Plex Suspension Array System의 Bio-Plex Cytokine Assays를 실시하여 면역단백질들(TNF-α, IL-6)의 발현에 대한 시료의 영향을 계산, 비교하였다.
- 위에서 제조된 苦參 추출물을 이용하여 다음과 같이 苦參 발효 추출물을 제조하였다.
- 이에 著者는 발효한약의 유의성을 적용하여 苦參을 발효 추출하여 만들어진 시료 SFS로 마우스 대식세포를 이용한 cell viability, 세포내 hydrogen peroxide 생성, NO 생성, 그리고 cytokines(TNF-α와 IL-6 등) level에 미치는 영향을 측정하였다.
- 준비된 시료가 Raw 264.7 cells에 나타내는 세포독성 유발 효과를 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×104 cells/well의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다.
대상 데이터
- ① 조효소 조제 : 조효소제인 α-Herbzyme(한국효소) 3 g에 증류수 100 mL를 가하고 37℃에서 30분간 침출하여 여과시킨 후 그 여액을 조효소액으로 사용하였다.
- 실험에 사용된 苦參(Sphorae Radix)은 서울의 경동시장에서 2007년 10월에 구입하였으며, 약재는 경원대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였고 모든 약재는 쓰기 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다. 苦參의 발효에 사용한 균주로는 Saccharomyces cerevisiae STV89(효모)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator(NUAIRE, USA), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), air compressor(Tamiya, Japan), homogenizer(Omni, USA), centrifuge(Hanil, Korea), fume hood(Hanil, Korea), clean bench(Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader(Bio-Rad, USA), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), water bath(iNtRON biotech, Korea), ice-maker(Vision Scientific Co, Korea) 등이다.
- 본 실험을 위해서 ethyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), DMSO(Sigma, USA), DMEM(Sigma, USA), 1×PBS(Sigma, USA), EDTA(Sigma, USA), isopropanol(Sigma, USA), trypsin-EDTA(Sigma, USA), Bio-Plex cytokine assay kit(Panomics, USA) 등이 사용되었다.
- 실험에 사용된 苦參(Sphorae Radix)은 서울의 경동시장에서 2007년 10월에 구입하였으며, 약재는 경원대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였고 모든 약재는 쓰기 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다. 苦參의 발효에 사용한 균주로는 Saccharomyces cerevisiae STV89(효모)를 사용하였다.
- 실험에 사용된 대식세포는 mouse 대식세포(Raw 264.7 cell line)이며 한국 세포주 은행 (KCLB, Korea)에서 구입하였다.
- . 이에 본 실험에서는 Saccharomyces cerevisiae STV89(효모)를 균주로 이용하여 발효하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치 ± 표준오차(mean ± SD)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test와 ANOVA test로 분석하여 p-value값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 세포내의 hydrogen peroxide(H2O2)는 dihydrorhodamine 123(DHR) assay를 이용하여 측정하였다. 96 well plate 1×104 cells/well의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다.
성능/효과
- 1. 苦參 발효 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 苦參 발효 추출물을 농도별로 처리했을 때 대식세포에 독성을 과도히 유발하지 않았다.
- 2. 苦參 발효 추출물은 대식세포의 세포내 hydrogen peroxide 생성을 증가시켰으며 LPS로 유발된 대식세포내의 hydrogen peroxide 생성억제를 유의하게 회복시켰다.
- SFS가 대식 세포의 증식에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 감소는 없었다(Fig. 1).
- SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 nitric oxide(NO)의 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 NO생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 50, 100 ㎍/mL일 때 LPS에 의한 증가를 유의하게 억제시켰다(Fig. 5).
- SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 nitric oxide(NO)의 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 NO생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 50, 100 ㎍/mL일 때 LPS에 의한 증가를 유의하게 억제시켰다(Fig. 5).
- )의 생성 감소에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간에서 모두 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 H2O2 생성이 감소하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 50 ㎍/mL이상일 때 LPS에 의한 감소를 유의하게 회복하였다(Fig. 3).
- 26) SFS가 대식세포의 nitric oxide(NO)의 생성에 미치는 영향을 비교하였는데 4시간의 배양에서는 25, 50, 200 ㎍/mL일 때 유의한 감소를 나타내었고, 24시간의 배양에서는 25 ㎍/mL이상일 때 모두 유의한 감소를 나타내었다. 24시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 NO생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 50, 100 ㎍/mL일 때 LPS에 의한 증가를 유의하게 억제시켰다.
- 28,29) SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 TNF-α 생성 증가에 미치는 영향을 비교했을 때 3시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 TNF-α 생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 25 ㎍/mL이상일 때 모두 LPS에 의한 증가를 유의하게 감소시켰다.
- 3. 苦參 발효 추출물은 대식세포의 NO의 생성을 억제하였으며 LPS로 유발된 대식세포의 NO 생성증가를 유의하게 억제하였다.
- 30) SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였는데 3시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 25 ㎍/mL 이상 일 때 모두 LPS에 의한 증가를 유의하게 감소시켰다.
- SFS가 LPS로 유발된 대식세포의 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 3시간에서 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 25 ㎍/mL 이상 일 때 모두 LPS에 의한 증가를 유의하게 감소시켰다(Fig. 7).
- 3시간에서 LPS 단독으로 배양한 경우 Normal 군보다 유의하게 TNF-α 생성이 증가하였으며 LPS와 SFS을 함께 배양한 경우 SFS의 농도가 25 ㎍/mL이상일 때 모두 LPS에 의한 증가를 유의하게 감소시켰다(Fig. 6).
- 4. 苦參 발효 추출물은 LPS에 의해서 유발된 대식세포의 TNF-α 및 IL-6 생성량을 25 ㎍/mL 이상에서 유의하게 감소시켰다.
- 본 연구에서는 한국 세포주 은행(KCLB, Korea)으로부터 분양받은 Raw 264.7 cells에 발효 苦參 추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리한 뒤에 24시간 동안 37℃에서 배양한 후, 세포의 증식을 MTT assay를 이용하여 확인한 결과 대조군에 비하여 苦參 발효 추출물이 Raw 264.7 cells에 유의한 세포증식률 감소를 일으키지 않았으며 이는 발효 苦參 추출물이 세포독성을 과도히 유발하지 않는다는 것으로 볼 수 있다.
- 이상의 결과, 苦參 발효 추출물 SFS는 대식세포에 세포독성을 과도히 유발하지 않으면서 대식세포의 hydrogen peroxide 생성을 증가시키고 대식세포의 NO 생성을 감소시켰으며 특히 LPS로 유발된 대식세포의 TNF-α와 IL-6 생성을 억제하는 등 유의한 면역활성이 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과, 苦參으로 제조된 발효 추출물 SFS는 대식세포에 세포독성을 과도히 유발하지 않으면서 대식세포의 hydrogen peroxide 생성을 증가시키고 대식세포의 NO 생성을 감소시켰으며 특히 LPS로 유발된 대식세포의 TNF-α와 IL-6 생성을 억제하는 등 유의한 면역활성을 가진 것으로 나타났다.
- 이에 著者는 본 연구에서 苦參을 Saccharomyces cerevisiae STV89(효모)로 발효 추출하여 제조한 시료 SFS로 마우스 Raw 264.7 cell을 이용한 cell viability, 세포내 hydrogen peroxide 생성, NO 생성, 그리고 cytokines(TNF-α, IL-6 등) level에 미치는 영향을 측정한 결과 SFS는 대식세포에 세포독성을 과도히 유발하지 않으면서 대식세포의 hydrogen peroxide 생성을 증가시키고 대식세포의 NO 생성을 감소시켰다.
후속연구
- 이상의 결과, 苦參 발효 추출물 SFS는 대식세포에 세포독성을 과도히 유발하지 않으면서 대식세포의 hydrogen peroxide 생성을 증가시키고 대식세포의 NO 생성을 감소시켰으며 특히 LPS로 유발된 대식세포의 TNF-α와 IL-6 생성을 억제하는 등 유의한 면역활성이 있음을 알 수 있었다. 앞으로 苦參 발효 추출물을 이용한 대식세포 연관 면역질환 치료제로의 개발을 위하여 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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