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문제 정의
- 이에 本 硏究에서는 瘙痒症의 內, 外治에 頻用되는 苦蔘을 試料로 向 後 治療 物質 開發의 基礎的 資料를 提供하고자, 아토피 피부염의 炎症性 機轉에 關與하는 유관 사이토카인 케모카인, histamine, β-hexosaminidase, NF-κB 및 活性酸素 등에 미치는 影響을 檢索하였다.
제안 방법
- 3차례의 급속 냉동-해동을 거쳐 세포를 파괴하고, 12,000 xg, 5분간 원심분리하여 세포 추출물을 얻어 luciferase substrate와 반응시켜 NF-κB promoter 활성을 측정하였다.
- 48well plate에 RBL-2H3 cell을 5 x 105 cell/ml로 18시간 배양한 뒤 FBS와 antibiotics를 제거한 배양액으로 바꿔준 후, NF-κB 부위가 3 copy로 되어있는 NF-κB-Luc vector와 b-galactosidase assay를 통해 형질 전환의 비율을 측정할 수 있도록 pCMV-β-Luc vector를 4시간 형질전환 시켰다.
- HMC-1 (Human mast cell line; J. H. Butterfield, Mato Clinic, Rochester, MN) 2.0 x 106/ml 세포를 DMEM {containing collagenase A (5mg/㎖, BM, Indianapoilis, IN, U.S.A)와 DNase typeⅠ(0.15mg/㎖, Sigma), antibiotics (penicillinm 104U/㎖, streptomycin 10mg/㎖, amphotericin B 25 ㎍/㎖)}과 4M2-mercaptoethanol을 넣고 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
- HMC-1 세포를 24 well plate에 5 x 104 세포로 각 well에 분주하고, 여기에 추출물 (200, 100, 10 ㎍/ml)과, 양성대조군으로 CsA (10 ㎍/ml)를 처리하고 1시간 후 PMA (50 ng/㎖)와 A23187 (0.5 μΜ)를 각각의 well에 첨가하여 CO2 배양기에 24시간에 배양한 후 2,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다.
- HMC-1 세포를 24 well plate에 5 x 104 세포로 각 well에 분주하고, 여기에 추출물 (200, 100, 10 ㎍/ml)과, 양성대조군으로 CsA (10 ㎍/ml)를 처리하고 1시간 후 PMA (50 ng/㎖)와 A23187 (0.5 μΜ)를 각각의 well에 첨가하여 CO2 배양기에 24시간에 배양한 후, 각 항체 anti-IgE 를 coating 완충 용액에 희석하여 microwell에 coating한 후 4℃에서 30분 방치한 후, ELISA reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 苦蔘 (SFR) 300 g에 methanol 2,000 ㎖을 가하여 추출기에서 3시간 추출을 2회 반복하였다. 이를 흡입 여과하여 감압 증류장치 (Rotary evaporator,BUCHI B-480, Switzerland)로 농축 하였다.
- 苦蔘이 아토피 피부염에서 瘙痒과 炎症性 機轉에關與하는 유관 사이토카인, 케모카인, histamine, β-hexosaminidase, NF-κB 등에 미치는 影響을 檢索하였던 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 관련 면역 실험에 앞서 본 실험에서는 먼저 SFR가 세포독성에 미치는 영향을 측정한 결과 250 ㎍/㎖ 이하 농도에서는 세포독성이 나타나지 않아, 이보다 낮은 200 ㎍/㎖ 농도를 최고 농도로 설정 하였다(Fig. 1).
- 따라서 NF-κB promoter 활성 억제는 염증 억제의 중요한 의미를 내포하고 있어, 본 실험에서는 RBL-2H3 cell을 통하여 이를 검색하였다.
- 0 x 104개 세포로 96 well plate에 분주한 후 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 2시간 배양하였다. 배양 후 SFR (최종 농도 1000㎍/㎖, 500㎍/㎖, 250㎍/㎖, 125㎍/㎖, 62.5 ㎍/㎖, 31.2 ㎍/㎖ 15.6 ㎍/㎖, 7.8 ㎍/㎖)을 48시간 동안 처리하였다. 배양 종료 후에 배양액을 버리고 인산완충용액 (PBS)로 2회 세척하고, 각 well에 50% TCA (trichloroacetic acid)를 50㎕를 가하여 1 시간 동안 4℃에 방치하였다.
- 0 x 106/m로 24 well plate에 분주한 후 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 16시간 배양하였다. 배양후 SFR (최종 농도 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 24시간 동안 처리한 후 집먼지 진드기(HDM-1 ㎍/㎖)를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 단핵구 화학유인물질 MCP-1 (monocyte chemoattractant protein -1, MCP-1), IL-6, IL-8의 양을 측정하였다.
- 세포독성 측정은 hFCs에 대하여 SRB assay법을 약간 변형하여 사용하였다. hFCs는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어낸 후, 2.
- 시료를 농도별로 1시간 전처리하고 양성대조군으로 10 μM의 A23187을 처리한 15분 뒤 상층을 얻었다.
- A), antibiotics (penicillinm 104 U/㎖, streptomycin 10 mg/㎖, ampho- tericin B 25 ㎍/㎖)}를 넣고 37℃ CO2 배양기에서 hFCs를 2 시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5% trypsin-0.2% EDTA를 첨가하여 30 분간 배양하고, 인산완충생리식염수 (PBS)로 약 2회 1,500 rpm에서 원심분리한 후 DMEM-10% FBS 로 1주일 동안 배양하였다. 이를 다시 0.
- 역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3㎍을 DNase I (10 U/㎕) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 여기에 2.5㎕ 10mM dNTPs mix, 1㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25 ㎕), RNA inhibitor로서 1㎕ RNase inhibitor (20 U/㎕), 1㎕ 100mM DTT, 4.5 ㎕ 5×RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15mM MHCl2)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 기기는 열탕추출기 (대웅, Korea), microwave oven (LG, Korea), rotary vaccum evaporator, vaccum pump (Büchi B-480, Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540, Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo, Co., Japan), micro-pipet (Gilson, Co., France), water bath (Vision scientific Co., Korea), plate shaker (Lab-Line, Co., U.S.A), vortex mixer, heating block (Vision scientific. Co., Korea), spectrophotometer (Shimazue, Co., Japan), centrifuge (한일. Korea), deep-freezer (Sanyo, Co., Japan), plate shaker (Lab-Line, U.S.A), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), ELISA reader (Molecular Devices, Co., U.S.A.), 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Co., U.S.A.), flow cytometer (Becton Dickinson, U.S.A) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시약 중 Diethyl pyrocarbonate (DEPC), trypsin-0.2% EDTA, 3-4, 5-dimethylthiazol-2, 5-carboxy methoxyphenyl-2, 4 - s u l f o p h e n y l - 2 H - t e t r a z o l i m ( M T S ) , RPMI-1640 배양액, trichloroacetic acid, isopropanol, ethidium bromide (EtBr), Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), EtOH, LPS, magnesium chloride (MYHYBTl2), A23187, PMA (phorbol 12-myristate13-acetate), p-nitrophenyl-N-acetyl-b- glucosamide,o-phtaldialdehyde, dexamethasone 등은 Sigma 사 (U.S.A) 제품을, Taq polymerase와 Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)는 TaKaRa 사 (Japan) 제품을, 역전사효소 (Moloey Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase ; M-MLV RT)와 CsA (cyclosporin A)는 중외제약 제품을, RNase inhibitor는 Promega 사 (Madison, U.S.A) 제품을, 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone 사 (Logan, U.S.A) 제품을, DMED은 Gibco 사 (Gaithersburg, MD, U.S.A) 제품을, RNase는 Pharmingen 사 (Torreyana, U.S.A) 제품을, 인간 재조합 IL-6, IL-8, TNF-α, histamine kit는 R & D system사 (U.S.A.) 제품을, LipofectamineTM2000 Reagent는 Invitrogen 사 (Carlsbad, U.S.A) 제품을, Luciferase assay kit는 Promega 사 (Madison, U.S.A) 제품을 구입하여 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 苦蔘 (SFR)은 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였고, 그 내용과 분량은 다음과 같다.
- 0 x 105/ml 세포를 DMEM, antibiotics (penicillinm 104 U/㎖, streptomycin 10 mg/㎖, amphotericin B 25 ㎍/㎖)과 10% FBS를 넣고, 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다. 사람의 단핵구인 THP-1 (human acute monocytic leukemia cell; 미국 세포주은행)은 2.0 x 105/ml로 맞추어 RBL-2H3 세포의 배양 방법과 동일하게 3일간 배양하였다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- Human fibroblast cell (hFCs) were cultured with various concentration of SFR extract for 48 hr and the cell viability was measured by SRB method. The results were presented by the mean ± S.
- 기술된 것에 따라 Real-Time PCR은 Applied (Applied Biosystems, U.S.A)을 사용하면서 수행되었다. probes는 6-carboxy-fluorescein으로 라벨을 붙이고, beta-actin cDNA는 모든 cDNA과 같은 양을 포함한 각 cDAN 표본을 AmpliTaq Gold DNA Polymerase을 포함시켜 TaqMan Universal PCR로 증폭시켰다.
성능/효과
- 1. 苦蔘은 Human fibroblast cell (hFCs)에 대하여 250 ㎍/㎖ 이하 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다.
- 2. 苦蔘은 HMC-1에서 IL-8, TNF-α, IL-6 mRNA 발현을 대조군에 비하여 억제하였으며, 특히 IL-6 mRNA 발현은 농도 의존적으로 억제하였다.
- 3. 苦蔘은 THP-1 세포에서 IL-6, IL-8, MCP-1생성량을 대조군에 비하여 농도의존적으로 억제하였으며, 특히 IL-6, MCP-1 생성량은 모든 농도에서 유의성 있게 억제하였다.
- 4. 苦蔘은 HMC-1에서 histamine 분비량을 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있게 감소시켰다.
- 5. 苦蔘은 β-Hexosaminidase 분비량을 10 ㎍/ml 농도에서는 10.3%, 100 ㎍/ml 농도에서 21.7%, 200 ㎍/ml 농도에서 50.8% 억제하였으며, IC50 (μg/ml)은 196.85 μg/ml로 나타났다.
- 6. 苦蔘은 NF-κB promoter 활성을 대조군에 비하여 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다.
- HMC-1에서 IL-6 mRNA 유전자 발현은 대조군의 RQ값이 1 일때, CsA는, 0.245, SFR는 200, 100, 50 ㎍/ml 농도 투여군은 각각 0.394, 0.418, 0.959로 나타났다 (Fig. 4).
- HMC-1에서 IL-8 mRNA 유전자 발현은 대조군의 RQ값이 1 일때, CsA는 0.609, SFR는 200, 100, 50 ㎍/ml 농도 투여군에서는 각각 0.050, 0.346, 0.054로 나타났다 (Fig. 2).
- HMC-1에서 TNF-α mRNA 유전자 발현은 대조군의 RQ값이 1 일때, CsA는 0.153, SFR는 200, 100, 50 ㎍/ml 농도 투여군에서는 각각 0.052, 0.363, 0.038로 나타났다 (Fig. 3).
- HMC-1에서 histamine양을 측정한 결과, 정상군은 5.2 ± 0.8 nmol로 나타난 반면, 대조군 79.7± 4.9 nmol로 나타나 큰 폭으로 증가하였다.
- SFR에 의한 β-Hexosaminidase 분비량을 측정한 결과, 대조군인 A23187에 의해 방출되는 β-Hexosaminidase 분비량의 SFR에 의한 inhibition 비율이 SFR 10 ㎍/ml 농도에서는 10.3%, 100 ㎍/ml 농도에서는 21.7%, 200 ㎍/ml 농도에서는 50.8%로 유의성 있게 증가하였다.
- SFR에 의한 NF-κB promoter 활성 억제 효과를 검색한 결과, 정상군에 비해 대조군인 PMA는 4배 증가하였으며, SFR 10, 100, 200 ㎍/ml 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하였다.
- SFR의 세포독성을 측정한 결과, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6, 7.8 ㎍/㎖ 농도에서 생존율이 각각 55.11 ± 0.15, 77.21 ± 0.13, 101.65 ± 0.13, 112.82 ± 0.22, 125.56 ± 0.16, 122.44 ± 0.20, 119.06 ± 0.69, 111.53 ± 0.13%로 나타나, 250 ㎍/㎖ 이하 농도에서는 유의성 있는 감소는 나타나지 않았다 (Fig. 1).
- 따라서 NF-κB promoter 활성 억제는 염증 억제의 중요한 의미를 내포하고 있어, 본 실험에서는 RBL-2H3 cell을 통하여 이를 검색하였다. 결과적으로 정상군에 비해 대조군인 PMA는 4배 증가하였으며, SFR 10, 100, 200 ㎍/ml 농도 투여군에서는 농도의존적으로 감소하였다. SFR 10 ㎍/ml 농도에서는 대조군에 비하여 약 30%, 100 ㎍/ml 농도에서는 약 50%, 200 ㎍/ml 농도에서 약 80% 정도 유의성 있게 (*p < 0.
- 이 밖에도 MCP-1은 시험관에서 Th 0 cells 을 Th 2 cytokines을 분비하는 세포로 전환시킨다는 보고가 있다34). 그리고 이를 정맥주사 하였을 때 IL-12의 생성은 감소되고 IL-4의 생성이 증가함으로써, 간접적으로 IgE-의존적 알레르기 염증을 악화시킬 수 있음이 밝혀졌다. IL-8은 초기 염증 반응에 중요하고, 기도 상피세포에서 분비되는 중요한 염증성 케모카인으로서35), IL-8에 의해 기관지 과민성이 유발되고36),알레르기 비염이나 기관지 천식에서 증가되며37-38) 스테로이드에 의해 억제된다.
- 면역 관련 실험으로 본 실험에서는 먼저 아토피 피부염 및 알레르기성 질환에 관여되는 비만세포 HMC-1에 PMA (50 ng/㎖)와 A23187을 처리하여 활성화 시킨 뒤 SFR을 농도 별로 처리하여 염증성 사이토카인 TNF-α/IL-8/IL-6 에 대한 mRNA 유전자 발현을 통해 분석한 결과, 모두 대조군에 비하여 감소하였다.
- 본 실험에서 histamine 분비량은 Fig. 8에서 보는 바와 같이, 정상군이 5.2 ± 0.8 nmol로 나타난 반면, 대조군이 79.7 ± 4.9 nmol로 나타나 큰 폭으로 증가하였다.
- 또한 환경 내에서 집먼지 진드기에 대한 노출을 줄임으로써 아토피 피부염의 중증도를 감소 시킬 수 있다고 알려져 있다. 본 실험에서는 사람의 단구세포인 THP-1 세포에 집먼지 진드기로 활성화시킨 뒤 SFR로 처리하여 집먼지 진드기에 유도되는 염증성 사이토카인에 대한 특이적 억제능을 보았는데, 활성화된 단핵구에서 생산된 MCP-1, IL-6, IL-8 생성량은 농도 의존적으로 억제 되었다(Fig. 5, 6, 7).
- 사람의 단핵구인 THP-1 세포에서 IL-6 생성을 측정한 결과, 정상군은 106.25 ± 11.5 pg/ml, 대조군은 995.0 ± 23.0 pg/ml, 양성대조군인 dexamethasone 투여군은 92.5 ± 22.5 pg/ml, SFR는 200, 100, 50 ㎍/ml 농도 투여군은 58.75± 16.5, 167.5 ± 13.1, 257.5 ± 23.6 pg/ml로대조군에 비하여 큰 폭으로 생성량이 감소되었고, 모든 농도에서 유의성 있게 (***p < 0.001, **p <0.01) IL-6의 생성을 억제하였다 (Fig. 5).
- 사람의 단핵구인 THP-1 세포에서 IL-8 생성을 측정한 결과, 정상군은 103.3 ± 24.1 pg/ml, 대조군은 3532.5 ± 50.4 pg/ml, 양성대조군인 dexamethasone 투여군은 82.5 ± 24.1 pg/ml, SFR는 200, 100, 50 ㎍/ml 농도 투여군은 1240.83 ± 124.1, 2549.1 ± 124.0, 3240.8 ±132.1 pg/ml로 대조군에 비하여 큰 폭으로 생성량이 감소되었고, 200 ㎍/ml 농도에서 유의성 있게 (*p < 0.05) IL-8의 생성을 억제하였다 (Fig. 6).
- 사람의 단핵구인 THP-1 세포에서 MCP-1 생성을 측정한 결과, 정상군은 27.8 ± 5.2 (pg/ml), 대조군은 1177.8 ± 20.1 (pg/ml), 양성대조군인 dexamethasone 투여군은 17.8 ± 10.4 pg/ml, SFR는 200, 100, 50 ㎍/ml 농도 투여군은 21.1± 12.1, 439.5 ± 32.1, 781.1 ± 23.1 pg/ml로 대조군에 비하여 큰 폭으로 생성량이 감소되었고, 모든 농도에서 유의성 있게 (***p < 0.001, **p <0.01, *p < 0.05) MCP-1의 생성을 억제하였다 (Fig. 7).
- 이상의 결과로 보아 SFR가 항염증성 효과를 통한 알레르기성 질환 및 아토피 피부염에 대한 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있었고, 특히 잘 알려진 양방의 면역억제제와 동일한 수준의 억제 효과를 보임으로써, 스테로이드 제제의 단점을 극복하고 효과적인 치료제로써의 가능성을 제시하였다.
- 특히 IL-8을 제외한 MCP-1 및 IL-6는 스테로이드 제제인 dexamethasone을 대조군으로 하였을 때 유의한 수준의 억제 효과를 보였다. MCP-1은 CCR2에 결합하며 MCP-1 유전자가 제거된 생쥐는 monocytes에 대한 화학주성이 손상을 받고, 특정 균의 감염에 저항성이 약화되는 것이 관찰되었으며33), 이러한 현상은 CCR2 유전자가 제거된 동물에서 관찰되는 증상과 유사하다고 보고되었다.
- 특히 SFR 투여군의 TNF-α/IL-8 발현은 200㎍/㎖ 농도에서 양방에서 이미 알려진 면역억제제 cyclosporin A 보다 더 높은 억제 효과를 보였다(Fig. 2, 3, 4).
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