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문제 정의
- 본 실험에서는 항산화와 지질 대사에 관여하는 민들레를 초음파 추출 여부에 따른 효능의 변화를 확인해 보고자 고지방 식이를 급여한 동물모델을 이용하여 각각의 추출물을 투여한 후 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구에서는 항산화계와 지질대사에 관여하는 민들레가 열수추출과 초음파추출에 따라 어떤 효과 변화를 보이는지 알아보고자 고지방식이를 급여하여 비만을 유도한 흰쥐에 각각의 추출물을 투여하고, 항산화계와 지질대사 개선에 관여하는 지표들을 측정 비교하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 1,500 × g에서 10분간 원심분리한 후 상층액(n-butanol : pyridine층)을 채취하여 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 간장내 TBARS 정량은 Ohkawa 등14)의 방법으로 정량했다. 1～2 g 정도의 간장절편을 0.9% 생리식염수로 세척하여 혈액을 제거하고, 1.15% KCl 수용액과 혼합한 후, homogenizer로 충분히 마쇄하여 10% homogenate를 만들었다. 이 중 0.
- TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)의 측정은 혈장과 간장에서 측정하였다. 혈장 TBARS의 정량은 EDTA처리 혈액으로부터 혈장을 분리하여, 37℃에서 120분간 배양 후 Buege와 Aust의 방법13)에 의해 정량했다.
- 에 준했다. 간장 0.2 g을 20배의 25 mM KH2PO4-NaOH buffer(pH 7.0)에 넣어 균질화 시키고 이 homogenate를 같은 buffer로 60배 희석한 후 ice bath 상태에서 ultrasonicator (Heat System Ultrasonics. Inc., Ultrasonic Propessor W-385)로 15초씩 2회 반복하여 이 시료를 Spectrophtometer (550 ㎚)에서 흡광도를 측정한 후 formaldehyde를 표준용액으로 하여 얻은 표준곡선으로부터 활성을 계산하였다.
- 간장내 total cholesterol 및 triglyceride (TG)량은 정량용 kit(Wako Co., 일본)를 이용하여 분석했다.
- 고지방식이를 급여하여 비만을 유도한 흰쥐를 대상으로 기존의 열수 방식과 초음파 방식으로 추출한 민들레 추출물의 항산화계 활성효과와 지질대사를 측정 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험군은 대조군(생리식염수 투여군, 100 ㎎/㎏), TP-N-1(열수 추출, 100 ㎎/㎏), TP-N-2(열수 추출, 200 ㎎/㎏), TP-S-1(열수 초음파 추출, 100 ㎎/㎏), TP-S-2(열수 초음파 추출, 200 ㎎/㎏), 등 5개의 군으로 나누었다. 고지방식이를 급여한 후, 시험기간 4주 동안의 각 처리군 들의 식이급여는 전 처리군 동일하게 기본식이(Table 1)를 급여하였으며, 급여량은 각 처리군 간에 섭취량의 차이가 5%이내가 되도록 균등 급여하였다. 물은 자유 급여하였다.
- 원심분리시의 온도는 4℃를 유지하였으며, 조제한 시료를 stock solution (K buffer, 40 mM glutathione, KH buffer, ㎖당 1 Unit의 glutathione reductase)에 넣어 37℃에서 10분간 항온 시킨 후, 20 mM NADPH를 첨가하여 다시 2분 동안 방치시켰다. 그리고 15 mM t-butyl hydroperoxide를 가하여 그 반응을 340 ㎚에서 1분간 흡광도가 감소하는 속도를 측정하였다. GSH-Px 활성도의 unit는 ㎎ protein당 1분 동안 NADPH가 NADH로 산화되는 nM으로 나타내었다.
- 으로 측정했다. 본 실험에서는 ferricytochrome C의 환원이 방해되는 정도를 550㎚에서 30초 간격으로 3분간 비색정량한 후 ferricytochrome C의 환원을 50% 방해하는 SOD의 양을 1 unit로 하여 분당 활성정도를 나타내었다.
- 물은 자유 급여하였다. 시료투여는 각 처리군 별 정량을 매일 오후 5시경에 존대를 이용하여 경구 투여하였다.
- 38 g의 Sprague-Dawely계 수컷 40두를 고지방식이(Table 1)를 8주간 급여한 후, 체중이 390 g 이상인 동물을 선발하여 각 군별로 평균체중이 유사하게 임의 배치하였다. 실험군은 대조군(생리식염수 투여군, 100 ㎎/㎏), TP-N-1(열수 추출, 100 ㎎/㎏), TP-N-2(열수 추출, 200 ㎎/㎏), TP-S-1(열수 초음파 추출, 100 ㎎/㎏), TP-S-2(열수 초음파 추출, 200 ㎎/㎏), 등 5개의 군으로 나누었다. 고지방식이를 급여한 후, 시험기간 4주 동안의 각 처리군 들의 식이급여는 전 처리군 동일하게 기본식이(Table 1)를 급여하였으며, 급여량은 각 처리군 간에 섭취량의 차이가 5%이내가 되도록 균등 급여하였다.
- 채혈은 실험종료 12시간 전에 급여식이를 중단, 절식한 상태에서 심장천자법에 의해 채혈한 후 공시하였다. 간 조직은 채혈 후 흡입마취 시킨 다음 적출하여 공시하였다.
- 혈장 triglyceride, total cholesterol (TC), LDL-cholesterol 및 HDL-cholesterol 농도, 혈장 glucose 농도는 혈액자동분석기(Boehringer Manheim, 독일)에 의해 분석했다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 민들레는 양구군에서 구입하였고, 민들레 100 g을 증류수 3000 ㎖와 함께 90℃의 온도로 120분간 전탕하면서 초음파 처리 유무에 따라 2가지의 추출물을 획득하였다.
- 1,500 × g에서 10분간 원심분리한 후 상층액(n-butanol : pyridine층)을 채취하여 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 TMP (1,1,3,3-tetraamitoxypropane)를 사용하였고, lipid peroxide 수준은 nM MDA (malondialdehyde)로 표시하였다.
데이터처리
- 실험결과는 Mean±SEM으로 표시하였으며, Prism 5를 이용 하여 one-way ANOVA검정을 수행하였으며, 각 처리군간의 유의성 검정은 Tukey test 에 의해 p<0.05 수준에서 실시했다.
이론/모형
- glutathione peroxidase (GSH-Px) 활성측정은 Levander 등의 방법15)에 의해 측정했다. 일정량의 간장절편을 생리식염수로 세척하여 혈액을 제거시킨 후, 0.
- 간장 catalase활성측정은 Johnsson과 Hakan Borg의 방법17)에 준했다. 간장 0.
- 간장 내 SOD 측정은 Xanthine oxidase에 의해 Superoxide를 생성하고, 이 superoxide가 ferricytochrome C (Fe3+)를 ferrouscytochrome C (Fe2+)로 환원시키는데 이때 SOD가 존재하면 SOD가 superoxide에 대해 경쟁하여 cytochrome C의 환원속도가 감소되는 원리를 이용한 Flohe 등의 방법16)으로 측정했다. 본 실험에서는 ferricytochrome C의 환원이 방해되는 정도를 550㎚에서 30초 간격으로 3분간 비색정량한 후 ferricytochrome C의 환원을 50% 방해하는 SOD의 양을 1 unit로 하여 분당 활성정도를 나타내었다.
- 혈장 TBARS의 정량은 EDTA처리 혈액으로부터 혈장을 분리하여, 37℃에서 120분간 배양 후 Buege와 Aust의 방법13)에 의해 정량했다. 간장내 TBARS 정량은 Ohkawa 등14)의 방법으로 정량했다. 1～2 g 정도의 간장절편을 0.
- TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)의 측정은 혈장과 간장에서 측정하였다. 혈장 TBARS의 정량은 EDTA처리 혈액으로부터 혈장을 분리하여, 37℃에서 120분간 배양 후 Buege와 Aust의 방법13)에 의해 정량했다. 간장내 TBARS 정량은 Ohkawa 등14)의 방법으로 정량했다.
- 혈장 유리지방산 (FFA) 함량은 V-NEFA kit (일수제약, 일본)를 이용한 효소법에 의해 측정했다.
성능/효과
- triglyceride은 기아과 당뇨 등의 상황에서 간 속에 출현한다38). liver total cholesterol은 처리군간에 유의한 차이가 없었으나 초음파 추출 200 ㎎을 투여한 군(TP-S-2)에서 가장 낮은 값을 보였고, liver triglyceride는 대조군에 비하여 실험군 모두 유의적으로 감소하였으며, 특히 초음파 추출 200 ㎎을 투여한 군(TP-S-2)에서 현저한 감소를 보였다.
- 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏은 liver total cholesterol과 liver triglyceride를 모두 유의하게 낮은 결과를 보였고, 민들레 물 추출물은 liver triglyceride를 이 유의하게 낮은 결과를 보였다(Table 6).
- 혈장 total cholesterol, LDL-cholesterol 및 HDL-cholesterol 농도를 측정한 결과, total cholesterl은 민들레 초음파 추출물 200 ㎎/㎏이 유의하게 낮았고, 모든 추출물에서 LDL은 대조군에 비하여 유의하게 낮은 결과를 보였으며, HDL의 경우 민들레 초음파 추출물 200㎎/㎏이 유의하게 높은 결과를 보였다. 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏은 liver total cholesterol과 liver triglyceride를 모두 유의하게 낮은 결과를 보였다.
- 그 중 LDL의 혈중 농도가 높을수록 죽상경화증을 일으키는 가장 중요한 요인이 되며, HDL은 동맥 혈관벽에 침전되기 시작하는 콜레스테롤을 흡수할 수있어서 HDL/LDL비가 높으면 죽상경화증의 발생 가능성을 현저하게 감소시킨다38). 본 실험에서 plasma total cholesterol과 plasma LDL-cholesterol은 대조군과 비교하여 실험군 모두 낮은 지질 수준을 보였으나 초음파 추출 200 ㎎을 투여한 군(TP-S-2)에서 현저한 저하 능력을 보였다. plasma HDL-cholesterol은 초음파 추출 200 ㎎을 투여한 군(TP-S-2)에서 유일하게 유의적으로 감소하였다.
- 지방조직에 저장된 지방이 에너지 공급을 위해 신체의 다른 부위에서 사용되려면 지방조직으로부터 다른 조직으로 운반되어야 하는데, 지방세포로부터 혈장에 나온 지방산은 강하게 이온화되고 알부민 분자와 결합하여 free fatty acid의 형태로 운반된다38). 본 실험에서 plasma triglyceride, plasma glucose, plasma FFA 모두 대조군과 비교하여 낮은 수준을 보여 민들레의 지질 저하 효능을 확인하였고, plasma triglyceride와 plasma FFA는 초음파 추출 200 ㎎을 투여한 군(TP-S-2)에서 보다 현저한 감소를 보였다.
- 유리기는 지질, 단백질 및 DNA를 손상시킴으로서 세포손상을 초래하게 된다30). 본 실험에서 혈장 및 간장의 TBARS를 측정한 결과 TP-N-2군에서 혈장 및 간장 TBARS 농도가 가장 낮게 나타나 지질과산화 저하에 유의한 감소가 있었다. 이것은 TP-N-2군이 산화물질의 축적을 하락시키는 항산화기능을 가지고 있음을 시사해 준다.
- Catalase는 조직내에서 SOD 등의 효소적 반응에 의해 생성된 과산화수소를 제거하여 생체를 방어하는 기능을 하며, 대사과정 중에 발생되는 활성산소의 유리기를 제거하고, 지방산화에 의해 생성된 유리기도 제거한다36,37). 본 실험의 경우 열수추출물의 항산화효과가 보다 높게 나타났다.
- 전체적으로 민들레는 항산화와 지질대사에 관여하고 있으며, 물 추출물의 경우 항산화에 유의한 결과를 보였고, 지질대사에는 초음파추출물에서 유의한 결과를 보였다. 이러한 결과는 사용 목적에 따라 추출방법의 변화를 모색할 필요가 있음을 시사해준다.
- 혈장 및 간장 내 TBARS농도를 측정한 결과, 민들레 추출물이 대조군에 비하여 낮은 수치를 보였으며, 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏의 농도에서 유의한 결과를 보였다. 항산화계에 작용하는 효소 활성을 측정한 결과 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏이 GSH-Px, CAT에서 유의하게 높은 결과를 보였다. 혈장 plasma 의 경우 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏에서 유의하게 낮았고, 혈장 FFA와 plasma glucose의 경우 모든 민들레 추출물군이대조군에 비하여 낮았고, 혈장 FFA의 경우 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏ 에서 유의하게 낮은 결과를 보였다.
- 항산화계에 작용하는 효소 활성을 측정한 결과 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏이 GSH-Px, CAT에서, 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏은 CAT에서 유의하게 높은 결과를 보였다(Table 3).
- 항산화계에 작용하는 효소 활성을 측정한 결과 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏이 GSH-Px, CAT에서 유의하게 높은 결과를 보였다. 혈장 plasma 의 경우 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏에서 유의하게 낮았고, 혈장 FFA와 plasma glucose의 경우 모든 민들레 추출물군이대조군에 비하여 낮았고, 혈장 FFA의 경우 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏ 에서 유의하게 낮은 결과를 보였다. 혈장 total cholesterol, LDL-cholesterol 및 HDL-cholesterol 농도를 측정한 결과, total cholesterl은 민들레 초음파 추출물 200 ㎎/㎏이 유의하게 낮았고, 모든 추출물에서 LDL은 대조군에 비하여 유의하게 낮은 결과를 보였으며, HDL의 경우 민들레 초음파 추출물 200㎎/㎏이 유의하게 높은 결과를 보였다.
- 혈장 plasma의 경우 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏과 민들레물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏에서 유의하게 낮았고, 혈장 FFA와 plasma glucose의 경우 모든 민들레 추출물군이 대조군에 비하여 낮았고, 혈장 FFA의 경우 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏ 에서 유의하게 낮은 결과를 보였다(Table 4).
- 혈장 plasma 의 경우 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏에서 유의하게 낮았고, 혈장 FFA와 plasma glucose의 경우 모든 민들레 추출물군이대조군에 비하여 낮았고, 혈장 FFA의 경우 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏ 에서 유의하게 낮은 결과를 보였다. 혈장 total cholesterol, LDL-cholesterol 및 HDL-cholesterol 농도를 측정한 결과, total cholesterl은 민들레 초음파 추출물 200 ㎎/㎏이 유의하게 낮았고, 모든 추출물에서 LDL은 대조군에 비하여 유의하게 낮은 결과를 보였으며, HDL의 경우 민들레 초음파 추출물 200㎎/㎏이 유의하게 높은 결과를 보였다. 민들레 물 초음파 추출물 200 ㎎/㎏은 liver total cholesterol과 liver triglyceride를 모두 유의하게 낮은 결과를 보였다.
- 혈장 total cholesterol, LDL-cholesterol 및 HDL-cholesterol 농도를 측정한 결과, total cholesterl은 민들레 초음파 추출물 200㎎/㎏이 유의하게 낮았고, 모든 추출물에서 LDL은 대조군에 비하여 유의하게 낮은 결과를 보였으며, HDL의 경우 민들레 초음파 추출물 200 ㎎/㎏이 유의하게 높은 결과를 보였다(Table 5)
- 혈장 및 간장 내 TBARS농도를 측정한 결과, 민들레 추출물이 대조군에 비하여 낮은 수치를 보였으며, 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏의 농도에서 유의한 결과를 보였다. 항산화계에 작용하는 효소 활성을 측정한 결과 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏이 GSH-Px, CAT에서 유의하게 높은 결과를 보였다.
- 혈장 및 간장내 TBARS농도를 측정한 결과, 민들레 추출물이 대조군에 비하여 낮은 수치를 보였으며, 민들레 물 추출물 200 ㎎/㎏의 농도에서 유의하게 낮은 결과를 보였다(Table 2).
후속연구
- 이러한 결과는 사용 목적에 따라 추출방법의 변화를 모색할 필요가 있음을 시사해준다. 그러나 향후 상세한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, 민들레의 열수 추출물은 항산화작용에 유리하고 열수 초음파 추출물은 지질강하 효과가 높게 나타나 향후 다양한 약물 및 여러 추출법의 실험과 연구를 통한 임상활용의 가능성을 시사한다 하겠다.
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