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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 최근 국내에서 기능성 소재로서 시판되고 있는 male의 유용성 분의 최적 추출조건을 설정 하고자 하였으며, 이를 위해서 에탄올 농도, 추출온도 시료에 대한 용매비에 따른 유용성분의 주줄특성을 반응표면분석으로 모니터링 하였다.
제안 방법
- 본 실험은 반응표면분석법을 이용하여 mate 에탄올 추출물의 이화학적 특성을 모니터링 하였다. 추출조건에 따른수율 및 총 폴리페놀함량의 최대값은 예측된 정상점에서 능선분석을 실시하여 본 결과, 4.
- 추출조건에 대한 실험계획은 중심합성계획(central composite design) (18)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 SAS (statistical analysis system)(19)를 사용하였다. 실험계획은 Table 1과 같이 추출공정에서 중요한 변수로 고려되는 인자 즉, 시료에 대한 에탄올 농도(0~100%, X1), 추출온도(35~95℃, X2), 용매비(10~30 rnWg, X를 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 Table 2와 같이 16구간으로 설정하여 추출실험을 실시하였다. 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속변수(Yn) 즉, 수율(Y1), 총 폴리페놀함량(丫2), Caffeic acid함량(Y3), 전자공여 능(丫4), 아질산염소거 능(丫5), SOD 유사활성(丫6)으로 하였으며, 이들은 3 회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.
- 실험계획은 Table 1과 같이 추출공정에서 중요한 변수로 고려되는 인자 즉, 시료에 대한 에탄올 농도(0~100%, X1), 추출온도(35~95℃, X2), 용매비(10~30 rnWg, X를 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 Table 2와 같이 16구간으로 설정하여 추출실험을 실시하였다. 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속변수(Yn) 즉, 수율(Y1), 총 폴리페놀함량(丫2), Caffeic acid함량(Y3), 전자공여 능(丫4), 아질산염소거 능(丫5), SOD 유사활성(丫6)으로 하였으며, 이들은 3 회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.
- 추출조건별 추출물의 cafeic acid함량 분석은 Waters 515 HPLC pump, 486 Tunable Absorbance Detector를 연결한 HPLC System을 사용하였다. 분석용 columne sunfire C18 (4.
- 2로 달리하여 반응용액의 부피를 10 mL로 히였다. 이를 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 반응액을 1 mL씩 취하고 여기에 2% 초산 5 mL, Griess 시 약(acetic acid 에 1 % sulfanylic acid와 1naphthylamine을 1:1 비율로 혼합 것으로 사용 직전에 제조) 0.4 mL를 가하여 잘 혼합시켜 15분간 실온에서 방치시킨 후 분광 광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co, Sweden) 를 사용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염 량을 구하였다. 그리고 대조구는 Griess 시약대신 증류수 0.
- 조건별 추출물의 최적 추출조건 예측은 품질특성에 대한 contour map superimposing 했을 때 중복되는 부분의 범위에서 최적 추출조건 범위를 설정하였다. 또한 예측된 범위에서 임의의 중심점을 최적조건으로 예측하고, 각 회귀식에 대입하여 예측 값을 설정하였다.
- 최적 추출조건 범위를 설정하였다. 또한 예측된 범위에서 임의의 중심점을 최적조건으로 예측하고, 각 회귀식에 대입하여 예측 값을 설정하였다.
- 중심합성계획에 의해 각 요인변수에 따른 반응변수들즉, 수율(Y), 총폴리페놀 함량(丫2), caffeic acid함량 전자공여능(丫4), 아질 산염 소거능(丫5)및 SOD유사활성(丫6)에 대한 회귀식과 반응표면분석에 의해 최적추출조건을 예측하였다. 이들 회귀식에서 요인변수들 중 영향이 가장 적은것으로 나타난 추출온도를 76.
- mate의 추출조건을 최적화하기 위하여 추출물의 특성인조건별 추출물의 수율, 총 폴리페놀함량 caffeic acid함량, 전자공여능에 대해 contour map을 superimposing흐}여 최 적추출조건 범위를 예측하였다. Fig.
대상 데이터
- Mate (Ilex paraguarensis)는 대구소재 (주)대자연 B&T 에서 제공받아 본 실험에 사용하였으며, 시료는 분쇄기 (J-NCM, Jisico, Ko)로 분쇄한 후 표준체 No. 60을 통과한것을 -20℃ 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.
- System을 사용하였다. 분석용 columne sunfire C18 (4.5x150 mm, Waters)를 사용하였으며, 이동상은 2% 아세트산과 아세토나이트릴을 99:1의 비율로 조제하여 1.0 ml/min의 속도로 흘려 caffeic acid 표준품(Sigma, St Louis, MO, USA) 및 추출액을 10 pL 주입하였고 검출파장은 280 nm 였다.
이론/모형
- 본 실험에서는 추출물의 기능적 특성을 최대로 하는 최적 추출조건을 설정하기 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)(17)을 사용하였다. 추출조건에 대한 실험계획은 중심합성계획(central composite design) (18)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 SAS (statistical analysis system)(19)를 사용하였다.
- 총 폴리페놀함량은 FoUn-Denis (21)법 에 따라 추출조건에 따른 추출액 0.5 mL에 2N Folin-ciocalteau reagent 0.1 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 다음 8.4 mg 멸균 증류수를 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후 20% Na2CO3 1 mL 를 첨가하고 실온에서 1시간 반응 시킨 후 spectreotcmeter (Ultrasp2100pro, Amersham Co, Sweden) 를 이용하여 725 irn에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀의 함량은 tannic acid (Sigma, St, Louis, MO, USA)를 정 량하여 작성 한표준 곡선으로부터 계산하였다.
- 항산화능을 측정하기 위한 전자공여 능은 1, 1 diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH)의 환원력을 이용하여 측정하였다 (22). 즉, 추출물 1 ml/] 4X10-4 M DPPH용액(99.
- 아질산염 소거 효과(nitrite-scavenging effect)는 Gray등의 방법(23)으로 측정하였다. 즉, 1 mM 아질산나트륨 용액 1 mL에 각각의 추출물을 2 mL 가하고 여기에 0.
- SOD 유사활성의 측정은 Marklund와 MMdund의 방법을 변형 한 Kim 등(24)의 방법을 이용하여 실시하였다. 즉, 각 추출물을 감압 농축한 후 tris-HCl buffer (50 mM tris [hydroxymethyl]amino-methane+10 mM EDTA, pH 8.
- 추출조건에 대한 실험계획은 중심합성계획(central composite design) (18)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 SAS (statistical analysis system)(19)를 사용하였다. 실험계획은 Table 1과 같이 추출공정에서 중요한 변수로 고려되는 인자 즉, 시료에 대한 에탄올 농도(0~100%, X1), 추출온도(35~95℃, X2), 용매비(10~30 rnWg, X를 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 Table 2와 같이 16구간으로 설정하여 추출실험을 실시하였다.
성능/효과
- 8842로 5%이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었으며, 에탄올 농도에 크게 영향을 받고 있는 것으로 나타났다 추출조건에 따른 아질산염 소거 능은 pH가 낮을수록 아질산염 소거 능이 증가하였으며, 시료에 대한 용매비 와 추출온도의 영 향은 뚜렷하게 나타나지 않았으나 에탄올 농도가 증가할수록 아질산염 소거능은 낮아짐을 알 수 있었다. SOD 유사활성은 에탄올 농도 및 추출온도에 따른 영향보다는 용매비에 많은 영향을 받음을 알 수 있었다. 추출물의 특성 인 조건별 추출물의 수율, 총 폴리페놀함량, caffeic acid함량, 전자공여능에 대해 contour map을 superimposing하여 얻은 최적 주줄조건의 범위는 에탄올 농도 21 ~48%, 추출온도 76.
- 1에 나타내었다. 즉 시료에 대한 용매비보다는 에탄올 농도에 많은 영향을 받는것으로 나타났다. 이러한 결과는 Park 등(25)의 산국 에탄올 추출물의 가용성 고형분 함량이 시료에 대한 용매비와 추출시간의 영향보다는 에탄올 농도에 의해 영향을 많이 받고있다는 보고와 같은 경향을 나타내었다.
- 1에 나타내었다. 즉 추출온도보다는 시료에 대한 용매비와 에탄올 농도에 많은 영향을 받음을 알수 있었다. Park 등(26)의 메밀 새싹 에탄올 추출조건 연구에서 총 폴리페놀함량은 추출온도에 비하여 에탄올 농도가더 큰 영향을 준다는 보고와 유사한 경향을 나타내었다 Mate는 다양한 폴리페놀과 quercetin, kampferol, rutin과 같은 플라보노이드 등 다량의 phytochemical을 함유하고 있으며, 주요 생리활성 성분중 하나인 caffeic acid는 항산화, 항염증, 항돌연변이 및 항암활성 등이 우수하다고 보고되고 있다(13, 27).
- 87 mg이 함유되어 있다고 보고하였다. Mate 에탄올 추출물의 추출조건에 대한 영향은 에탄올 농도와 추출온도 보다는 용매비에 크게 영향을 받고 있는 것으로 나타났다 (Table 5).
- pH가 낮을수록 아질산염 소거능이 증가하였으며, 시료에 대한 용매비와 추출온도의 영향은 뚜렷하게 나타나지 않았으나 에탄올 농도가 증가할수록 아질산염 소거능은 낮아짐을 알 수 있었다. pH에 따른 아질산염 소거능에 대한 주줄물의 회귀식을 Table 4에 나타내었다.
- 9205으로 5%이내에서 유의수준이 인정되었다. SOD 유사활성에 대한 반응표면은 Fig 1과 같으며 3050%의 에탄올 농도에서 용매비에 주로 영향을 받는 것으로 나타났다. 추출조건의 영향은 Table 5에서와 같이 시료에 대한 용매비와 추출온도에 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 에탄올 농도에 대한 영향은 미비하였다.
- 9502로 1%이내의 유의수준에서 인정되었는데, 시료에 대한 용매비가 낮을수록 에탄올 농도 40~50%에서 가장 높음을 확인하였다. 전자공여능에 대한 회귀식의 R2는 0.8842로 5%이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었으며, 에탄올 농도에 크게 영향을 받고 있는 것으로 나타났다 추출조건에 따른 아질산염 소거 능은 pH가 낮을수록 아질산염 소거 능이 증가하였으며, 시료에 대한 용매비 와 추출온도의 영 향은 뚜렷하게 나타나지 않았으나 에탄올 농도가 증가할수록 아질산염 소거능은 낮아짐을 알 수 있었다. SOD 유사활성은 에탄올 농도 및 추출온도에 따른 영향보다는 용매비에 많은 영향을 받음을 알 수 있었다.
- SOD 유사활성은 에탄올 농도 및 추출온도에 따른 영향보다는 용매비에 많은 영향을 받음을 알 수 있었다. 추출물의 특성 인 조건별 추출물의 수율, 총 폴리페놀함량, caffeic acid함량, 전자공여능에 대해 contour map을 superimposing하여 얻은 최적 주줄조건의 범위는 에탄올 농도 21 ~48%, 추출온도 76.4℃, 시료에 대한 용매비가 10~14 mL/g으로 예측되었다.
- 9502로 1%이내의 유의 수준에서 인정되었다(Table 4). 시료에 대한 용매비가 낮을수록 에탄올농도 40~50%에서 가장 높음을 확인하였다 (Fig. 1). Lee 등(28)은 품종별 들깻잎 열수주줄물의 caffeic acid함량 비 교에서 생물 100 g 기준으로 0.
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